一种包载卵黄免疫球蛋白的壳聚糖脂质体及其制备方法和用途
阅读说明：本技术 一种包载卵黄免疫球蛋白的壳聚糖脂质体及其制备方法和用途 (Chitosan liposome for encapsulating yolk immunoglobulin and preparation method and application thereof ) 是由 蔡朝霞 陈晨 盛龙 黄茜 李小萌 夏民权 柳聪 董宛宜 于 2021-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种包载卵黄免疫球蛋白的壳聚糖脂质体及其制备方法和用途,所述脂质体包含以下组份:卵磷脂、胆固醇、IGY以及壳聚糖；其中,所述脂质体以卵磷脂和胆固醇形成的磷脂双分子层为脂质体骨架材料,所述IGY包埋于所述脂质体的内水相,所述壳聚糖包覆于所述脂质体中磷脂双分子层的内层表面和外层表面,所述卵磷脂选自蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺中的一种。基于本发明的脂质体稳定性好且包封率高。(The invention relates to a chitosan liposome for encapsulating yolk immunoglobulin, a preparation method and application thereof, wherein the liposome comprises the following components of lecithin, cholesterol, IGY and chitosan; the liposome takes a phospholipid bilayer formed by lecithin and cholesterol as a liposome skeleton material, the IGY is embedded in an internal water phase of the liposome, the chitosan is coated on the surface of an inner layer and the surface of an outer layer of the phospholipid bilayer in the liposome, and the lecithin is selected from one of egg yolk lecithin, soybean lecithin, phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine. The liposome based on the invention has good stability and high entrapment rate.)
技术领域
本发明属于口服制品领域，具体涉及一种包载卵黄免疫球蛋白的壳聚糖脂质体及其制备方法和用途。
背景技术
IgY在食品工业上的应用是多种多样，主要包括功能性食品的开发、抑菌保鲜以及致病菌、功能成分的免疫快速检测等。大量研究表明，鸡蛋中的IgY是一种具有较强免疫功能的蛋白质，将其作为食品添加剂或直接作为抗体食品的原料制成功能食品，对于疾病的防治及调节和增强人体免疫力方面会起到不可估量的作用。IgY是一种蛋白质免疫活性物质，对肠道蛋白酶的消化是相当稳定的，在pH 4～9时，温度达65℃时仍保持稳定，在pH<4时，仅一部分IgY失活，抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶分解能力都较强，尽管它性质比一般的蛋白质稳定，但通过口服时，在低pH的胃酸环境和胃蛋白酶双重作用下短时间内会被降解失去大部分抗体活性，从而不能完成被动免疫保护。对IgY的封装采用物理、化学或组合工艺等方法进行包埋，使其不被胃蛋白酶分解，而提高在到达小肠时的免疫活性。
壳聚糖通常由几丁质的化学或酶促脱乙酰化产生，几丁质是节肢动物的表皮中存在的最丰富的天然聚合物之一，使得其价格非常低廉。壳聚糖可以作为一种渗透增强剂，调节肠道屏障，它能瞬间打开上皮细胞之间的紧密连接，同时只作用于粘膜表面，以便后期清除，因此，壳聚糖为有效口服递送提供了非常有前景的研究材料。
传统的脂质体制备技术有薄膜水化法、反向蒸发法等。薄膜水化法首先是使用圆底烧瓶蒸发有机溶剂与脂质混合物形成脂质薄膜，然后复水形成脂质体，若复水时剧烈摇晃，可形成大小分布不均的多层囊泡，而温和水化时则产生巨单室囊泡，若想产生均一的囊泡，则需后续操作，如探头超声、水浴超声或通过聚碳酸酯薄膜多次挤出，此方法缺点：亲水性材料包封率低，有机溶剂残留，后续操作的污染及对脂质体囊泡的损伤等；反向蒸发法先将脂质混合物加入烧瓶后蒸发得到脂质薄膜，再加入有机相(乙醇或异丙醚)溶解形成倒置胶束后，加入水相形成油包水的两相体系超声分散，最后在低压下蒸发有机溶剂形成脂质体悬浮液，此法具有较高的内部荷载，但蒸发后的脂质体悬浮液为粘性凝胶且有有机溶剂残留。
SCCO2在食品等工业中是优选的溶剂，因为它无毒，成本低，加工温度低，不易燃并且易于与提取的化合物分离，通过SCCO2辅助技术制备的脂质体可以解决常规脂质体微囊化中溶剂残留的问题。Otake等通过SCCO2技术制备得到壳聚糖包覆的L-R-二棕榈酰磷脂酰胆碱阳离子脂质体，在不使用酸或有机溶剂(包括乙醇)的情况下，将壳聚糖、脂质材料和含有葡萄糖的水相同时放入反应釜中，然后从超临界状态减压将混合物转化为脂质体。虽然制备得到了稳定的脂质体，但是制备的脂质体的最大包封率低仅为17％，包封率低，尽管存在无有机溶剂残留等优点，但综合考虑包封率、SCCO2对高压设备的要求,与传统方法相比，使用SCCO2技术制备脂质体的应用相对有限。
发明内容
本发明解决的技术问题为：提供一种包载卵黄免疫球蛋白的壳聚糖脂质体及其制备方法和用途，以解决传统的脂质体制备方法中尺寸分布广、包封率低、稳定性差、有机溶剂残留的问题。
本发明提供的具体解决方案包括如下：
本发明提供了一种包载卵黄免疫球蛋白的壳聚糖脂质体(IgY-CS-LP),所述脂质体包含以下组份:卵磷脂、胆固醇(CHOL)、卵黄免疫球蛋白(IGY)以及壳聚糖(CS)；其中,所述脂质体以卵磷脂和胆固醇形成的磷脂双分子层为脂质体骨架材料,所述IGY包埋于所述脂质体的内水相,所述壳聚糖包覆于所述脂质体中磷脂双分子层的内层表面和外层表面，所述卵磷脂选自蛋黄卵磷脂(EPC)、大豆卵磷脂(SPC)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺中的一种。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，所述卵磷脂、胆固醇、IGY以及壳聚糖的质量比为(18～22)：(4～6)：(1～1.5)：(18～22)。
进一步，所述卵磷脂为蛋黄卵磷脂。
基于本发明的包载卵黄免疫球蛋白的壳聚糖脂质体，具有如下有益效果：
(1)壳聚糖提高了脂质体IgY-CS-LP的膜稳定性和机械强度，对IgY结构具有较好的包埋效果，提了IgY的胃部稳定性，延缓IgY的释放，提高其到达小肠的抗体活性。基于本发明的包载IgY的壳聚糖脂质体，壳聚糖会存在脂质体内层和外层，由于静电相互作用脂质双层膜的内表面和外表面，双分子层内外层表面的壳聚糖对脂质体膜中的磷脂具有固定作用，可阻碍磷脂的横向运动，提升脂质膜的刚性和机械稳定性；壳聚糖的加入使得脂质体表面具有较高的电荷，提高脂质体的稳定性，且壳聚糖本身壳具有一定的粘性，降低脂质体的流动性，从而进一步增强脂质体的稳定性；壳聚糖的静电作用和增粘机制使得脂质体的具有物理稳定性，增强缓释效果。
本发明还提供了一种包载卵黄免疫球蛋白的壳聚糖脂质体制备方法，包括如下步骤：
S1、将卵磷脂和胆固醇分散在pH为7～8的缓冲液中得到悬浮液A，将IgY溶解于所述悬浮液A，然后再将壳聚糖溶液分散于所述悬浮液A得到悬浮液B；所述悬浮液B中卵磷脂的浓度为5～10mg/mL，壳聚糖的含量为0.5％～1.4％；
S2、将悬浮液B在温度在40～60℃下，加压至5～25MPa下，搅拌0.5～2h后，孵育5～20min，泄压得到包载卵黄免疫球蛋白的壳聚糖脂质体(IgY-CS-LP)悬浮液。
进一步，所述缓冲液为磷酸盐缓冲盐溶液，pH为7.2～7.6。
进一步，所述壳聚糖溶液由壳聚糖溶解于1％～2％的乙酸溶液中制备得到。
进一步，壳聚糖溶液分散于所述悬浮液A的过程如下：将壳聚糖溶液加入所述悬浮液A中，然后以1000～1500r/min连续搅拌0.5～2h，然后超声5～20min，制备得到悬浮液B。
进一步，S2中的泄压速率为0.2～2Mpa/min。
基于本发明的包载卵黄免疫球蛋白的壳聚糖脂质体的制备方法，具有如下有益效果：
(1)采用超临界CO2辅助法制备包载IgY的壳聚糖脂质体IgY-CS-LP，CO2具有无毒、不可燃、化学稳定、无残留，形成超临界条件温和，因此可作为不稳定性活性物质IGY脂质体的包封溶剂，不会造成有机溶剂残留。
(3)考虑到口服脂质体的脂质双层膜在胃肠道时可能泄漏的风险，通过添加壳聚糖涂层来加固脂质双层使IgY更多的释放在肠道环境，且壳聚糖具有pH响应，从而加强IgY在胃环境中的保护作用。
(3)SCCO2作为溶剂溶解磷脂使其均匀分散在体系中，释放压力后磷脂自发形成脂质双层，由于壳聚糖与脂质的静电相互作用，带正电的壳聚糖在脂质体形成过程中与带负电的磷脂极性头部相吸附，在脂质双层内外形成吸附层形成带正电荷的脂质体，提高了脂质体的机械稳定，最终得到的脂质体悬浮液中脂质体Zeta电位高于40mV,脂质体悬浮液稳定性高。
(4)磷脂、胆固醇和壳聚糖一锅法制备得到了高稳定性和高包封率的壳聚糖脂质体，工艺简单、生产效率高。在pH为7～8的缓冲液中，IGY溶解在缓冲液且表面带负电(-17.3mV左右)、壳聚糖溶液多以聚集体的形式存在，磷脂分子主要以双层或曲率片状形式存在于水性介质中，胆固醇聚集体随机掺入磷脂双层中；加压后，CO2迅速溶解在水相中，以CO2分子、HCO3-、和H2CO3形式存在，未水合的CO2分子将部分地留在磷脂双层的疏水性脂肪酰基链之间和胆固醇分子之间，导致双层膜的长度和厚度扩大，同时CO2的溶解会使缓冲液pH少许降低，增加壳聚糖聚集体的溶解度，溶解的壳聚糖离子与缓冲液中带负电荷的IGY以及磷脂双分子层表面分别存在静电作用；减压后，CO2分子将迅速从磷脂双层中释放出来，暂时将磷脂双层破坏成高度分散的磷脂，同样，胆固醇聚集体、壳聚糖聚集体也会分解形成高度分散的单体，这种强分散性将导致形成离散的磷脂、壳聚糖、胆固醇的瞬时IgY溶液，随着CO2的释放，水相中的pH值转变为原始状态，形成瞬时溶液；在形成瞬时溶液后，由于静电力和范德华力的作用，暂时分离的磷脂、壳聚糖和胆固醇将迅速重组，最终组装成脂质体IgY-CS-LP，IgY-CS-LP脂质体中，壳聚糖存在脂质体内层和外层，一方面，壳聚糖由于与磷脂的静电作用大量包裹于脂质体外层表面，壳聚糖在脂质体外表面诱导较大的自组装聚集体，形成壳聚糖涂层，另一方面，与IGY静电结合的壳聚糖随IGY溶液进入脂质体囊泡内，并随后逐渐吸附于脂质体内层表面，较高的壳聚糖浓度在脂质体表面诱导较大的自组装聚集体，形成一定厚度的粘结层，其中，壳聚糖吸附在磷脂双层的极性头部，形成具有高正电性的脂质体，双分子层内外层表面的壳聚糖对脂质体膜中的磷脂具有固定作用，显著增加脂质膜的刚性和机械稳定性，提高了脂质体的稳定性，从而获得的粒径均一、包封率高的脂质体。
本发明还提供如上所述的包载卵黄免疫球蛋白的壳聚糖脂质体的用途，将其用作抗体食品或者食品添加剂。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为不同磷脂制备的空白壳脂质体以及脂质体IgY-CS-LP的CLSM图。
图2为IgY、空白脂质体EPC-CS以及脂质体EPC-CS-IGY的Zeta电位图。
图3为不同壳聚糖浓度下制备的脂质体IgY-CS-LP随时间的沉降高度。
图4为不同壳聚糖浓度下制备的脂质体IgY-CS-LP的Zeta电位。
图5为不同壳聚糖浓度下制备的脂质体IgY-CS-LP的包封率。
图6是不同SCCO2压力下制备的脂质体IgY-CS-LP的DSC热分析图。
图7是不同SCCO2压力下制备的脂质体IgY-CS-LP的红外光谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下面结合附图以及具体的实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种包载卵黄免疫球蛋白的壳聚糖脂质体的制备方法，具体包含以下步骤：
(1)采用水稀释法与盐析法结合从蛋黄中提取IgY，冷冻干燥得到IgY纯品置于-20℃冰箱冷冻保存，备用。
(2)将蛋黄卵磷脂(EPC)和胆固醇分散在40ml pH＝7.4的PBS溶液中，缓慢加入10ml IgY溶液，最后加入到50ml壳聚糖溶液中，使用磁力搅拌器以1200r/min连续搅拌1h，壳聚糖吸附在磷脂双分子层表面，得到悬浮液B，悬浮液B中壳聚糖浓度为1.1％，EPC浓度为6.28mg/mL，磷脂、胆固醇和IgY的质量比为20:5:1.2；其中，壳聚糖溶液由壳聚糖加入50ml1.0％的乙酸中加热至50℃并先后搅拌1h、超声10min制备得到。
(3)将步骤(2)中100mL悬浮液B密封在高压反应釜中，使用水浴锅控制高压反应釜的温度为50℃，然后用CO2加压至10MPa，以200r/min搅拌1h后孵育10min，打开高压反应釜阀门快速泄压(0.5MPa/min)得到脂质体IgY-CS-LP悬浮液。
实施例2
(1)采用水稀释法与盐析法结合从蛋黄中提取IgY，冷冻干燥得到IgY纯品置于-20℃冰箱冷冻保存，备用。
(2)将大豆卵磷脂(SPC)和胆固醇分散在40ml pH＝7.4的PBS溶液中，缓慢加入10ml IgY溶液，最后加入到50ml壳聚糖溶液中，使用磁力搅拌器以1200r/min连续搅拌1h，壳聚糖吸附在磷脂双分子层表面得到悬浮液B，悬浮液B中壳聚糖浓度为1.1％，SPC浓度为6.28mg/mL，SPC、胆固醇和IgY质量比为20:5:1.2；其中，壳聚糖溶液由壳聚糖加入50ml1.0％的乙酸中加热至50℃并先后搅拌1h、超声10min制备得到。
(3)将步骤(2)中100ml悬浮液B密封在高压反应釜中，使用水浴锅控制高压反应釜的温度为50℃，然后用CO2加压至10MPa，以200r/min搅拌1h后孵育10min，打开高压反应釜阀门快速泄压(0.5MPa/min)得到脂质体IgY-CS-LP悬浮液。
实施例3
本实施例提供了一种包载卵黄免疫球蛋白的壳聚糖脂质体的制备方法，具体包含以下步骤：
(1)采用水稀释法与盐析法结合从蛋黄中提取IgY，冷冻干燥得到IgY纯品置于-20℃冰箱冷冻保存，备用。
(2)将磷脂酰胆碱和胆固醇分散在40ml pH＝7.6的PBS溶液中，缓慢加入10ml IgY溶液，最后加入到50ml壳聚糖溶液中，使用磁力搅拌器以1200r/min连续搅拌0.5h，壳聚糖吸附在磷脂双分子层表面得到悬浮液B，悬浮液B中壳聚糖浓度为1.4％，磷脂酰胆碱浓度为10mg/mL，磷脂酰胆碱、胆固醇和IgY的质量比为22：4:1；其中，壳聚糖溶液由壳聚糖加入50ml 1.0％的乙酸中加热至50℃并先后搅拌1h、超声10min制备得到。
(3)将步骤(2)中悬浮液B密封在高压反应釜中，使用水浴锅控制高压反应釜的温度为40℃，然后用CO2加压至5MPa，以100r/min搅拌1h后孵育20min，打开高压反应釜阀门快速泄压(0.5MPa/min)得到脂质体IgY-CS-LP悬浮液。
实施例4
本实施例提供了一种包载卵黄免疫球蛋白的壳聚糖脂质体的制备方法，具体包含以下步骤：
(1)采用水稀释法与盐析法结合从蛋黄中提取IgY，冷冻干燥得到IgY纯品置于-20℃冰箱冷冻保存，备用。
(2)将磷脂酰乙醇胺和胆固醇分散在40ml pH＝7.2的PBS溶液中，缓慢加入10mlIgY溶液，最后加入到50ml壳聚糖溶液中，使用磁力搅拌器以1200r/min连续搅拌2h，壳聚糖吸附在磷脂双分子层表面得到悬浮液B，悬浮液B中壳聚糖浓度为0.5％磷脂酰乙醇胺浓度为5mg/mL，磷脂酰乙醇胺、胆固醇和IgY的质量比为18:6:1.5；其中，壳聚糖溶液由壳聚糖加入50ml1.0％的乙酸中加热至50℃并先后搅拌1h、超声10min制备得到。
(3)将步骤(2)中悬浮液B密封在高压反应釜中，使用水浴锅控制高压反应釜的温度为60℃，然后用CO2加压至25MPa，以300r/min搅拌1h后孵育5min，打开高压反应釜阀门快速泄压(0.5MPa/min)得到脂质体IgY-CS-LP悬浮液。
对比例1
本对比例提供了一种包载IgY的壳聚糖脂质体，具体包含以下步骤：
(1)采用水稀释法与盐析法结合从蛋黄中提取IgY，冷冻干燥得到IgY纯品置于-20℃冰箱冷冻保存，备用。
(2)将蛋黄卵磷脂(EPC)和胆固醇分散在40ml pH＝7.4的PBS溶液中，缓慢加入10mlIgY溶液，使用磁力搅拌器以1200r/min连续搅拌1h得到悬浮液，悬浮液中EPC浓度为6.28mg/mL，磷脂、胆固醇和IgY的质量比为20:5:1.2。
(3)将步骤(2)中的悬浮液密封在高压反应釜中，使用水浴锅控制高压反应釜的温度为50℃，然后用CO2加压至20MPa，以200r/min搅拌1h后温育10min，打开阀门快速泄压(0.5MPa/min)得到脂质体悬浮液。
(4)最后加入到50ml壳聚糖溶液中，使用磁力搅拌器以1200r/min连续搅拌1h，混合液中壳聚糖浓度为1.1％；其中，壳聚糖溶液由壳聚糖加入50ml 1.0％的乙酸中加热至50℃搅拌1h并超声10min制备得到。
对比例2
在对比例提供一种基于薄膜分散法制备包载卵黄免疫球蛋白的壳聚糖脂质体的方法，具体包含以下步骤：
(1)采用水稀释法与盐析法结合从蛋黄中提取IgY，冷冻干燥得到IgY纯品置于-20℃冰箱冷冻保存，备用。
(2)以蛋黄卵磷脂(EPC)、胆固醇、IgY为原料，采用薄膜分散法制备脂质体，其中，蛋黄卵磷脂(EPC)、胆固醇、IgY的质量比为20:5:1.2，具体步骤如下：将磷脂、胆固醇溶于无水乙醇，待完全溶解后使用旋转蒸发仪在45℃下去除乙醇，加入溶有IgY的PBS溶液，超声1min方便水化，水化30min得到脂质体悬浮液。
对比例3
同实施例1，不同之处在于，用纯水替代PBS缓冲液。
测试方法：利用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定脂质体的粒径、粒径分布及Zeta电位；采用考马斯亮蓝法测定IgY含量确定包载率；采用差示扫描量热法(DSC)对脂质体的相转变温度进行测试；通过共聚焦激光扫描电镜(CLSM)对脂质体的微观形貌进行观察；采用傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)对原材料和脂质体进行结构特征测定。
对比例4：
同实施例1，不同之处在于，IgY浓度为0％。
对比例5
同实施例2，不同之处在于，IgY浓度为0％。
1、对实施例1-2以及对比例1-3制备的脂质体粒径、粒径分布、Zeta电位以及包封率进行测试，结果如表1所述，
表1实施例1-2以及对比例1-3制备的脂质体的测试数据表
(1)由表1可知，实施例1与对比例1对比相比，粒径从2659.32增加到3629，PDI由0.48到0.21，电位从29.83mV提高到44.63mV，包封率从58.87％增加到76.85％，说明先加入壳聚糖，再进行SCCO2处理，使壳聚糖更好的作用于脂质体的内层表面和外部表面，显著提高脂质体的稳定性，提高脂质体的包封率和Zeta电位；由实施例1和对比例2数据比对可知，薄膜分散法制备的脂质体的粒径显著小于SCCO2辅助制备的脂质体，脂质体均一性差、包封效果也显著低于SCCO2辅助制备的脂质体；由实施例1和对比例3相比，相比于PBS缓冲液，纯水条件下制备得到的脂质体的粒径更小，分散性相对较差，包封率较低，这是因为纯水条件下，加压后，二氧化碳迅速溶解在水相中，溶液的pH显著降低，使壳聚糖迅速大量溶解，形成高度分散的单体，在搅拌的过程中，相比于IGY(等电位点为5.5)，壳聚糖单体更倾向于吸附在磷脂双分子层表面，IGY溶液主体中壳聚糖的浓度较低，减压后CO2分子将迅速从磷脂双层中释放出来，由于静电力和范德华力的作用，高度分散的单体磷脂、壳聚糖和胆固醇将迅速重组，最终组装成IgY-CS-LP脂质体，相比于PBS缓冲液，随IGY溶液进入脂质体囊泡内的壳聚糖显著降低，导最终组装于内层表面壳聚糖浓度低，因此，相比于PBS缓冲液中制备的脂质体IgY-CS-LP，纯水中制备的脂质体囊状结构不稳定、质地不均，导致PDI大、包封率低。
(2)由表1中实施例1和实施例2数据可以看出，相比于以SPC为膜材制备的脂质体，以EPC为膜材制备的脂质体，具有较大的粒径，并且具有较好的分散性和均一性，EPC是更佳的IGY包封材料。如图1所示，分别为实施例1(EPC-CS)、实施例2(SPC-CS)、对比例4(EPC-CS-IGY)和对比例5(SPC-CS-IGY)制备的脂质体的共聚焦激光扫描电镜图，可以看出EPC为膜材制备的空白脂质体EPC-CS以及脂质体EPC-CS-IGY具有较大的粒径，并且具有较好的分散性和均一性，可能原因是EPC属于动物性卵磷脂主要为饱和磷脂，能形成紧密排列的磷脂膜结构，而SPC属于植物性卵磷脂大部分为不饱和磷脂，不能形成紧密排列结构，因此可能会使得脂质内磷脂层曲率较大形成更小的内水核从而使得粒径较小，EPC制备的脂质体的更大的粒径可能是其具有更高的包封率的原因之一。
(3)由表1可知，实施例1-2制备脂质体相变温度显著高于对比例1-3，脂质体的热稳定性更高。
2、对IgY、实施例1以及对比例4制备的脂质体分别进行Zeta电位测试，结果如图2所示，在PBS缓冲液中，IgY的Zeta电位为-17.3mV，空白壳脂质体与IgY-CS-LP脂质体之间的Zeta电位无明显差异，表明IgY主要是被包裹在脂质双层膜中，因此对脂质体的表面电荷影响较小。
3、探究壳聚糖的加入量对于IgY-CS-LP脂质体稳定性的影响
IgY-CS-LP脂质体的制备方法同实施例1，不同之处在于，分别控制壳聚糖的浓度分别为0％、0.5％、0.8％、1.1％、1.4％。
对制备得到的一系列IgY-CS-LP脂质体分别进行沉降速度测试、Zeta电位测试以及包封率测试，结果如图3-5所示。如图3，未添加壳聚糖的脂质体沉降速度最快，随着壳聚糖浓度的增加，沉降速度减慢，壳聚糖浓度为1.4％的脂质体沉降速度最慢，壳聚糖有利于脂质体溶液的稳定性；如图4所示，添加壳聚糖后的IgY脂质体Zeta电位显著增加，IgY-CS-LP表面电荷由负电荷转变为正电荷，从-8.54mV上升至44.63mV；包封率结果如图5所示。结果表明，在0.5％-1.4％范围内，壳聚糖兼具良好的稳定性、包封率以及稳定性。
4、探究不同SCCO2压力下制备的IgY-CS-LP脂质体的热稳定性和结构特性。
对IGY、EPC以及不同压力下制备的IgY-CS-LP脂质体的热稳定进行测试，结果如图6所示。IgY在5-25MPa压力下进行脂质体包封后其相转变温度较IgY(75.3℃)均有所升高，分别为114.7℃、120.7℃、138.9℃、126.7℃、100.5℃，说明脂质体的包封具有提高IgY热稳定性的作用，其中15MPa时具有最大的相转变温度为138.9℃，且峰形较窄，在该压力下制备的脂质体中的脂质堆积相对紧密，热稳定性最佳。
通过FT-IR探究不同SCCO2压力下IgY-CS-LP的结构特性，结果如图7示，为IgY、胆固醇(CHOL)、壳聚糖(CS)、EPC以及不同压力下制备的脂质体IgY-CS-LP的红外光谱图，IgY在3276cm-1处的强吸收峰代表N-H的伸缩振动，在1632cm-1、1529cm-1处的强吸收峰，是蛋白质在酰胺I、II带的特征峰，分别表示C＝O的伸缩振动和N-O的弯曲变形振动；EPC的特征区域有极性亲水头部区域、界面区域和非极性疏水尾部区域，其代表性基团分别为PO2 -、C＝O、CH2和CH3，其相对应的吸收峰分别为1241cm-1、1735cm-1、2921cm-1、2955cm-1；壳聚糖在3355cm-1左右有一个宽峰，是由O-H的伸缩振动和N-H的伸缩振动吸收峰重叠而成，2872cm-1处的吸收峰代表甲基或次甲基的C-H伸缩振动吸收峰；此外，还有1647cm-1、1590cm-1和1320cm-1三个特征吸收峰分别代表酰胺I、II、III带；悬浮液B在1559cm-1、1408cm-1处有强吸收峰，是蛋白质在酰胺II、III带的特征峰，分别代表C-H的弯曲振动和C-H的伸缩振动，这说明在悬浮液B中的蛋白质虽然发生了变化，但是其中的蛋白仍是未被包覆的状态；EPC在1241cm-1的吸收峰对应于卵磷脂磷酸基团，由于磷脂与壳聚糖之间的静电相互作用，形成悬浮液B后磷酸基团移位且明显减弱，加入壳聚糖后脂肪酸酯的羰基振动的1735cm-1吸收带明显减少，也表明壳聚糖与脂质之间存在强烈的相互作用；进行SCCO2处理后，可以发现5-25Mpa条件下的特征峰位置基本一致，具有壳聚糖和EPC的特征峰，在3250-3275cm-1有较宽的吸收峰，表明羟基形成了分子间氢键的缔合体；且蛋白质在酰胺I、II、III带的特征峰发生红移，且相较于悬浮液B明显减弱，可以说明本方法中悬浮液B经SCCO2处理水化后，IgY与其他组分除了简单的物理混合，IgY不全是以游离状态包封于脂质和壳聚糖形成的囊状结构中的，还形成了新的物相，这也是IGY具有较高包封率和稳定性的重要原因。
尽管上面已经详细描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种胶原蛋白肽组合物及其制备方法