阅读说明：本技术 一种l-异亮氨酸的生产工艺 (Production process of L-isoleucine ) 是由 包鑫 杨晓芳 刘元涛 李江雷 边恩来 张宗华 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于L-异亮氨酸生产技术领域,公开了一种L-异亮氨酸的生产工艺,其包括如下步骤：步骤1)发酵,步骤2)浓缩重溶,步骤3)一次脱色,步骤4)二次脱色,步骤5)除杂和结晶。本发明生产工艺简单可行,提高了L-异亮氨酸的产量和纯度。(The invention belongs to the technical field of L-isoleucine production, and discloses a production process of L-isoleucine, which comprises the following steps: step 1) fermentation, step 2) concentration and re-dissolution, step 3) primary decolorization, step 4) secondary decolorization, and step 5) impurity removal and crystallization. The production process is simple and feasible, and the yield and the purity of the L-isoleucine are improved.)

一种L-异亮氨酸的生产工艺

技术领域

本发明属于L-异亮氨酸生产技术领域，具体涉及一种L-异亮氨酸的生产工艺。

背景技术

L-异亮氨酸，又称异白氨酸，化学名L-2-氨基-3甲基戊酸，1901年，Fischer在由蛋白质水解液分离的L-亮氨酸组分中发现了旋光度较亮氨酸更大的物质，此为有关L-异亮氨酸的最早报道。L-异亮氨酸是生命有机体的重要组成部分，属于必需氨基酸，因为它特殊的结构和功能在人体生命代谢中占有重要作用。人体若长期缺乏L-异亮氨酸，将影响机体的生理功能，导致代谢紊乱、抵抗力下降等。L-异亮氨酸以其独特的功效，广泛应用于食品保健，生物医药以及医疗美容等行业。

我国异亮氨酸生产规模小，菌株产酸率低，发酵罐分批发酵水平在25g/L左右，提取率50%左右，生产工艺、生产水平和生产设备远远落后于日本等国，产量不能满足于市场需求。上个世纪末，L-异亮氨酸世界年产率在400t左右，而我国则大部分依赖进口。近年来，随着国内各生产厂家产量的增加，我国异亮氨酸的产量逐渐满足国内的需求，还有部分产品出口。国内氨基酸行业应该高度中重视生物化工技术的应用，尽快解决目前L-异亮氨酸发酵周期长，产酸率低和产品质量不高的问题，并开展异亮氨酸在新领域的应用研究，以促进我国L-异亮氨酸产业的发展。

L-异亮氨酸发酵过程中，色素主要来源有三种，（1）原料本身带有的（2）发酵过程中菌体代谢（3）发酵液与某些成分的反应。色素的存在不仅影响产品的外观，而且影响产品的纯度和成色，所以必须在制备过程中将色素出去。国内发酵液传统的脱色方法板框+活性炭脱色过滤，但这种过滤效果较差，而且活性炭用量较大成本较高。因此，开发新的脱色工艺尤为重要。

活性炭对大分子色素具有较强的吸附能力，是氨基酸发酵液常用的脱色剂，经活性炭脱色后，仍有大量色素及有机杂质，经过脱色膜技术可将该部分杂质及色素与产品分离，有效提高了产品质量。

发明内容

为解决上述问题，克服现有发酵工艺的不足之处，本发明提供了一种L-异亮氨酸的生产工艺，该生产工艺提高了发酵产酸率和产品质量。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的：

一种L-异亮氨酸的生产工艺，其包括如下步骤：步骤1）发酵，步骤2)浓缩重溶，步骤3)一次脱色，步骤4)二次脱色，步骤5)除杂和结晶。

进一步地，所述生产工艺包括如下步骤：

步骤1）发酵：将谷氨酸棒杆菌种子液按6-8%的接种量转入含有30L发酵培养基的50L发酵罐中培养，温度30℃，培养时间60小时，通过自动流加20%的氨水控制培养基pH为6.8-7.0，通过搅拌和通风控制溶氧在25%，流加葡萄糖营养液，控制发酵液中残糖含量不低于1g/L；

步骤2)浓缩重溶：将步骤1）所得发酵液经纳滤膜过滤，收集菌体蛋白和滤液，再将滤液进行蒸发浓缩，蒸发至原体积的五分之一，然后再添加与浓缩液体积相同的蒸馏水重溶，制得重溶液；

步骤3)一次脱色：将步骤2）所得的重溶液打入一次脱色罐，加入2-3%质量分数的活性炭，随后升温至70℃，调节料液pH值在6.0-6.5，脱色20-40分钟，然后过滤去除活性炭，收集滤液；

步骤4)二次脱色：将步骤3)所得滤液通过脱色膜，温度控制在20-25℃，收集脱色液；

步骤5)除杂和结晶：将步骤4)得到的脱色液经双效蒸发器浓缩3倍，然后再添加与浓缩液体积相同的蒸馏水重溶，制得重溶液；将重溶液通入模拟移动床色谱进行除杂，获得滤液；将滤液经过多效蒸发器浓缩3倍后，再次进入结晶罐结晶，将所得晶体经离心、干燥、包装后获得L-异亮氨酸精品。

进一步地，所述步骤1），发酵过程中，分别于40、42、44、46、48和50h注入0.2L的H₂O₂。

进一步地，所述步骤1），发酵过程中，于48h往发酵罐中添加壳聚糖，控制壳聚糖的浓度为20-40mg/L；

优选地，所述发酵培养基组分为：葡萄糖80g/L，(NH₄)₂SO₄ 20g/L，玉米浆10g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，V_B1 5mg/L，V_H 20μg/L。

优选地，所述葡萄糖营养液的组分：葡萄糖100-200g/L，α-羟丁酸10-30g/L。

优选地，所述葡萄糖营养液的组分：葡萄糖100g/L，α-羟丁酸20g/L。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明通过生物代谢调控途径和非生物代谢调控途径两方面进行改进，提高产酸效率，以进一步提高异亮氨酸的产量。

携氧剂（氧载体）一般指不溶于培养基但能够吸附或包裹、溶解氧的物质，通过在发酵液中引入一种新的液相（与发酵液互不相容），一减少气液传氧阻力，从而提高氧气的传质速率，这种液相一般具有比水更高的溶氧能力。本发明选用H₂O₂作为携氧剂具有下列优点：（1）H₂O₂与通气供氧相结合，适宜的H₂O₂添加浓度和添加方式可以提高发酵体系的细胞密度；（2）H₂O₂在过氧化氢酶的催化下分解释放出氧气，在反应不是非常剧烈的情况下，氧气直接以分子形式传给细胞，不会形成气-液传质阻力，提高了氧气的传质速率，氧气的传输如果完全消除气液传输阻力，将会极大的提高经济效益；（3）对剪切力敏感及非常粘稠的发酵体系，添加H₂O₂提供了一种提高供氧的方法；（4）供养还能改变菌体的代谢途径，促进菌体利用更为有效的代谢途径来合成产物；

本发明采用在发酵中后期，采用多次注入的方式添加携氧剂H₂O₂，较单次注入添加，在总添加量不变的前提下，异亮氨酸产量大幅提高，整个发酵过程H₂O₂分解没有其他有害物质生成，既保证了物料的卫生要求，同时保证了环保要求；后续提取工艺简洁、易操作，可连续性工业生产；

异亮氨酸发酵属于生长部分偶联型，前期并不会产生异亮氨酸，因此，发酵中后期才会产生异亮氨酸，发酵后期，随着产酸量的增加，苏氨酸和L-异亮氨酸之间存在反馈调节，在发酵后期添加α-羟丁酸，能够绕过苏氨酸和L-异亮氨酸的反馈调节，解除生物代谢调控作用，达到提升异亮氨酸的目的；

发酵中后期，添加适量壳聚糖，壳聚糖上的氨基与细菌细胞壁中带负电荷的磷壁酸或脂多糖结合，并螯合Mg2+、 Ca2+等阳离子,从而改变细胞壁的通透性，促进异亮氨酸分泌到胞外，从而提高异亮氨酸产量；

本发明采用活性炭和膜技术相结合的脱色工艺，减少了活性炭的用量，从而减少了活性炭洗脱过程中产生的废水量，而脱色膜等先进技术的利用，减少了二次脱色过程中活性炭的用量，减轻了环境污染，降低了生产成本，提高了产品色泽和纯度，有利于工业化，实现了利益的最大化和对环境污染的最小化。

附图说明：

图1：α-羟丁酸对L-异亮氨酸含量的影响；

图2：α-羟丁酸对菌体浓度的影响；

图3：壳聚糖对L-异亮氨酸产量的影响；

图4：壳聚糖对菌体浓度的影响。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种L-异亮氨酸的生产工艺，其包括如下步骤：

步骤1）发酵：采用谷氨酸棒杆菌ATCC14309为实验菌株，将谷氨酸棒杆菌种子液（OD₆₀₀值为12）按6%的接种量转入含有30L发酵培养基的50L发酵罐中培养，温度30℃，培养时间60小时，通过自动流加20%的氨水控制培养基pH为6.8-7.0，通过搅拌和通风控制溶氧在25%，流加葡萄糖营养液，控制发酵液中残糖含量不低于1g/L；

发酵过程中，分别于40、42、44、46、48和50h注入0.2L的H₂O₂；于48h时，往发酵罐中添加壳聚糖，控制壳聚糖的浓度为40mg/L；

所述发酵培养基组分为：葡萄糖80g/L，(NH₄)₂SO₄ 20g/L，玉米浆10g/L， KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，V_B1 5mg/L，V_H 20μg/L；所述葡萄糖营养液的组分：葡萄糖100g/L，α-羟丁酸20g/L；

步骤2)浓缩重溶：将步骤1）所得发酵液经纳滤膜过滤，收集菌体蛋白和滤液，再将滤液进行蒸发浓缩，蒸发至原体积的五分之一，然后再添加与浓缩液体积相同的蒸馏水重溶，制得重溶液；

步骤3)一次脱色：将步骤2）所得的重溶液打入一次脱色罐，加入3%质量分数的活性炭，随后升温至70℃，调节料液PH值在6.0左右，脱色30分钟，然后过滤去除活性炭，收集滤液；

步骤4)二次脱色：将步骤3)所得滤液通过脱色膜（平均通量为18kg/（m².h）），温度控制在24℃，收集脱色液；

步骤5)除杂和结晶：将步骤4)得到的脱色液经双效蒸发器浓缩3倍，然后再添加与浓缩液体积相同的蒸馏水重溶，制得重溶液；将重溶液通入模拟移动床色谱进行除杂，获得滤液；将滤液经过多效蒸发器浓缩3倍后，再次进入结晶罐结晶，将所得晶体经离心、干燥、包装后获得L-异亮氨酸精品，经HPLC检测，纯度为99.6％，外观洁白透亮，品质优异，达到医药级产品的要求。

实施例2

一种L-异亮氨酸的生产工艺，其包括如下步骤：

步骤1）发酵：采用谷氨酸棒杆菌ATCC14309为实验菌株，将谷氨酸棒杆菌种子液（OD₆₀₀值为11）按7%的接种量转入含有30L发酵培养基的50L发酵罐中培养，温度30℃，培养时间60小时，通过自动流加20%的氨水控制培养基pH为6.8-7.0，通过搅拌和通风控制溶氧在20%，流加葡萄糖营养液，控制发酵液中残糖含量不低于1g/L；

发酵过程中，分别于40、42、44、46、48和50h注入0.15L的H₂O₂；于48h时，往发酵罐中添加壳聚糖，控制壳聚糖的浓度为40mg/L；

所述发酵培养基组分为：葡萄糖80g/L，(NH₄)₂SO₄ 20g/L，玉米浆10g/L， KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，V_B1 5mg/L，V_H 20μg/L；所述葡萄糖营养液的组分：葡萄糖150g/L，α-羟丁酸15g/L；

步骤2)浓缩重溶：将步骤1）所得发酵液经纳滤膜过滤，收集菌体蛋白和滤液，再将滤液进行蒸发浓缩，蒸发至原体积的五分之一，然后再添加与浓缩液体积相同的蒸馏水重溶，制得重溶液；

步骤3)一次脱色：将步骤2）所得的重溶液打入一次脱色罐，加入2%质量分数的活性炭，随后升温至70℃，调节料液PH值在6.0左右，脱色40分钟，然后过滤去除活性炭，收集滤液；

步骤4)二次脱色：将步骤3)所得滤液通过脱色膜，温度控制在22℃，收集脱色液；

步骤5)除杂和结晶：将步骤4)得到的脱色液经双效蒸发器浓缩3倍，然后再添加与浓缩液体积相同的蒸馏水重溶，制得重溶液。将重溶液通入模拟移动床色谱进行除杂，获得滤液；将滤液经过多效蒸发器浓缩3倍后，再次进入结晶罐结晶，将所得晶体经离心、干燥、包装后获得L-异亮氨酸精品，经HPLC检测，纯度为99.5％，外观洁白透亮，品质优异，达到医药级产品的要求。

对比例1

一种提高L-异亮氨酸产量的方法，其包括如下步骤：

采用谷氨酸棒杆菌ATCC14309为实验菌株，将谷氨酸棒杆菌种子液（OD₆₀₀值为12）按6%的接种量转入含有30L发酵培养基的50L发酵罐中培养，温度30℃，培养时间60小时得到发酵液，通过自动流加20%的氨水控制培养基pH为6.8-7.0，通过搅拌和通风控制溶氧在25%，流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液，控制发酵液中残糖含量不低于1g/L；

所述发酵培养基组分为：葡萄糖80g/L，(NH₄)₂SO₄ 20g/L，玉米浆10g/L， KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，V_B1 5mg/L，V_H 20μg/L。

对比例2

一种提高L-异亮氨酸产量的方法，其包括如下步骤：

采用谷氨酸棒杆菌ATCC14309为实验菌株，将谷氨酸棒杆菌种子液（OD₆₀₀值为12）按6%的接种量转入含有30L发酵培养基的50L发酵罐中培养，温度30℃，培养时间60小时得到发酵液，通过自动流加20%的氨水控制培养基pH为6.8-7.0，通过搅拌和通风控制溶氧在25%，流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液，控制发酵液中残糖含量不低于1g/L；

发酵过程中，于40h注入1.2L的H₂O₂；

所述发酵培养基组分为：葡萄糖80g/L，(NH₄)₂SO₄ 20g/L，玉米浆10g/L， KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，V_B1 5mg/L，V_H 20μg/L。

对比例3

一种提高L-异亮氨酸产量的方法，其包括如下步骤：

采用谷氨酸棒杆菌ATCC14309为实验菌株，将谷氨酸棒杆菌种子液（OD₆₀₀值为12）按6%的接种量转入含有30L发酵培养基的50L发酵罐中培养，温度30℃，培养时间60小时得到发酵液，通过自动流加20%的氨水控制培养基pH为6.8-7.0，通过搅拌和通风控制溶氧在25%，流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液，控制发酵液中残糖含量不低于1g/L；

发酵过程中，分别于40、42、44、46、48和50h注入0.2L的H₂O₂；

所述发酵培养基组分为：葡萄糖80g/L，(NH₄)₂SO₄ 20g/L，玉米浆10g/L， KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，V_B1 5mg/L，V_H 20μg/L。

实施例3

1、H₂O₂添加量和添加时机对发酵液中L-异亮氨酸产量和菌体生物量的影响。

检测了菌体浓度（以OD_600nm来衡量）和发酵液中L-异亮氨酸含量，具体结果见表1：

表1

组别	菌体浓度OD<sub>600nm</sub>	L-异亮氨酸含量g/L
			对比例1	43.8	28.2
对比例2	45.1	29.7
			对比例3	50.6	31.4

结论：与不添加H₂O₂的对比例1相比较，对比例2和对比例3在菌体生物量和异亮氨酸产量两个指标均有所提高，但是对比例2提高幅度较少，异亮氨酸产量增加5.3%，对比例3增幅明显，增加了11.1%；发酵中后期分多次注入H₂O₂，较单次注入，在总添加量不变的前提下，异亮氨酸产量大幅提高，可能原因是，单次注入导致浓度过大，对菌株造成损害。

2、发酵过程中，分别于40、42、44、46、48和50h注入0.2L的H₂O₂；在此基础上，验证α-羟丁酸对发酵产酸的影响。在葡萄糖营养液添加α-羟丁酸组分，设置浓度为0,5,10,15,20,25,30，单位为g/L，如图1-2所示，随着α-羟丁酸浓度的增加，菌体浓度没有显著变化，但是异亮氨酸产量逐步提高，达到20g/L时，接近峰值，继续增加α-羟丁酸的浓度，对异亮氨酸的影响并不大，可能α-羟丁酸对异亮氨酸合成的影响达到饱和，综合成本来考虑，选择15-20g/L的添加量最为合适。

选择在发酵起始阶段发酵培养基中添加α-羟丁酸组分对异亮氨酸产量并没有明显影响（数据未显示），可能发酵初期，并不会产生异亮氨酸或者产量较低，而且生物代谢调控途径并不会产生反馈抑制。

3、选择葡萄糖营养液添加α-羟丁酸组分20g/L，研究壳聚糖添加量对菌体浓度和异亮氨酸产量的影响。如图3-4所示，设置壳聚糖的添加量为0,5,10,20,4 0,80,160，单位mg/L。如图3-4所示，随着壳聚糖添加量的增加，菌体浓度没有明显变化，L-异亮氨酸产量逐步提高，当添加量达到40g/L时，L-异亮氨酸产量最大，继续增加壳聚糖的添加量，菌体浓度和L-异亮氨酸产均有所下滑。

发酵中后期，添加一定量的壳聚糖，壳聚糖上的氨基与细菌细胞壁中带负电荷的磷壁酸或脂多糖结合，并螯合Mg2+、 Ca2+等阳离子,从而改变细胞壁的通透性，促进异亮氨酸分泌到胞外，从而提高异亮氨酸产量；但是壳聚糖浓度过大时，会对菌株造成一定的损伤，菌株增殖受阻并且发生死亡。

发酵前期添加壳聚糖对异亮氨酸产量并没有明显影响（数据未显示），可能发酵初期，并不会产生异亮氨酸或者产量较低，改变菌体细胞壁通透性对异亮氨酸产量没有实际意义。

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了介绍，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，这对本领域技术人员而言应该很明确，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明保护的范围。