阅读说明：本技术 一种高效利用淀粉生产l-亮氨酸的方法 (Method for producing L-leucine by efficiently utilizing starch ) 是由 徐建中 史可 王颖妤 章洁颖 郝宇晨 *** 于 2019-10-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高效利用淀粉生产L-亮氨酸的方法,属于生物催化技术领域。本发明通过对棒杆菌属的L-亮氨酸产生菌进行温度诱导的适应性进化处理,提高菌株对高温的耐受性。随后,在此突变菌株基础上异源表达来源于芽孢杆菌属微生物(如B.amyloliquefaciens)中α-淀粉酶编码基因,在棒杆菌属的L-亮氨酸产生菌中构建了可高效利用淀粉的代谢途径,从而改善了最适菌体生长温度与α-淀粉酶最适作用温度不一致的的缺点,获得了高效利用淀粉生产L-亮氨酸的重组谷氨酸棒杆菌。(The invention discloses a method for producing L-leucine by efficiently utilizing starch, belonging to the technical field of biocatalysis. The invention improves the high-temperature resistance of the strain by carrying out temperature-induced adaptive evolution treatment on the L-leucine producing strain of the corynebacterium. Then, on the basis of the mutant strain, an alpha-amylase coding gene derived from a bacillus microorganism (such as B. amyloliquefaciens) is expressed in a heterologous manner, and a metabolic pathway capable of efficiently utilizing starch is constructed in an L-leucine producing strain of corynebacterium, so that the defect that the optimal growth temperature of the strain is inconsistent with the optimal action temperature of the alpha-amylase is overcome, and the recombinant corynebacterium glutamicum for efficiently utilizing the starch to produce the L-leucine is obtained.)

一种高效利用淀粉生产L-亮氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种高效利用淀粉生产L-亮氨酸的方法，属于生物催化技术领域。

背景技术

L-亮氨酸是人和动物所需的八种必需氨基酸之一，因与L-缬氨酸和L-异亮氨酸同具有甲基侧链分支结构而统称为支链氨基酸。L-亮氨酸具有多种生理功能，广泛应用于食品工业，饲料工业和制药等工业。同时，L-亮氨酸在氨基酸静脉输液等方面的用量日益增长，是应用于临床氨基酸复合输液中不可缺少的原料之一，对维持病危病人的营养需求，抢救患者生命起着积极的作用。谷氨酸棒状杆菌是目前微生物发酵生产L-亮氨酸的主要工业菌株。然而，由于L-亮氨酸的合成途径长、反馈调控机制严格，所以其生产菌株的产量和转化率仍然较低，现阶段其产量已经无法满足日益增长的市场需求。因此，迫切需要研发构建以廉价底物为原料高效合成L-亮氨酸高产菌株。

目前，国内外选育L-亮氨酸高产菌株的方法主要包括传统的物理-化学诱变、代谢工程调控、细胞重组技术以及基因工程技术等。选育L-亮氨酸高产菌株的主要思路有：①解除三种支链氨基酸对生物合成途径上的乙酰羟酸合成酶(AHAS)、乙酰羟酸异构还原酶(AHAIR)、二羟酸脱水酶(DHAD)等3个共用酶的协同反馈阻遏作用；②解除L-缬氨酸对AHAS的反馈抑制作用；③解除L-亮氨酸对α-异丙基苹果酸合成酶(IPMS)的反馈抑制和阻遏作用，如选育L-亮氨酸和L-缬氨酸结构类似物抗性标记的突变株；④改变菌体的正常代谢，使像氨基酸这类的代谢产物大量的积累，如选育某些药物类(如磺胺胍)或抗生素类(如利福平)抗性标记的突变株。虽然上述方法取得利率一定的成果，但是目前用于发酵生产L-亮氨酸的碳源全都采用葡萄糖。由于目前用于工业化生产L-亮氨酸的菌株其产量和转化率仍然较低，所以生长成本一直居高不下。如何采用廉价底物为唯一或主要原料生产L-亮氨酸，成为国内外氨基酸生产企业和氨基酸产生菌育种专家亟待需要解决的问题。

众所周知，棒杆菌属的微生物只能利用少数几种糖类如葡萄糖、蔗糖、果糖和麦芽糖作为碳源用于菌体生长和合成某些代谢产物，其中葡萄糖是棒杆菌属的微生物偏好利用的碳源。对于大多数棒杆菌属的微生物来说，它们无法利用淀粉、纤维素等多糖，其原因是它们细胞内不存在分解利用这些多糖的酶。目前，虽有报道通过在谷氨酸棒杆菌中异源表达来自链霉菌属或链球菌属微生物中的α-淀粉酶可以实现以淀粉为唯一碳源合成氨基酸(如L-赖氨酸)，但产量无法与以葡萄糖为主要碳源相比，无法实现工业化应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种高效利用淀粉生产L-亮氨酸的方法，通过对棒杆菌属的L-亮氨酸产生菌进行温度诱导的适应性进化处理，提高菌株对高温的耐受性。随后，在此突变菌株基础上异源表达来源于芽孢杆菌属微生物中α-淀粉酶编码基因，在棒杆菌属的L-亮氨酸产生菌中构建了可高效利用淀粉的代谢途径，从而改善了最适菌体生长温度与α-淀粉酶最适作用温度不一致的的缺点，获得了高效利用淀粉生产L-亮氨酸的重组谷氨酸棒杆菌。

本发明的第一个目的是提供一种高效利用淀粉生产L-亮氨酸的方法，包括如下步骤：

(1)将出发棒杆菌接种于LBG液体培养基中，在最适温度下进行培养，测定出发棒杆菌在最适生长温度下的比生长速率χ₀，即μ＝χ₀；

(2)将步骤(1)中生长至对数生长中后期的出发棒杆菌接种至新鲜LBG液体培养基中，并在34-36℃进行培养，测定菌株在34-36℃下的比生长速率μ＝χ₁；进一步将上述生长至对数生长中后期的菌株接种至新鲜LBG液体培养基中，并在34-36℃进行培养，测定菌株在34-36℃下的比生长速率μ＝χ₂；重复上述步骤，直至菌株在34-36℃下比生长速率μ≈χ₀，得到在34-36℃下正常生长的突变菌株；

(3)采用步骤(2)相同方法，以步骤(2)得到的在34-36℃下正常生长的突变菌株为出发菌株，诱导在39-41℃下正常生长的突变菌株；

(4)采用步骤(2)相同方法，以步骤(3)得到的在39-41℃下正常生长的突变菌株为出发菌株，诱导在44-46℃下正常生长的突变菌株；

(5)以步骤(4)得到的在44-46℃下正常生长的突变菌株为宿主菌，异源表达α-淀粉酶基因，得到能够表达α-淀粉酶的重组菌；

(6)以淀粉作为唯一碳源，利用步骤(5)得到的重组菌发酵生产L-亮氨酸。

进一步地，所述的棒杆菌为谷氨酸棒杆菌。

进一步地，在步骤(1)中，所述的培养是在28-32℃，100-150r/min转速下培养。

进一步地，在步骤(2)中，所述的培养是在100-150r/min转速下培养。

进一步地，在步骤(5)中，所述的α-淀粉酶基因来源于解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。优选来源于B.amyloliquefaciens。

进一步地，在步骤(6)中，所述的发酵的具体步骤为：将重组菌单菌落接种至LBG培养基中培养至对数期，将种子培养液转接至改良发酵培养基进行发酵生产L-亮氨酸。

进一步地，所述的改良发酵培养基为：可溶性淀粉40-50g/L，(NH₄)₂SO₄10-20g/L，CH₃COONH₄ 10-20g/L，KH₂PO₄ 2-4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-1.5g/L，MnSO₄·4H₂O 0.05-0.15g/L，柠檬酸钠2-4g/L，尿素2-5g/L，L-蛋氨酸0.5-1.5g/L，L-谷氨酸0.5-1.5g/L，L-异亮氨酸0.05-0.15g/L，盐酸盐甜菜碱1-2g/L，生物素0.0003-0.0008g/L，硫胺素0.0005-0.0010g/L，CaCO₃30-50g/L。

进一步地，种子培养阶段的培养条件为：培养温度为44-46℃，转速为100-150r/min，培养时间为10-14h。

进一步地，将种子培养液转接至发酵培养基的接种量为5-15％。

进一步地，发酵阶段的培养条件为：培养温度为44-46℃，转速为100-150r/min，培养时间为60-80h。

本发明的作用原理：在利用淀粉作为唯一碳源，发酵生产L-亮氨酸的过程中，淀粉需要分解成可发酵性糖如单糖或双糖，才能被有效利用。α-淀粉酶在采用酶法水解淀粉中发挥重要作用。根据最适作用温度不同，α-淀粉酶可以分为中温淀粉酶和高温淀粉酶，其中前者最适作用温度是50～70℃，后者最适作用温度是>90℃。然而，对于大多数棒杆菌属的微生物来说，它们的最适生长温度为25～37℃，由于酶的最适作用温度与菌体生长的最适温度不一致导致不能有效利用淀粉合成L-亮氨酸。本发明利用温度诱导适应性进化的方法，得到生长最适温度与酶的最适温度比较接近的菌株，并构建淀粉代谢途径，利用其以淀粉作为唯一碳源，发酵生产L-亮氨酸。

本发明的有益效果是：

本发明通过对棒杆菌属的L-亮氨酸产生菌进行温度诱导的适应性进化处理，提高菌株对高温的耐受性。随后，在此突变菌株基础上异源表达来源于芽孢杆菌属微生物(如B.amyloliquefaciens)中α-淀粉酶编码基因，在棒杆菌属的L-亮氨酸产生菌中构建了可高效利用淀粉的代谢途径，从而改善了最适菌体生长温度与α-淀粉酶最适作用温度不一致的的缺点，获得了高效利用淀粉生产L-亮氨酸的重组谷氨酸棒杆菌。

附图说明

图1为由淀粉合成L-亮氨酸及其它两种支链氨基酸代谢途径及其关键酶基因；

图2为出发菌株XQ在不同温度下的生长速度和L-亮氨酸产量；

图3为每个循环温度下比生长速率的变化；

图4为35℃、40℃和45℃下最佳产L-亮氨酸菌株的筛选；

图5为重组菌L45-52/pEC-XK99E-amy在45℃下菌体生长和L-亮氨酸。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

产物的定性与定量分析以及菌体生长情况的监测：亮氨酸产物实时监测采用氨基酸测定仪测定。菌液浓度测定：吸取样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照，采用分光光度计于1cm光程测定OD_600nm。

LBG培养基为：5g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L。

葡萄糖发酵培养基：葡萄糖80-120g/L，玉米浆20-30g/L，(NH₄)₂SO₄ 10-20g/L，CH₃COONH₄ 10-20g/L，KH₂PO₄ 2-4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-1.5g/L，MnSO₄·4H₂O 0.05-0.15g/L，柠檬酸钠2-4g/L，尿素2-5g/L，L-蛋氨酸0.5-1.5g/L，L-谷氨酸0.5-1.5g/L，L-异亮氨酸0.05-0.15g/L，盐酸盐甜菜碱1-2g/L，生物素0.0003-0.0008g/L，硫胺素0.0005-0.0010g/L，CaCO₃ 30-50g/L。

改良发酵培养基：可溶性淀粉40-50g/L，(NH₄)₂SO₄ 10-20g/L，CH₃COONH₄10-20g/L，KH₂PO₄ 2-4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-1.5g/L，MnSO₄·4H₂O 0.05-0.15g/L，柠檬酸钠2-4g/L，尿素2-5g/L，L-蛋氨酸0.5-1.5g/L，L-谷氨酸0.5-1.5g/L，L-异亮氨酸0.05-0.15g/L，盐酸盐甜菜碱1-2g/L，生物素0.0003-0.0008g/L，硫胺素0.0005-0.0010g/L，CaCO₃30-50g/L。

本申请以最适生长温度为30℃的L-亮氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌为例，说明本技术方案的可行性。

实施例1：出发菌株XQ在不同温度下的生长速度和L-亮氨酸产量

将出发菌株XQ接种于发酵培养基中，并分别在30℃、35℃、40℃、45℃和50℃下120r/min摇瓶培养72h，并定时取样测定不同培养温度下OD₆₀₀和L-亮氨酸的产量。结果分别如图2所示。

实施例2：适应性进化手段逐级驯化出发菌株XQ的温度耐受性

驯化操作流程以及每个循环温度下比生长速率的变化如图3所示，具体包括：首先，将出发菌株XQ接种于LBG液体培养基中并于30℃下120r/min摇瓶培养，测定出发菌株XQ在30℃下比生长速率μ＝χ₀。其次，吸取1％的在30℃下摇瓶培养至对数生长中后期的出发菌株XQ培养液于一装有新鲜LBG液体培养基的三角瓶中，并于35℃下120r/min摇瓶培养，测定菌株XQ在35℃下比生长速率μ＝χ₁。随后，吸取1％的在35℃下摇瓶培养至对数生长中后期的出发菌株XQ培养液于一装有新鲜LBG液体培养基的三角瓶中于35℃下120r/min摇瓶培养并测定菌株XQ在35℃下比生长速率μ＝χ₂，重复上述步骤，直至菌株在35℃下比生长速率μ≈χ₀。最后，采用相同的步骤分别选育耐受40℃、45℃和50℃的突变菌株。

实施例3：不同温度下最佳目的菌株的筛选

以筛选35℃下最佳目的菌株为例。

当菌株在35℃下比生长速率μ≈χ₀时，吸取适量的处于对数生长中期的菌液倍比稀释后涂布于LBG固体培养板上并于35℃下恒温培养至长出单菌落。随机挑选出在LBG平板上菌落较大的单菌落，接种于葡萄糖发酵培养基中，并于35℃下120r/min摇瓶培养72，测定不同突变株L-亮氨酸的产量。通过筛选，最终获得在35℃下L-亮氨酸产量最高的突变株L35-39。随后，以突变株L35-39为出发菌株，继续筛选在40℃和45℃下高产L-亮氨酸的突变株L40-27和L45-52。35℃、40℃和45℃下最佳产L-亮氨酸菌株的筛选的过程如图4所示。由于在50℃培养条件下，突变株的比生长速率都无法达到菌株XQ在30℃下比生长速率，故没有筛选在50℃下能高产L-亮氨酸的突变株。

实施例4：突变菌株L45-52遗传稳定性的测定

将出发菌株XQ和突变菌株L45-52分别接种于葡萄糖发酵培养基中，并连续传代20次，分别测定第5代、第10代和第20代出发菌株XQ和突变菌株L45-52的比生长速率和L-亮氨酸产量。其中出发菌株XQ培养温度为30℃，而突变菌株L45-52培养温度为45℃。

表1为突变菌株和出发菌株比生长速率和L-亮氨酸产量，从表中可以看出，突变菌株与出发菌株类似，都具有良好的遗传稳定性。

表1.突变菌株和出发菌株遗传稳定性分析

实施例5：重组菌L45-52/pEC-XK99E-amy的构建

以B.amyloliquefaciens Y-2基因组为模板，分别以amy-F和amy-R为引物(表2)，进行PCR扩增α-淀粉酶编码基因amy，获得带有限制性内切酶的PCR产物。将以上述PCR产物与线性化表达质粒pEC-XK99E相连构建重组质粒pEC-XK99E-amy。

将上述验证正确的质粒pEC-XK99E-amy电击转化C.gluatmicumL45-52，45℃培养条件下经LBG+Km固体培养基培养，筛选获得重组转化子。提取转化子基因组，以目标基因amy的验证引物amy-F和amy-R进行PCR产物测序鉴定。最终获得目的重组菌株C.gluatmicumL45-52/pEC-XK99E-amy。

表2.PCR扩增所需引物序列

注：下划线为酶切位点；加粗字体为谷氨酸棒杆菌SD识别序列。

实施例6：重组菌C.gluatmicumL45-52/pEC-XK99E-amy中的α-淀粉酶活力测定

取冷冻管保藏的菌种接种LBG液体培养基中，45℃振荡培养过夜，并于10000r/min离心收集菌体。随后，将菌体悬浮于100mmol/L的Glycine-NaOH(pH9.5)缓冲液中并超声波破碎制备粗酶液。α-淀粉酶酶活测定采用试剂盒，具体步骤参考试剂盒说明书进行。经测定，重组菌具有α-淀粉酶活力，而出发菌株不具有α-淀粉酶活力，结果如表3所示。

表3.不同菌株的α-淀粉酶的活力分析

注：“-”表示未检测到。

实施例7：重组菌C.gluatmicumL45-52/pEC-XK99E-amy在45℃下以可溶性淀粉为唯一碳源时菌体生长和L-亮氨酸产量

将重组菌C.gluatmicumL45-52/pEC-XK99E-amy接种于改良发酵培养基中，并在45℃下120r/min摇瓶培养72h，并每隔4h取样测定OD₆₀₀以及L-亮氨酸产量，结果如图5所示。

重组菌经摇瓶发酵实验，L-亮氨酸积累量达5.6g/L，最大比生成速率为0.11g/L/h。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种高效利用淀粉生产L-亮氨酸的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

gctctagaga aaggagatat accatgtttg caaaacgatt c 41

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

cccaagcttt caatggggaa gagaaccgc 29