阅读说明：本技术 一种发酵生产l-亮氨酸的方法 (method for producing L-leucine by fermentation ) 是由 冯世红 包鑫 史静东 韦树高 边恩来 于 2019-10-06 设计创作，主要内容包括：本发明属于L-亮氨酸生产工艺领域,公开了一种发酵生产L-亮氨酸的方法,其包括如下步骤：采用产L-亮氨酸的黄色短杆菌发酵44h以上；当发酵至30h时,往发酵罐中流加醋酸钠水溶液,控制发酵液中醋酸钠的浓度为0.1-1g/L,直至发酵结束,所述醋酸钠水溶液的浓度为50-100g/L；当发酵至30h时,往发酵罐中流加丙二酸水溶液,控制发酵液中丙二酸的浓度为0.1-0.5 ml/L,直至发酵结束；所述丙二酸水溶液的浓度为10-20%；当发酵至40h时,往发酵罐中添加壳聚糖,控制发酵液中壳聚糖的浓度为20-80mg/L。本发明方法发酵效率高,操作简单,成本低廉。(The invention belongs to the field of L-leucine production process, and discloses a method for producing L-leucine by fermentation, which comprises the following steps: fermenting for more than 44h by using Brevibacterium flavum for producing L-leucine; when the fermentation is carried out for 30 hours, adding a sodium acetate aqueous solution into the fermentation tank, and controlling the concentration of sodium acetate in the fermentation liquor to be 0.1-1g/L until the fermentation is finished, wherein the concentration of the sodium acetate aqueous solution is 50-100 g/L; when the fermentation time is 30 hours, adding a malonic acid aqueous solution into the fermentation tank, and controlling the concentration of malonic acid in the fermentation liquid to be 0.1-0.5 ml/L until the fermentation is finished; the concentration of the malonic acid aqueous solution is 10-20%; when the fermentation time is up to 40h, adding chitosan into the fermentation tank, and controlling the concentration of the chitosan in the fermentation liquor to be 20-80 mg/L. The method has the advantages of high fermentation efficiency, simple operation and low cost.)

一种发酵生产L-亮氨酸的方法

技术领域

本发明属于L-亮氨酸生产工艺领域，具体提供一种发酵生产L-亮氨酸的方法。

背景技术

L-亮氨酸又称白氨酸，化学名为α-氨基异己酸，分子式为C₆H₁₃O₂N，相对分子量131.18，是一种非极性氨基酸，味微苦，溶于水，等电点5.98，在医药、食品、调味剂、动物饲料及化妆品的制造等许多行业中有着广泛的应用。我国对于L-亮氨酸的研究起步相对较晚，部分企业发酵法生产L-亮氨酸水平较低，而且对下游预处理及提取工艺的研究相对较少，很难实现工业化生产，并且存在酸碱消耗高、污染严重以及现产品收率和纯度低等问题。

目前，L-亮氨酸生产方法主要是发酵法，发酵法生产的L-亮氨酸发酵液经过提取、蒸发浓缩、离心烘干等步骤才能制成成品。申请人之前的专利技术“一种生产L-亮氨酸的发酵工艺”，通过在发酵中后期流加复合氨基酸溶液和营养液来提高亮氨酸的产量，但是上述流加液的成本较高，不适合规模化生产。申请人之前的专利技术“一种提高L-亮氨酸发酵产量的方法”，采用膜偶联间歇透析发酵，有效降低了副产物的浓度，提高了糖酸转化率，通过在发酵中期补充含有甘油和甜菜碱的营养液，能够促进发酵液中L-亮氨酸产量和糖酸转化率；但是，该方法存在工序繁琐的缺陷。提供一种成本低廉、操作简易、可持续性发展的亮氨酸发酵工艺是我们需要解决的技术问题。

为解决L-亮氨酸在工业发酵生产中的共性问题，本发明提供了一种发酵生产L-亮氨酸的方法，该方法发酵效率高，操作简单，成本低廉。

本发明是通过如下技术方案来实现的。

一种发酵生产L-亮氨酸的方法，其包括如下步骤：采用产L-亮氨酸的黄色短杆菌发酵44h以上；

当发酵至30h时，往发酵罐中流加醋酸钠水溶液，控制发酵液中醋酸钠的浓度为0.1-1g/L，直至发酵结束，所述醋酸钠水溶液的浓度为50-100g/L；

当发酵至30h时，往发酵罐中流加丙二酸水溶液，控制发酵液中丙二酸的浓度为0.1-0.5 ml/L，直至发酵结束；所述丙二酸水溶液的浓度为10-20%；

当发酵至40h时，往发酵罐中添加壳聚糖，控制发酵液中壳聚糖的浓度为20-80mg/L。

优选地，控制在发酵液中醋酸钠的浓度为0.4-0.5g/L。

优选地，控制在发酵液中丙二酸的浓度为0.2-0.3ml/L。

优选地，控制发酵液中壳聚糖的浓度为40-50mg/L。

优选地，所述方法包括如下步骤：

按8-10%的接种量将产L-亮氨酸的黄色短杆菌种子液接入装有发酵罐培养基的发酵罐中，搅拌转速300-500r/min；通过搅拌和通风控制溶氧在20-30%；通过流加氨水控制pH在7.0；培养温度33℃；以泡敌消泡；当发酵至20h时，将营养液流加进罐内，维持发酵罐内糖浓度为1g/L，发酵结束前6小时停止流加；发酵周期为44h。

优选地，所述发酵罐培养基的组分：葡萄糖50g/L，(NH₄)₂SO₄ 10g/L，玉米浆10g/L，KH₂PO₄ 4g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，柠檬酸0.5g/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，V_B1 5mg/L，生物素50 μg/L。

优选地，所述营养液的组分：葡萄糖100g/L，甘油5g/L，甜菜碱1g/L。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

乙酸是亮氨酸发酵过程中的主要副产物之一；本发明发现，在发酵过程中，添加醋酸钠，可以对乙酸合成途径进行反馈抑制，乙酸合成途径受阻，Val生成量也相应减少，更多的代谢流流向Leu合成途径；

丙二酸能够抑制TCA循环的关键酶，进而减弱TCA循环，减少了TCA循环中乙酸等副产物的生成量，更多的碳源进入Leu合成途径，从而提高Leu的产量；

发酵中后期，添加一定量的壳聚糖，壳聚糖上的氨基与细菌细胞壁中带负电荷的磷壁酸或脂多糖结合，并螯合Mg2+、 Ca2+等阳离子，从而改变细胞壁的通透性，促进亮氨酸分泌到胞外，从而提高亮氨酸产量；但是壳聚糖浓度过大时，会对菌株造成一定的损伤，菌株增殖受阻并且发生死亡。

附图说明

图1：醋酸钠浓度对L-Leu产量的影响；

图2：醋酸钠浓度对Val和Hac含量的影响；

图3：丙二酸浓度对L-Leu产量的影响；

图4：壳聚糖浓度对L-Leu产量的影响。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种发酵生产L-亮氨酸的方法，其包括如下步骤：

试验菌株：黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）TK0303（Met^-+Ile^L+2-TA^r+α-AB^r+β-HL^r+Rif^r+SG^r）。

常规培养方式获得黄色短杆菌种子液，按10%的接种量将黄色短杆菌种子液接入装有300L发酵罐培养基的500L发酵罐中，接种浓度OD₆₀₀为1.5；搅拌转速400r/min；通过搅拌和通风控制溶氧在25%；通过自动流加氨水控制pH在7.0；培养温度33℃；以泡敌消泡；当发酵至20h时，将营养液流加进罐内，维持发酵罐内糖浓度为1g/L，发酵结束前6小时停止流加；发酵周期44h。

发酵罐培养基的组分：葡萄糖50g/L，(NH₄)₂SO₄ 10g/L，玉米浆10g/L， KH₂PO₄ 4g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，柠檬酸0.5g/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，V_B1 5mg/L，生物素50 μg/L。

所述营养液的组分：葡萄糖100g/L，甘油5g/L，甜菜碱1g/L。

当发酵至30h时，往发酵罐中流加醋酸钠水溶液，控制发酵液中醋酸钠的浓度为0.5g/L，直至发酵结束，所述醋酸钠水溶液的浓度为100g/L。

当发酵至30h时，往发酵罐中流加丙二酸水溶液，控制发酵液中丙二酸的浓度为0.2ml/L，直至发酵结束；所述丙二酸水溶液的浓度为15%（v/v）。

当发酵至40h时，往发酵罐中添加壳聚糖，控制发酵液中壳聚糖的浓度为40mg/L。

实施例2

一种发酵生产L-亮氨酸的方法，其包括如下步骤：

试验菌株：黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）TK0303（Met^-+Ile^L+2-TA^r+α-AB^r+β-HL^r+Rif^r+SG^r）。

常规培养方式获得黄色短杆菌种子液，按8%的接种量将黄色短杆菌种子液接入装有300L发酵罐培养基的500L发酵罐中，接种浓度OD₆₀₀为1.8；搅拌转速350r/min；通过搅拌和通风控制溶氧在25%；通过自动流加氨水控制pH在6.8；培养温度33℃；以泡敌消泡；当发酵至20h时，将营养液流加进罐内，维持发酵罐内糖浓度为1g/L，发酵结束前6小时停止流加；发酵周期44h。

发酵罐培养基的组分：葡萄糖50g/L，(NH₄)₂SO₄ 10g/L，玉米浆10g/L， KH₂PO₄ 4g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，柠檬酸0.5g/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，V_B1 5mg/L，生物素50 μg/L。

营养液的组分：葡萄糖100g/L，甘油5g/L，甜菜碱1g/L。

当发酵至30h时，往发酵罐中流加醋酸钠水溶液，控制发酵液中醋酸钠的浓度为0.4g/L，直至发酵结束，所述醋酸钠水溶液的浓度为80g/L。

当发酵至30h时，往发酵罐中流加丙二酸水溶液，控制发酵液中丙二酸的浓度为0.3ml/L，直至发酵结束；所述丙二酸水溶液的浓度为12%（v/v）。

当发酵至40h时，往发酵罐中添加壳聚糖，控制发酵液中壳聚糖的浓度为60mg/L。

对比例1

一种发酵生产L-亮氨酸的方法，其包括如下步骤：

试验菌株：黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）TK0303（Met^-+Ile^L+2-TA^r+α-AB^r+β-HL^r+Rif^r+SG^r），天津科技大学代谢工程研究室保藏。

常规培养方式获得黄色短杆菌种子液，按10%的接种量将黄色短杆菌种子液接入装有300L发酵罐培养基的500L发酵罐中，接种浓度OD₆₀₀为1.5；搅拌转速400r/min；通过搅拌和通风控制溶氧在25%；通过自动流加氨水控制pH在7.0；培养温度33℃；以泡敌消泡；当发酵至20h时，将营养液流加进罐内，维持发酵罐内糖浓度为1g/L，发酵结束前6小时停止流加；发酵周期44h。

实施例3

1、在对比例1常规发酵的基础上，检验醋酸钠添加浓度对发酵液中L-Leu以及主要副产物含量的影响。设置发酵液中醋酸钠的浓度梯度，分别为0，0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7，单位为g/L。如图1-2所示，随着醋酸钠浓度的增加，发酵液中L-Leu的含量稳步提升，而副产物Val和Hac的含量逐渐下降，待醋酸钠浓度升高到0.5g/L时，L-Leu含量达到最大值，继续提高醋酸钠含量，L-Leu含量并没有明显提高，此时，副产物Val和Hac的含量也没有继续下降，说明此时，各代谢流之间已经达到平衡。在发酵过程中，通过在发酵中后期添加适量的醋酸钠，可以对乙酸合成途径进行反馈抑制，乙酸合成途径受阻，Val生成量也相应减少，更多的代谢流流向Leu合成途径。

2、选择发酵液中醋酸钠的浓度为0.5g/L，验证丙二酸添加浓度发酵液中L-Leu以及主要副产物含量的影响。设置不同的丙二酸浓度梯度，0，0.1，0.2，0.3,0.4，0.5，单位ml/L，如图3所示，通过在发酵中后期添加丙二酸，并且随着浓度的增加，发酵液中L-Leu的含量也随之增加，丙二酸浓度为0.3ml/L时，L-Leu含量接近峰值，主要原因是，丙二酸能够抑制TCA循环的关键酶，进而减弱TCA循环，减少了TCA循环中乙酸等副产物的生成量，更多的碳源进入Leu合成途径，从而提高Leu的产量，但是，丙二酸浓度过大，对TCA循环过度抑制会影响菌株正常代谢的需求，造成生长停滞，从而影响L-Leu的合成。

3、选择发酵液中醋酸钠的浓度为0.5g/L，丙二酸的浓度为0.3ml/L，验证了壳聚糖对L-Leu的含量，一般来说，壳聚糖浓度为100mg/L就会对菌株产生一定的抑制，因此，设置壳聚糖浓度梯度为0,5,10,20,40,60,80,单位为mg/L，发酵后期，发酵液中的L-Leu含量较大，L-Leu往胞外分泌受阻，此时，通过添加壳聚糖能够改变细胞壁的通透性，但是浓度过大时，会对菌株造成一定的损伤，菌株增殖受阻并且发生死亡；选择40-60mg/L的添加量较为合适，此时，L-Leu含量较高，但是菌株浓度没有下降。

以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。