阅读说明：本技术 一种混菌发酵生产β-丙氨酸的方法 (Method for producing β -alanine by mixed fermentation ) 是由 陈可泉 许晟 冯娇 王昕� 于 2020-03-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种混菌发酵生产β-丙氨酸的方法。该方法包括以下步骤：构建重组菌株E.coli BL-pET28a-aspC；构建E.coli BL-pET28a-panD葡萄糖代谢缺陷型菌株；选取重组菌株E.coli BL-pET28a-aspC和E.coli BL-pET28a-panD加入发酵培养基中,以葡萄糖和甘油为碳源生产β-丙氨酸。与现有技术相比,本发明通过将aspC和panD分开表达在两个细胞中,利用混菌发酵的方式,降低了生产成本,相比于利用E.coli BL-pET28a-panD单一发酵生产,β-丙氨酸的摩尔收率提高了40%。(The invention discloses a method for producing β -alanine by mixed fermentation, which comprises the following steps of constructing a recombinant strain E.coli B L-pET 28a-aspC, constructing an E.coli B L-pET 28a-panD glucose metabolism defective strain, selecting the recombinant strains E.coli B L-pET 28a-aspC and E.coli B L-pET 28a-panD, adding the recombinant strains into a fermentation culture medium, and producing β -alanine by using glucose and glycerol as carbon sources.)

一种混菌发酵生产β-丙氨酸的方法

技术领域

本发明涉及β-丙氨酸制备技术领域，具体涉及一种混菌发酵生产β-丙氨酸的方法。

背景技术

β-丙氨酸是唯一一种天然β型氨基酸，无毒、略具有甜味。常温下，比较稳定，但是加热易分解。β-丙氨酸暴露在空气中时，易吸潮，因此需要干燥密封储存。它能与水混溶，微溶于乙醇，不溶于乙醚和丙酮。在生物体中，有着很重要的生理功能，并且是泛酸合成过程中不可或缺的媒介。

近年来，β-丙氨酸在医药、化工、美容、食品、环境等方面都有着很广泛的用途，有报道称β-丙氨酸是未来全球12种最具潜力的三碳化工产品之一。主要有以下作用：(1)β-丙氨酸用于合成维生素B5，维生素B5是合成乙酰辅酶A与酰基载体蛋白的重要中间体。它是由D-泛酸和β-丙氨酸通过缩合反应合成的，此反应是由泛酸合成酶进行调控，泛酸合成酶也是乙酰辅酶A的主要组成部分。维生素B5的主要功能是：辅助细胞的形成，维持中枢神经系统的正常发育；参与抗体的合成。由于泛酸不稳定，所以其主要以D-泛酸钙、D-泛酸钠两种形式存在，其中D-泛酸钙的应用最广。目前全球对D-泛酸钙的年需求量为8000～10000τ，而年产量为6000～7000τ，所以普遍出现了供不应求的现象。(2)在肌肽合成酶的作用下，β-丙氨酸、L-组氨酸为底物催化合成肌肽。研究发现肌肽被广泛的应用于制药业、化妆品及食品等各个领域。例如：它可以充当生理缓冲的作用、可以作为神经递质合成的前提、也可以作为肌酶合成的诱导剂、更可以作为自由基的抑制剂。(3)合成聚-β-丙氨酸聚-β-丙氨酸，其是一种聚-β-多肽，可以应用于化妆品，水处理以及建筑方面等各个领域。它也可以用来制备甲醛清除剂、聚甲醛稳定剂等纳米复合材料。传统聚-β-丙氨酸是丙烯酰胺在强碱催化条件，通过聚合反应合成的。

据报道，合成β-丙氨酸的方法为化学法和生物催化法。化学法成本较低、原料易得，但反应过程中大都需要较为苛刻的工艺条件，而且存在着副产物多、环境污染的问题，因而追求绿色安全的生物法具有十分明显的经济与社会效益。生物催化法由于其反应的温和性、环境友好型的优点，越来越受到人们的广泛关注。它主要包括发酵法、纯酶法和全细胞催化法。Chan Woo Song等用发酵的方法，以葡萄糖为底物，将基因panD、aspA与ppc过表达，然后把ppc的表达水平进行优化，进而提高β-丙氨酸的产量。最终经过39h的发酵后，产生了32.3g/L的β-丙氨酸，但是它并没有消除副产物的合成路径，进而副产物的累积将会降低β-丙氨酸的收率，不适合工业化生产。

目前为止，通过将aspC和panD分开表达在两个细胞中，利用混菌发酵的方式，使得中间产物积累减少，终产物的β-丙氨酸产量提高的生产方法尚未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种混菌发酵生产β-丙氨酸的方法，该方法实现了β-丙氨酸不与L-天冬氨酸合成菌竞争葡萄糖，从而提高L-天冬氨酸的产量和减少副产物的生成适合大规模工业化生产，且中间产物少。

一种混菌发酵生产β-丙氨酸的方法，包括以下步骤：

步骤1，构建重组菌株E.coli BL-pET28a-aspC；

步骤2，构建E.coli BL-pET28a-panD葡萄糖代谢缺陷型菌株；

步骤3，选取重组菌株E.coli BL-pET28a-aspC和E.coli BL-pET28a-panD加入发酵培养基中，同时供给葡萄糖和甘油作为碳源，培养至OD约为0.6时用IPTG诱导，继续培养发酵生产β-丙氨酸。

作为改进的是，步骤1中E.coli BL-pET28a-aspC构建方法为：步骤1中E.coli BL-pET28a-aspC构建方法为：选取第一引物，通过PCR复制大肠杆菌MG1655上的天冬氨酸酶，再与载体pET28a连接，并转入克隆载体Trans1-T1，经过LB平板初筛后，挑点进行菌落PCR验证后测序。

作为改进的是，步骤2中E.coli BL-pET28a-panD葡萄糖代谢缺陷型菌株构建方法为：第一步，选取第二引物，通过PCR复制C.glutamicum ATCC13032上的L-天冬氨酸-α-脱羧酶，再与载体pET28a连接，并转入克隆载体Trans1-T1，经过LB平板初筛后，挑点进行菌落PCR验证后测序；第二步，利用Crispr-Cas9编辑技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)的磷酸转移酶系统(PTS)ptsG、ptsH、ptsI、crr和glk基因编码的蛋白，将构建好的pET28a-panD质粒转化至葡萄糖代谢缺陷型的BL21(DE3)的感受态中，即得E.coli BL-pET28a-panD1葡萄糖代谢缺陷型菌株。

作为改进的是，步骤3中所述将重组菌株E.coli BL-pET28a-aspC和E.coli BL-pET28a-panD的细胞OD比为2：1。

作为改进的是，步骤3中所述葡萄糖和甘油的添加的摩尔比为8：1。

作为改进的是，步骤3中所述诱导温度为37℃。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种混菌发酵生产β-丙氨酸的方法的优势在于：

1、利用Crispr-Cas9技术敲除磷酸转移酶系统(PTS)ptsG、ptsH、ptsI、crr和glk基因编码的蛋白，实现β-丙氨酸不与L-天冬氨酸合成菌竞争葡萄糖，从而提高L-天冬氨酸的产量和减少副产物的生成。

2、将L-天冬氨酸生产菌株与β-丙氨酸生产菌株进行混合培养，首次实现从葡萄糖到β-丙氨酸的一步生产。

3、混菌发酵方式对解除单一菌株的发酵瓶颈，在提高β-丙氨酸的产量和产率方面具有显著的效果。相比于利用E.coli BL-pET28a-panD单一利用L-天冬氨酸发酵生产，降低了生产成本β-丙氨酸的摩尔收率提高了40％。

附图说明

图1为质粒pET28a-aspC构建图谱；

图2为质粒pET28a-panD构建图谱；

图3为E.coli BL-pET28a-aspC和E.coli BL-pET28a-panD在OD600下OD接种比例优化情况；

图4为E.coli BL-pET28a-aspC和E.coli BL-pET28a-panD混菌培养初始葡萄糖和甘油的摩尔浓度比例优化情况；

图5为E.coli BL-pET28a-aspC和E.coli BL-pET28a-panD混菌培养的诱导温度优化情况。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

本实验中C.glutamicum ATCC13032，大肠杆菌MG1655，大肠杆菌Trans1-T1，大肠杆菌BL21(DE3)，质粒pET28a均为商业化物品，可以常规购买。

实施例1重组菌株E.coli BL-pET28a-aspC的构建

以大肠杆菌MG1655全基因组为模板选取第一引物

aspC-28a-F：CCGGAATTCATGTTTGAGAACATTACCGC，

aspC-28a-R:CCCTCGAGTTACAGCACTGCCACAATCG，

通过PCR复制大肠杆菌MG1655上的天冬氨酸酶，得到的序列经质量分数为1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段，再通过EcoR I、Xho I双酶切，然后用T4DNA连接酶连接到同样经过双酶切的pET28a载体上，将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。PCR筛选阳性菌株Trans1-T1-pET28a-aspC并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。

将阳性菌株接种至5ml LB/kanR液体培养基，LB/kanR液体培养基组成为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pET28a-aspC。取2μl pET28a-aspC质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂布在含有50mg/L卡那霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，得到重组菌株E.coli BL-pET28a-aspC，其构建成功后图谱如图1所示。

实施例2 E.coli BL-pET28a-panD葡萄糖代谢缺陷型菌株的构建

以C.glutamicum ATCC13032全基因组为模板，选取第二引物

panD-28a-F:CATGCCATGGGCATGCTGCGCACCATCCTC，

panD-28a-R：CCGCTCGAGCTAAATGCTTCTCGACGTCAAAAGCC，

通过PCR复制C.glutamicum ATCC13032上的L-天冬氨酸-α-脱羧酶，得到的序列经质量分数为1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段，再通过Nco I、Xho I双酶切，然后用T4DNA连接酶连接到同样经过双酶切的pET28a载体上，将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。PCR筛选阳性菌株Trans1-T1-pET28a-panD并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。

将阳性菌株接种至5ml LB/kanR液体培养基，LB/kanR液体培养基组成为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pET28a-panD。其构建成功后图谱如图2所示。

利用Crispr-Cas9编辑技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)的磷酸转移酶系统(PTS)ptsG、ptsH、ptsI、crr和glk基因编码的蛋白，即得葡萄糖代谢缺陷型菌株感受态细胞BL21(DE3)-1。取2μl构建好的pET28a-panD质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)-1中，并涂布在含有50mg/L卡那霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，即得E.coli BL-pET28a-panD葡萄糖代谢缺陷型菌株。

实施例3混菌发酵产β-丙氨酸

将重组菌株E.coli BL-pET28a-aspC的单菌落接种到含有50mg/L卡那霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，得到重组菌株E.coli BL-pET28a-aspC的种子液；

挑取重组菌株E.coli BL-pET28a-panD的单菌落接种到含有50mg/L卡那霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，得到重组菌株E.coli BL-pET28a-panD的种子液；

将两种细胞种子液在OD600条件下按照1:1-10：1比例添加(OD比例优化情况如图3所示，当E.coli BL-pET28a-aspC和E.coli BL-pET28a-panD的细胞OD比例关系为2：1时，β-丙氨酸产量最佳)，加入葡萄糖与甘油摩尔比例1:1至10：1(葡萄糖与甘油摩尔比例优化情况如图4所示，当葡萄糖和甘油的添加的摩尔比为8：1时，其β-丙氨酸产量最佳)，在OD约为0.6时用IPTG诱导,诱导温度为25℃～47℃(诱导温度优化情况如图5所示，当诱导温度为37℃时，其β-丙氨酸产量最佳)时发酵生成β-丙氨酸。(原始反应参数为E.coli BL-pET28a-aspC和E.coli BL-pET28a-panD细胞种子液OD比例为：1：1；葡萄糖与甘油摩尔比为4：1；IPTG诱导温度为34℃；每进行一个参数的优化实验时，其他的参数都是相同的，且本实施例中提及的优化手段均为本领域常规技术手段。E.coli BL-pET28a-aspC和E.coli BL-pET28a-panD在细胞种子液OD比例为2：1，葡萄糖与甘油摩尔比为8：1，IPTG诱导温度为37℃时发酵生产β-丙氨酸情况与利用E.coli BL-pET28a-panD单一利用L-天冬氨酸发酵生产，降低了生产成本，β-丙氨酸的摩尔收率提高了40％。

序列表

<110> 南京凯诺生物科技有限公司

<120> 一种混菌发酵生产β-丙氨酸的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccggaattca tgtttgagaa cattaccgc 29

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccctcgagtt acagcactgc cacaatcg 28

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg gcatgctgcg caccatcctc 30

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagc taaatgcttc tcgacgtcaa aagcc 35