阅读说明：本技术 一种能够缓解类风湿性关节炎的罗伊氏乳杆菌组合物 (Lactobacillus reuteri composition capable of relieving rheumatoid arthritis ) 是由 陈卫 杨波 樊哲新 赵建新 张灏 于 2019-10-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种能够缓解类风湿性关节炎的罗伊氏乳杆菌组合物,属于食品微生物技术领域。本发明分别将罗伊氏乳杆菌CCFM8631和罗伊氏乳杆菌CCFM14活化、扩大培养,离心,重悬于30％的蔗糖溶液制备成浓缩生物制剂,经平板计数罗伊氏乳杆菌CCFM8631和CCFM14的活菌数均大于10<Sup>10</Sup>CFU/mL。本发明提供的罗伊氏乳杆菌组合物能够显著的缓解II型胶原诱导的类风湿性关节炎,缓解关节发红和肿胀症状,抑制抗II型胶原抗体的水平,降低血清中促炎细胞因子和抑炎因子的含量,降低Th1和Th2细胞相关的效应特征因子的水平,改善肠道功能,具有广泛的市场应用前景。(The invention discloses a lactobacillus reuteri composition capable of relieving rheumatoid arthritis, and belongs to the technical field of food microorganisms. The invention respectively activates, carries out enlarged culture and centrifugation on the lactobacillus reuteri CCFM8631 and the lactobacillus reuteri CCFM14, and then the lactobacillus reuteri CCFM14 is suspended in 30 percent of sucrose solution to prepare a concentrated biological agent, and the viable count of the lactobacillus reuteri CCFM8631 and the viable count of the lactobacillus reuteri CCFM14 are both more than 10 through flat plate counting 10 CFU/mL. The lactobacillus reuteri composition provided by the invention can obviously relieve type II collagen-induced rheumatoid arthritis, relieve redness and swelling of joints, inhibit the level of anti-type II collagen antibody, reduce the content of proinflammatory cytokines and anti-inflammatory factors in serum and reduce the content of proinflammatory cytokines and anti-inflammatory factorsThe levels of the effect characteristic factors related to the Th1 and the Th2 cells improve the intestinal function, and have wide market application prospect.)

一种能够缓解类风湿性关节炎的罗伊氏乳杆菌组合物

技术领域

本发明涉及一种能够缓解类风湿性关节炎的罗伊氏乳杆菌组合物，属于食品微生物技术领域。

背景技术

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种慢性、全身性的自身免疫性疾病，具有小关节对称性、持续性疼痛的特点，初期表现为滑膜炎、血管翳的形成，继而关节软骨破坏、骨组织炎症，后期关节硬化、关节腔显著狭窄或消失，最终发展成骨性关节硬化，关节腔狭窄甚至消失，关节畸形，导致功能性残疾。流行病学调查显示，全球约有0.5％-1％的人患有类风湿性关节炎，我国的患病率约为0.32％-0.36％。类风湿性关节炎疾病的发生受多种因素的影响，如遗传、生活环境、性别和年龄等，其中男女发病率约为1：3，且老年人发病率高于幼儿，另牙周疾病患者相比于健康的口腔人群更容易患RA。

类风湿性关节炎确切的病因和发病机制尚不明确，一般认为机体在遗传背景下，受环境因素刺激之后诱导自身抗原形成，激活T淋巴细胞异常发育和分化而产生大量的促炎细胞因子，同时B细胞产生自抗体破坏机体免疫耐受，引发自身免疫反应，是一种慢性炎症性疾病。T淋巴细胞受刺激之后向不同的辅助性T细胞亚群分化，T细胞亚群分泌相应的特征细胞因子发挥对应的效应。与类风湿性关节炎相关的T细胞亚群主要是Th1、Th2、Th17和Treg细胞，他们之间的失衡对发病有重要的影响，且与疾病程度密切相关。Th1/Th2细胞的失衡是RA发病的重要原因之一。Th1和Th2细胞功能不同，Th1主要产生一些促炎性的细胞因子如IL-1和IFN-γ，而Th2可分泌IL-4和IL-10等，发挥抑炎作用，有研究发现在关节滑膜中有大量的Th1相关的细胞因子，表明Th1细胞介导了RA的发病过程。近年来新发现Th17/Treg细胞也是影响RA发病和发展的关键细胞亚群，主要是由于Th17细胞分泌的IL-17A和IL-22可加重炎症反应，而Treg分泌产生的TGFβ和IL-10具有抑制免疫活化的作用。此外，瓜氨酸化与类风湿性关节炎发病机制也相关。瓜氨酸是人体内的非标准氨基酸，不能体内合成，但是在肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PAD)作用下可使精氨酸转化为瓜氨酸，PAD是瓜氨酸化的关键催化酶。

众多的研究证据表明，肠道微生物与免疫应答和类风湿性关节炎之间有密切的联系，临床诊断和治疗中发现类风湿性关节炎患者的粪便和口腔菌群组成与健康人存在显著的不同，但经过药物治疗之后这些紊乱的菌群趋于恢复到正常。在动物研究中也证实自发型类风湿性关节炎疾病动物的发病依赖于外界和自身肠道菌群的存在，在无菌鼠中疾病不能发生。肠道及肠粘膜作为人体重要的免疫位点参与全身系统性的免疫应答，可影响肠黏液层特性、诱导肠淋巴样结构发育、介导炎性因子的产生和调节免疫细胞的分化和抗体的分泌，这些免疫效应分子通过体循环对固有免疫系统产生重要的影响。此外，肠道粘膜T淋巴细胞的发育、分化需要肠道细菌的刺激。由此推测，肠道可作为治疗RA的靶点，使用一定技术手段使紊乱的类风湿性关节炎患者的肠道菌群恢复正常，改善肠局部免疫应答，进而减缓RA相关症状。

目前，临床治疗类风湿性关节炎一般采用药物治疗，如非甾体类抗炎药、抗风湿药物、肾上腺糖皮质激素、免疫抑制剂和新型的生物制剂等。传统药物治疗只能在一定程度减轻疼痛延缓疾病进程，但长期服用会严重损伤胃肠道，新型生物制剂价格昂贵且有发生感染的潜在风险，这些不足之处限制了药物的推广使用，不能有效改善病情。因此，亟需寻找一种不会表现出对以药物为基础的治疗的限制、容易实施且能够有效缓解症状和病情的预防或治疗方式。

乳酸菌作为一种安全的、可食用的食品，已经在预防或治疗多种疾病的领域有广泛的应用，例如预防或治疗胃肠道疾病、神经性疾病，缓解重金属毒性，促进消化吸收，拮抗致病菌的感染与增强免疫力等。因此，研发能有效干预类风湿性关节炎疾病发生发展的益生菌制品，具有重要的社会应用价值。尽管有卷曲乳杆菌治疗或缓解类风湿性关节炎的相关专利申请(公开号：CN104546947A)，但卷曲乳杆菌是不可食用菌；有干酪乳杆菌缓解类风湿性关节炎的专利(公开号：CN108926579A)，但仅集中于缓解关节炎相关疾病表型和降低促炎性细胞因子。目前有临床或动物研究中发现鼠李糖乳杆菌L.rhamnosus GG(LGG)可有效缓解类风湿性关节炎。但尚无关于罗伊氏乳杆菌对类风湿性关节炎疾病发生、发展的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种益生菌组合物调节免疫应答而缓解类风湿性关节炎病情。所述的罗伊氏乳杆菌组合物可应用于减少类风湿性关节炎大鼠体重的下降，减轻类风湿性关节炎关节肿胀，降低血清中促炎因子的水平，降低抗II型胶原特异性抗体，改善肠道菌群，改善类风湿性关节炎疾病病情。

本发明的第一个目的是提供一种罗伊氏乳杆菌组合物在制备类风湿性关节炎产品中的应用，所述罗伊氏乳杆菌组合物中包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM14和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM8631。

所述罗伊氏乳杆菌CCFM14购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，2007年05月23日保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼中国食品发酵工业研究院，保藏编号为CICC6226。

所述罗伊氏乳杆菌CCFM8631于2017年07月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.14394，已公开于公开号为CN107523526A的专利申请中。

在本发明的一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌CCFM14和罗伊氏乳杆菌CCFM8631的活菌数比例为1:2-2:1。

在本发明的一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌CCFM14和罗伊氏乳杆菌CCFM8631的菌株浓度范围为10⁵-10¹¹CFU/mL或10⁵-10¹¹CFU/g。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括降低促炎性细胞因子IL-1β、IL-6和/或TNFα水平。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括降低抗II胶原特异性抗体CII-IgG、CII-IgG1、CII-IgG2a和/或CII-IgG2b水平。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括降低辅助性T细胞效应特征因子IFNγ、IL-4和/或IL-17A水平。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括缓解体重减轻和/或减轻关节肿胀程度。

在本发明的一种实施方式中，所述产品包括食品、药品或保健品。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品，药品中包含罗伊氏乳杆菌CCFM14和罗伊氏乳杆菌CCFM8631、药物载体和/或药用辅料。

在本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒以及脂质体。

在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、赋形剂、附加剂、释放阻滞剂中的一种或几种。

在本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品，以上述的罗伊氏乳杆菌组合物作为发酵剂，发酵乳制品、发酵豆制品或发酵果蔬制品。

本发明的第二个目的是提供一种可缓解类风湿性关节炎的罗伊氏乳杆菌组合物，所述罗伊氏乳杆菌组合物中包括罗伊氏乳杆菌CCFM14和罗伊氏乳杆菌CCFM8631，罗伊氏乳杆菌CCFM14和罗伊氏乳杆菌CCFM8631的活菌数比例为1:2-2:1。

本发明还提供了上述罗伊氏乳杆菌组合物的制备方法，是将罗伊氏乳杆菌CCFM8631和罗伊氏乳杆菌CCFM14活化、扩大培养，离心，重悬于30％的蔗糖溶液制备成浓缩生物制剂。

在本发明的一种实施方式中，将罗伊氏乳杆菌CCFM14和罗伊氏乳杆菌CCFM8631，分别在MRS培养基中连续活化三代之后，将活化后的菌株以1-5％接种量(V/V)转接于MRS培养基中扩大培养；分别将罗伊氏乳杆菌CCFM14和罗伊氏乳杆菌CCFM8631的扩大培养物离心(5000-6000g，10-20min)，弃上清，无菌生理盐水重悬菌泥，清洗，最后将菌泥重悬于20-30％无菌蔗糖溶液中。

本发明的有益效果：

本发明中的两株罗伊氏乳杆菌在体外模拟胃液、小肠液中存活率高，并对Caco2细胞的黏附性能较好，可耐受肠道极端环境。制备得到的罗伊氏乳杆菌组合物能够显著的缓解类风湿性关节炎，缓解关节发红和肿胀症状，抑制抗II型胶原抗体的水平，降低血清中促炎细胞因子的含量(罗伊氏乳杆菌组合物可将血清中IL-1β、IL-6和TNFα的水平分别降低13.1％、30.7％和27.3％)，降低Th1和Th2细胞相关的效应特征因子的水平，改善肠道菌群组成，具有广泛的市场应用前景。

附图说明

图1：罗伊氏乳杆菌组合物对类风湿性关节炎大鼠的影响，A：体重；B：临床分数；C：关节厚度。

图2：罗伊氏乳杆菌组合物对类风湿性关节炎大鼠血清中促炎细胞因子的影响，A：IL-1β；B：IL-6；C：TNFα。

图3：罗伊氏乳杆菌组合物对类风湿性关节炎大鼠血清中抗II胶原特异性抗体的影响，A：anti-CII-IgG；B：CII-IgG1；C：CII-IgG2a；D：CII-IgG2b。

图4：罗伊氏乳杆菌组合物对类风湿性关节炎大鼠血清中辅助性Th1细胞效应特征因子IFNγ的影响。

图5：罗伊氏乳杆菌组合物对类风湿性关节炎大鼠血清中辅助性Th2细胞效应特征因子IL-4的影响。

图6：罗伊氏乳杆菌组合物对类风湿性关节炎大鼠血清中辅助性Th17细胞效应特征因子IL-17A的影响。

图7：罗伊氏乳杆菌组合物对类风湿性关节炎大鼠肠道菌群S24-7科相对丰度的影响。

图8：罗伊氏乳杆菌组合物对类风湿性关节炎大鼠肠道菌群Anaeroplasma属相对丰度的影响。

图9：罗伊氏乳杆菌组合物对类风湿性关节炎大鼠肠道菌群Clostridium属相对丰度的影响。

图10：罗伊氏乳杆菌组合物对类风湿性关节炎大鼠肠道菌群Veillonellaceae科相对丰度的影响。

具体实施方式

实施例1：罗伊氏乳杆菌体外对人克隆结肠腺癌细胞Caco2黏附性能

培养Caco2细胞于DEME(5％胎牛血清，1％抗生素)培养基中，每天更换培养基至细胞聚合度为80-90％。用PBS清洗三次之后，用预热的0.25％胰蛋白酶消化细胞，并调整细胞浓度为5×10⁵个/mL，并接种至六孔板培养皿中，将培养皿置于37℃、95％空气/5％CO₂培养箱中培养，前一周两天更换一次培养基，一周之后每天更换培养基，直到生长成为致密的单细胞层。

黏附实验孔使用具有单细胞层的孔，用2mL预热的PBS清洗三次之后，每孔加入1mL不含有抗生素含有5％胎牛血清的DEME培养基和1mL重悬有对数末期细菌的DEME培养基(调节细菌总数约为10⁸CFU/mL)，轻轻混匀之后置于37℃的5％二氧化碳培养箱中孵育。黏附对照孔使用不含有细胞的孔，其他操作与黏附实验相同。

培养2h之后，取出培养皿，黏附实验孔和黏附对照孔用2mL预热的PBS缓冲液清洗细胞三次直至洗去未黏附的细菌，将PBS缓冲液完全弃去，加入1mL 0.5％Triton X-100溶液，用移液枪吹吸直至将细菌从细胞表面洗脱下来。将黏附实验孔和黏附对照孔中的细菌悬浮液分别转移至9mL的无菌生理盐水中，进行梯度稀释，分别吸取1mL梯度稀释液至培养皿用MRS培养基倾注，置于37℃恒温培养箱培养，48h后取出计数。黏附率是指该菌株的黏附实验孔菌落数与黏附对照孔菌落数之比，以％表示。

两株罗伊氏乳杆菌对Caco2细胞的黏附结果如表1所示，结果说明罗伊氏乳杆菌CCFM14对Caco2细胞的黏附性差，而罗伊氏乳杆菌CCFM8631对Caco2细胞有良好的黏附性能。

表1两株罗伊氏乳杆菌对人克隆结肠腺癌细胞Caco2的黏附性能

	CCFM14	CCFM8631
			黏附率(％)	2.4±3.4	78+7.3

实施例2：罗伊氏乳杆菌体外耐受模拟胃肠液的测定

配制模拟胃液：称取一定量的胃蛋白酶，溶解于2/3所需体积的0.5％(w/v)生理盐水中，用6M盐酸调节pH至3.0，定容，使胃蛋白酶终浓度为3g/L。

配制模拟肠液：称取一定量的胰蛋白酶和胆盐，溶解于2/3所需体积的0.5％(w/v)生理盐水，用0.1mol/L的NaOH调节至pH 8.0，定容，使终浓度分别为1g/L和0.3g/L。

模拟胃液和模拟肠液现配现用，定容后的模拟液在使用前经0.22μm无菌滤膜过滤除菌。

将活化两代的罗伊氏乳杆菌继续传代，培养18h，8000g室温离心5min收集菌体，分别重悬于人工模拟胃液和模拟肠液中，分别在37℃条件下厌氧培养3h和4h，用MRS平板倾注法进行计数。存活率是指该培养液中3h和0h时活菌数之比，以％表示。实验结果如表2所示，说明罗伊氏乳杆菌CCFM14和罗伊氏乳杆菌CCFM8631对人工模拟胃肠液有较好的耐受性。

表2罗伊氏乳杆菌组合物对人工模拟胃液、人工模拟肠液的耐受性

	模拟胃液存活率(％)	模拟肠液存活率(％)
			CCFM14	50.3±5.6	43.9±6.5
CCFM8631	78.1±4.9	57.3±6.2

实施例3：罗伊氏乳杆菌组合物制剂的制备

将罗伊氏乳杆菌CCFM14和CCFM8631，分别在MRS培养基中连续活化三代之后，将活化后的菌株以5％接种量(V/V)转接于MRS培养基(添加0.5％的半胱氨酸盐酸盐)中扩大培养。分别将罗伊氏乳杆菌CCFM14和CCFM8631的扩大培养物离心(5000g，15min)，弃上清，用无菌生理盐水重悬菌泥，清洗后将菌泥重悬于30％无菌蔗糖溶液中，使得每株菌的浓度为5×10¹⁰CFU/mL，分装，置于-80℃冰箱冻存，使用前融化，无菌生理盐水稀释十倍。两株菌的稀释培养物以活菌数1：1混合均匀，置于37℃恒温箱15min后形成罗伊氏乳杆菌组合物制剂。

实施例4：罗伊氏乳杆菌组合物对胶原诱导型类风湿性关节炎大鼠的改善作用

使用7周龄的SPF(Specific Pathogen Free)级雌性Wistar大鼠40只，饲养温度22-24℃，湿度40％-60％，每日光照12h，自由进食及饮水。实验动物适应性饲养1周之后随机分为五组：正常组、模型组、药物组、LGG组和罗伊氏乳杆菌组(L.reuteri组)，每组8只，具体分组以及实验处理见表3。

利用II型牛胶原及氟氏不完全佐剂诱导类风湿关节炎的发生，需要制备完全乳化液，将牛II型胶原蛋白溶液与氟氏不完全佐剂等体积混合、乳化。类风湿性关节炎具体造模方法是进行两次免疫，初次免疫将0.15mL完全乳化液在距离大鼠尾根部1.5cm处进行皮下注射，一周后采用相同的处理方法进行加强免疫，即在距离大鼠尾根部2.0cm处进行皮下注射0.15mL完全乳化液。在加强免疫一周后称量大鼠体重、量取踝关节厚度、观察大鼠足爪和踝关节红肿状态进而对关节炎临床症状评分。关节炎临床症状评分标准如下：0分：关节没有红斑和肿胀；1分：1个关节肿胀和/或发红；2分：2个关节肿胀或发红；3分：大于2个关节肿胀或发红；4分：整个足爪发红关节炎症严重。一只大鼠的4爪分别评分，每只大鼠得分最高为16分。大鼠类风湿性关节炎评价结果如图1所示。

表3实验动物分组及处理方法

加强免疫后1周后关节炎症状出现。通过图1可知，与未造模前相比较，4周时模型组和药物组体重基本维持不变，而正常组、L.reuteri组和LGG组的平均体重分别增加了17.58％，3.09％和7.89％，但药物甲氨喋呤的副作用是会明显增加大鼠体重的降低。第6周时，与关节炎未出现时相比较，模型组大鼠关节平均厚度增加了2.8mm；而L.reuteri组和LGG组大鼠的关节平均厚度分别增加了2.2、2.4mm。6周后，L.reuteri组、LGG组和药物组的疾病症状(体重、临床评分和关节厚度)趋于稳定甚至减轻，而造模组中关节肿胀程度趋于严重。因此，L.reuteri组合物能够抑制类风湿性关节炎的疾病程度，减轻大鼠爪关节肿胀程度，改善大鼠行动能力。

实施例5：罗伊氏乳杆菌组合物降低类风湿性关节炎大鼠血清中促炎因子的水平

实验结束时，大鼠禁食不禁水12h，采集血样，室温静置30min之后，3000g室温离心15min，取上清，使用大鼠ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司，TNFα：SBJ-R0648，IL-6：SBJ-R0755，IL-1β：SBJ-R0546)测定血清中促炎因子的含量，根据说明书进行操作，测定与炎症相关的细胞因子IL-1β、IL-6和TNFα的浓度。

结果如图2所示，模型组大鼠处于严重的炎症状态，血清中IL-1β、IL-6和TNFα水平比正常组显著升高。相比于模型组的大鼠，药物甲氨喋呤处理可将血清中IL-6水平降低11.7％，但抑制IL-1β和TNFα产生的作用并不显著；LGG可将血清中IL-6和TNFα的水平分别降低10.6％和9.9％，但不影响IL-1β；罗伊氏乳杆菌组合物可将血清中IL-1β、IL-6和TNFα的水平分别降低13.1％、30.7％和27.3％。结果说明罗伊氏乳杆菌组合物降低促炎因子水平的作用显著强于LGG和药物。

实施例6：罗伊氏乳杆菌组合物对类风湿性关节炎大鼠血清中特异性抗体的作用

实验结束时，大鼠禁食不禁水12h，采集血样，室温静置30min之后，3000g室温离心15min，取上清，使用大鼠ELISA试剂盒测定血清中特异型抗体的水平(南京森贝伽生物科技有限公司，CII-IgG1：，CII-IgG1：SBJ-R0970，CII-IgG2b：SBJ-R0972，)。

结果如图3所示，模型组大鼠中抗CII-IgG抗体及亚型抗CII-IgG1、CII-IgG2a和CII-IgG2b抗体的水平较正常组显著上升，分别提高了29.2％、29.4％、24.7％、25.6％。与模型组相比较，罗伊氏乳杆菌组合物制剂可将抗CII-IgG、CII-IgG1、CII-IgG2a和CII-IgG2b抗体水平分别降低12.5％、11.8％、11.7％、16.3％，罗伊氏乳杆菌组合物制剂抑制这四类抗体的产生的能力与LGG接近；但罗伊氏乳杆菌组合物抑制CII-IgG2b的能力弱于药物甲氨喋呤(23.3％)。由此可知，罗伊氏乳杆菌组合物有效抑制B细胞产生II型胶原特异型抗体CII-IgG、CII-IgG1、CII-IgG2b和CII-IgG2a，其作用效果相当于LGG。

实施例7：罗伊氏乳杆菌组合物对关节炎大鼠血清中T淋巴辅助性细胞特征因子的影响

实验结束时，大鼠禁食不禁水12h，采集血样，室温静置30min之后，3000g室温离心15min，取上清，使用大鼠ELISA试剂盒测定血清中Th1、Th17和Th2细胞的特征细胞因子。Th1、Th17和Th2细胞的特征因子对应的分别是IFNγ、IL-4和IL-17，根据试剂盒说明书进行操作。

结果如图4-6所示，模型组大鼠中IFNγ、IL-4和IL-17A比正常组分别高出53.8％、27.3％、36.4％。在L.reuteri组中，Th1细胞分化特征因子IFNγ比模型组低30％，而药物和LGG处理只降低了20％和25％，表征罗伊氏乳杆菌组合物制剂在抑制Th1细胞特征效应分子的能力强于LGG和药物。Th2细胞分化特征因子IL-4在正常组和LGG组和L.reuteri组差异不显著，但都显著低于模型组。此外，Th17细胞效应特征因子IL-17A在模型组中是正常组的1.36倍，显著高于正常组，罗伊氏乳杆菌组合物制剂可降低IL-17A的水平，仅为空白组的1.27倍，而LGG都不能降低IL-17A。综合结果说明，罗伊氏乳杆菌组合物制剂抑制Th1和Th17细胞免疫应答强于LGG，而对Th2细胞影响与LGG相似。

实施例8：罗伊氏乳杆菌组合物对类风湿性关节炎大鼠肠道菌群的作用

在实验结束时收集大鼠的粪便，提取粪便中基因组DNA，对V3-V4区进行特异性PCR扩增，16S rDNA测序，分析粪便菌群变化。结果如图7所示。

与正常组相比，模型组大鼠粪便微生物菌群在科和属水平与正常组有显著差异，如图7-图10。模型组中S24-7科(图7)、Anaeroplasma属(图8)和Clostridium属(图9)的相对丰度相比较正常组分别降低19.0％、83.5％和64％，而Veillonellaceae科(图10)的相对丰度相比较正常组增加了1.64倍，灌胃罗伊氏乳杆菌组合物可使S24-7、Veillonellaceae和Clostridium恢复至正常组水平，Anaeroplasma属的相对丰度分别提高至正常组的64.7％。鼠李糖乳杆菌LGG只能将S24-7科、Anaeroplasma属和Clostridium属微生物相对丰度分别恢复到76.2％、23.5％和49.3％。药物处理和鼠李糖乳杆菌LGG甚至提高Veillonellaceae科的相对丰度，且对其余三种微生物的调节作用弱于罗伊氏乳杆菌组合物。说明本发明的罗伊氏乳杆菌组合物可恢复类风湿性关节炎大鼠紊乱的肠道菌群，改善肠道功能。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。