植物乳杆菌lpjz-658在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝病中的应用
阅读说明：本技术 植物乳杆菌lpjz-658在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝病中的应用 (Application of lactobacillus plantarum LPJZ-658 in preparation of medicines for treating non-alcoholic fatty liver disease ) 是由 朱羿龙 赵翠青 李海鸣 刘立明 于 2021-11-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种植物乳杆菌LPJZ-658在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝病中的应用。本发明新筛选的植物乳杆菌LPJZ-658可以显著降低非酒精性脂肪性肝炎个体肝脏/体总比值,显著降低非酒精性脂肪性肝炎个体肝脏损伤程度,显著降低非酒精性脂肪性肝炎个体肝脏脂肪堆积和纤维化程度,还可显著显著降低非酒精性脂肪性肝炎个体外周血中脂质代谢相关指标的含量,从而可用于制备治疗非酒精性脂肪性肝病。(The invention relates to application of lactobacillus plantarum LPJZ-658 in preparation of medicines for treating non-alcoholic fatty liver disease. The lactobacillus plantarum LPJZ-658 newly screened by the invention can obviously reduce the liver/body total ratio of the non-alcoholic steatohepatitis individual, obviously reduce the liver injury degree of the non-alcoholic steatohepatitis individual, obviously reduce the liver fat accumulation and fibrosis degree of the non-alcoholic steatohepatitis individual, and also obviously reduce the content of lipid metabolism related indexes in peripheral blood of the non-alcoholic steatohepatitis individual, thereby being used for preparing and treating the non-alcoholic steatohepatitis.)
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种植物乳杆菌LPJZ-658在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝病中的应用。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指很少饮酒或不饮酒人群肝细胞内脂肪过度蓄积所导致的一系列肝脏疾病。NAFLD包括单纯的非酒精性脂肪肝(NAFL)以及后续发展为伴随肝脏炎症甚至轻度纤维化的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NAFL是NAFLD的第一个阶段，NAFL的发生是由于肝细胞新陈代谢受损，包括脂肪酸的过量摄入、脂肪酸的氧化减少、新生脂肪生成过量、肝细胞极低密度脂蛋白合成和分泌减少等，所有上述变化都会导致脂肪酸代谢异常，最终导致肝脏脂质堆积。NASH的特点是脂质过度堆积诱发脂毒性，肝细胞发生脂性凋亡并伴有炎症的发生。虽然NAFL的缓解相对容易，但大约25％的患者随后可进展为更严重的NASH、肝纤维化、肝硬化和肝癌。
然而，目前对于非酒精性肝病的诊断手段并不准确，非侵入性超声检查对轻度肝脂肪变性的敏感性较差；同样以血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)升高的评价体系由于ALT/AST水平在50％-80％的病例中可能是正常的，因此往往低估了真实的患病率；甚至，非酒精性脂肪肝诊断的“金标准”肝脏活检由于组织病理学检查使用的是相对较小的肝脏碎片，并不能完整的评估整个肝脏的状态，因此可能也会有一定的不准确性。诊断手段的不准确导致患者容易错过最佳的治疗干预阶段，进展为中重度脂肪肝还可能伴随轻中度的肝纤维化。由于NASH患病率的逐年增加并且诊断手段的不完善导致NASH已成为肝移植手术主要原因之一。
近来，随着“肠肝轴”学说的发展，有人提出了新的治疗方案即益生菌。益生菌是一种活性微生物，在维持宿主的微生态平衡方面发挥着重要的作用。正常成年人肠道内的肠道菌群总重量有1kg-2kg，包含约500-1000种不同的类型，其细胞总量几乎是人体自身细胞的10倍。益生菌能够抑制肠道有害细菌的增殖，减少小肠细菌过度生长，恢复胃肠道功能并调节肠道免疫系统，这些机制均有利于改善NASH的发生发展。
有研究表明益生菌能改善NASH患者的肝功能、脂质代谢和胰岛素抵抗等，益生菌的使用给NASH的治疗提供了新的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效治疗非酒精性脂肪性肝病的的植物乳杆菌。
本发明提供了一种植物乳杆菌LPJZ-658在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝病中的应用，所述植物乳杆菌LPJZ-658的保藏号为：CGMCC No.22908。本发明的植物乳杆菌LPJZ-658已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021.7.16。
可选地，所述非酒精性脂肪性肝病包括非酒精性脂肪性肝炎。
本发明还提供了一种用于治疗非酒精性脂肪性肝病的植物乳杆菌，包括所述的植物乳杆菌LPJZ-658。
本发明的有益效果：
1.本发明新筛选的植物乳杆菌LPJZ-6581可以显著降低非酒精性脂肪性肝炎个体肝脏重量/体重比值。
2.本发明新筛选的植物乳杆菌LPJZ-6581可以显著降低非酒精性脂肪性肝炎个体肝脏损伤程度。
3.本发明新筛选的植物乳杆菌LPJZ-6581可以显著降低非酒精性脂肪性肝炎个体肝脏脂肪堆积和纤维化程度。
4.本发明新筛选的植物乳杆菌LPJZ-6581可以显著降低非酒精性脂肪性肝炎个体外周血中脂质代谢相关指标的含量。
附图说明
图1为具体实施例中对照组(Control)、非酒精性脂肪性肝炎组(NASH)和NASH+LPJZ-658处理组的小鼠肝脏照片；
图2为具体实施例中对照组(Control)、LPJZ-658对照组(LPJZ-658Control)、非酒精性脂肪性肝炎组(NASH)和NASH+LPJZ-658处理组的小鼠肝脏指数数据；
图3为具体实施例中对照组(Control)、LPJZ-658对照组(LPJZ-658Control)、非酒精性脂肪性肝炎组(NASH)和NASH+LPJZ-658处理组的谷草转氨酶数据；
图4为具体实施例中对照组(Control)、LPJZ-658对照组(LPJZ-658Control)、非酒精性脂肪性肝炎组(NASH)和NASH+LPJZ-658处理组的谷丙转氨酶数据；
图5为具体实施例中对照组(Control)、LPJZ-658对照组(LPJZ-658Control)、非酒精性脂肪性肝炎组(NASH)和NASH+LPJZ-658处理组的肝脏中甘油三酯数据；
图6为具体实施例中对照组(Control)、非酒精性脂肪性肝炎组(NASH)和NASH+LPJZ-658处理组的肝脏组织染色显微照片；
图7为具体实施例中对照组(Control)、LPJZ-658对照组(LPJZ-658Control)、非酒精性脂肪性肝炎组(NASH)和NASH+LPJZ-658处理组的血清中甘油三酯数据；
图8为具体实施例中对照组(Control)、LPJZ-658对照组(LPJZ-658Control)、非酒精性脂肪性肝炎组(NASH)和NASH+LPJZ-658处理组的血清中游离脂肪酸数据；
图9为具体实施例中对照组(Control)、LPJZ-658对照组(LPJZ-658Control)、非酒精性脂肪性肝炎组(NASH)和NASH+LPJZ-658处理组的血清中总胆固醇数据；
图10为具体实施例中对照组(Control)、LPJZ-658对照组(LPJZ-658Control)、非酒精性脂肪性肝炎组(NASH)和NASH+LPJZ-658处理组的血清中甘油数据。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
本发明将7-8周龄雄性C57BL/6小鼠分为对照组(Control)、LPJZ-658对照组(LPJZ-658Control)、非酒精性脂肪性肝炎组(NASH)和NASH+LPJZ-658处理组，每组12只小鼠。实验期间，Control和LPJZ-658Control组正常饮食和饮水，NASH和NASH+LPJZ-658组饲喂Western Diet(西方饮食，含42％脂肪的饲粮)和糖水(23.1g/L果糖+18.9g/L葡糖糖)，共12周。NASH和NASH+LPJZ-658组每周腹腔注射1次CCl4(0.32ug/g of body weight，溶于橄榄油)，Control和LPJZ-658Control组注射同等体积橄榄油。在实验的最后4周，LPJZ-658Control和NASH+LPJZ-658组小鼠每天通过灌胃给予1×109CFU/只/天的LPJZ-658益生菌。
实验结束处死小鼠，①小心分离肝脏脂肪用滤纸擦干后准确称重，计算肝脏与体重比率；②检测小鼠外周血中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的含量；③检测小鼠肝脏组织中甘油三酯的含量；④病理学方法检测小鼠肝脏的变化；⑤检测小鼠外周血中甘油三酯、游离脂肪酸、甘油和总胆固醇等脂质代谢相关指标。
1材料
1.1植物乳杆菌LPJZ-658
1.2实验动物
7-8周龄雄性C57BL/6小鼠
1.3常用试剂、试剂盒
MRS液体培养基、MRS固体培养基购自北京索莱宝科技有限公司；甘油三酯(TG)检测试剂盒、游离脂肪酸(NEFA)检测试剂盒、甘油(Glycerol)检测试剂盒、总胆固醇(T-CHO)检测试剂盒、谷丙转氨酶(ALT)检测试剂盒、谷草转氨酶(AST)检测试剂盒购自南京建成生物工程所；西方饮食配方粮购自小黍有泰公司；果糖、葡萄糖和CCl4购自SIGMA；橄榄油购自金歌斯达。
2方法与结果
将C57BL/6小鼠分为对照组(Control)、LPJZ-658对照组(LPJZ-658Control)、非酒精性脂肪性肝炎组(NASH)和NASH+LPJZ-658处理组，每组12只小鼠。实验期间，Control和LPJZ-658Control组正常饮食和饮水，NASH和NASH+LPJZ-658组饲喂Western Diet(西方饮食，含42％脂肪的饲粮)和糖水(23.1g/L果糖+18.9g/L葡糖糖)，共12周。NASH和NASH+LPJZ-658组每周腹腔注射1次CCl4(0.32ug/g of body weight，溶于橄榄油)，Control和LPJZ-658Control组注射同等体积橄榄油。
在实验的最后4周，LPJZ-658Control和NASH+LPJZ-658组小鼠每天通过灌胃给予1×109CFU/只/天的LPJZ-658益生菌。
2.1对肝脏重量的影响
实验结束处死前，对各组每只小鼠称重，处死后摘取肝脏并称重记录，计算肝脏指数。肝脏指数＝肝脏重量/体重。
如图1所示，NASH诱导小鼠肝脏体积显著增大、呈黄色、油腻感、边缘变钝；，与NASH诱导小鼠相比，NASH+LPJZ-658组小鼠肝脏体积显著减小，颜色显著改变呈红色、质较韧、边缘变锐，并且如图2所示，NASH诱导小鼠肝脏/体重比值显著升高，而与NASH诱导小鼠相比，NASH+LPJZ-658组小鼠肝脏/体重比值显著降低。
2.2对肝脏损伤的影响
收集每组每只小鼠新鲜血液，在室温下静置2小时，以2500rpm/min的转速，在4℃离心30min，收集血清，测定血清中ALT和AST含量。
ALT(谷丙转氨酶)和AST(谷草转氨酶)是肝细胞损伤的“金标准”。转氨酶主要存在于肝细胞中，任何原因的肝细胞炎症或损伤，都会使转氨酶从肝细胞中释放出来，引起转氨酶升高。结果如图3和图4所示，NASH诱导小鼠外周血中ALT和AST的含量显著升高，而与NASH诱导小鼠相比，NASH+LPJZ-658组小鼠外周血中ALT和AST的含量显著降低。
2.3对肝脏脂质堆积及纤维化程度的影响
每组每只小鼠肝脏组织准确称重，加入9倍体积匀浆介质，冰浴机械匀浆，2500rpm/min，离心10min，制备10％肝脏组织匀浆上清，测定TG含量。
如图5所示，NASH组小鼠肝脏组织中甘油三酯的含量显著增加，而与NASH诱导小鼠相比，NASH+LPJZ-658组小鼠肝脏组织中甘油三酯的含量显著减少。并且通过H&E和Oil RedO染色，如图6所示，可观察到NASH组小鼠肝脏组织中脂质堆积显著增加，而与NASH诱导小鼠相比，NASH+LPJZ-658组小鼠肝脏组织中脂质堆积显著减少。同时，通过Sirius Red染色，如图6所示，可观察到NASH组小鼠肝脏组织的纤维化程度显著增加，而与NASH诱导小鼠相比，NASH+LPJZ-658组小鼠肝脏组织的纤维化程度显著降低。
2.4对外周血中相关脂质含量的影响
收集每组每只小鼠新鲜血液，在室温下静置2小时，以2500rpm/min的转速，在4℃离心30min，收集血清，测定血清中甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(NEFA)、总胆固醇(T-CHO)和甘油(Glycerol)含量。
结果如图7-图10所示，LPJZ-658显著降低NASH诱导的小鼠外周血中脂质代谢指标中甘油三酯、游离脂肪酸、总胆固醇和甘油的含量。NASH组小鼠外周血中甘油三酯和甘油的含量显著升高，而与NASH诱导小鼠相比，NASH+LPJZ-658组小鼠外周血中甘油三酯、游离脂肪酸、总胆固醇和甘油的含量显著降低。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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