阅读说明：本技术 一种基于中药提取物的鸭天然免疫增强剂的制备方法 (Preparation method of duck natural immunopotentiator based on traditional Chinese medicine extract ) 是由 李国勤 卢立志 顾天天 田勇 陈黎 曾涛 沈军达 陶争荣 杜雪 徐坚 于 2019-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于中药提取物的鸭天然免疫增强剂的制备方法,包括以下步骤：(1)芦丁标准曲线的建立；(2)黄芪黄酮的提取；(3)黄芪黄酮的浓度计算。本发明提供的基于中药提取物的鸭天然免疫增强剂,可以显著升高鸭血清细胞因子IL-1β、IFN-α和IFN-β水平,上调鸭免疫器官肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊中天然免疫相关基因RIG-I、TLR3、TLR7、IFN-α、IFN-β、IL-1β和TNF-α、炎症相关基因COX2和iNOS、细胞凋亡相关基因Caspase3的组织表达水平,增强鸭天然免疫反应和抗病性能。(The invention discloses a preparation method of a duck natural immunopotentiator based on a traditional Chinese medicine extract, which comprises the following steps: (1) establishing a rutin standard curve; (2) extracting astragalus flavone; (3) and (4) calculating the concentration of the astragalus flavone. The duck natural immunopotentiator based on the traditional Chinese medicine extract provided by the invention can obviously increase the levels of duck serum cytokines IL-1 beta, IFN-alpha and IFN-beta, up-regulate the tissue expression levels of natural immunity related genes RIG-I, TLR3, TLR7, IFN-alpha, IFN-beta, IL-1 beta and TNF-alpha, inflammation related genes COX2 and iNOS, and apoptosis related gene Caspase3 in duck immune organs liver, spleen, thymus and bursa of fabricius, and enhance the natural immune response and disease resistance of ducks.)

一种基于中药提取物的鸭天然免疫增强剂的制备方法

技术领域

本发明属于农业技术领域，涉及一种基于中药提取物的鸭天然免疫增强剂的制备方法。

背景技术

随着我国畜牧业规模化、集约化养殖方式的高速发展，动物疾病的危害日趋严重，现已成为影响我国畜牧业健康发展的最大障碍。目前，免疫预防和药物治疗是防制动物疫病的主要手段，虽曾发挥重要作用，但随着近年来人们对动物产品药物残留和环保意识的日益增强，传统的动物疫病防治手段受到了极大挑战，促使人们不断探索新的防治技术。

动物的免疫系统分为两大类:适应性免疫系统和天然免疫系统。适应性免疫系统主要通过T淋巴细胞和B淋巴细胞特异性地识别入侵的病原并将其清除。而天然免疫系统主要通过模式识别受体识别病原，进而产生一系列的细胞因子抵抗病原入侵。其中,天然免疫系统作为抵御病原入侵和抗感染的第一道防线和激活后续适应性免疫的先决条件在整个免疫反应中发挥着十分重要的作用。近年来，人们已经越来越重视天然免疫这一抗感染的第一道防线以及模式识别受体在抗病原天然免疫中的作用，尤其是采用免疫增强剂增强动物机体天然免疫系统和模式识别受体信号通路中的某一环节的作用，提高动物的天然抗病能力成为国内外动物疫病防治领域的研究热点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于中药提取物的鸭天然免疫增强剂的制备方法。

其具体技术方案为：

一种基于中药提取物的鸭天然免疫增强剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)芦丁标准曲线的建立

准确称取芦丁标准品5.0mg，以质量浓度为70％乙醇稀释为不同浓度，于510nm处测定不同浓度芦丁溶液的吸光值，建立线性回归方程。

(2)黄芪黄酮的提取

将黄芪粉碎，过40目筛，精确称取10g，加入10倍量质量浓度为90％乙醇，水浴下热回流提取，冷却后过滤，将滤液定容至容量瓶中，测其吸光度。

(3)黄芪黄酮的浓度计算

根据建立的线性回归方程，计算黄酮浓度。

进一步，步骤2中，水浴的温度为75℃。

进一步，步骤2中，回流提取的时间为2小时。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明提供的基于中药提取物的鸭天然免疫增强剂，可以显著升高鸭血清细胞因子IL-1β、IFN-α和IFN-β水平，上调鸭免疫器官肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊中天然免疫相关基因RIG-I、TLR3、TLR7、IFN-α、IFN-β、IL-1β和TNF-α、炎症相关基因COX2和iNOS、细胞凋亡相关基因Caspase3的组织表达水平，增强鸭天然免疫反应和抗病性能。

具体实施方式

下面结合具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1.鸭天然免疫增强剂的制备

自化学组成和药理功效明确的某种中药中，提取和鉴定药理活性成分，用于制备鸭天然免疫增强剂。

2.试验动物分组与处理

选择同批出壳的1日龄雏鸭，适应性喂养7d后，随机分为试验组和对照组，每组20只。其中试验组雏鸭皮下注射合成的鸭天然免疫增强剂(2.0mg/羽)，对照组雏鸭皮下注射相同体积的生理盐水，连续3天。实验期间各组雏鸭自由采食、饮水。

3.样品采集

试验开始后第18天，颈静脉采集血液，室温下分离血清，-20℃冷冻保存；将试验鸭处死，采集肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊等组织器官，立即放入液氮中保存。

4.鸭天然免疫反应指标检测

(1)血清细胞因子和免疫球蛋白水平的检测

血清细胞因子IL-1β/12p40、IFN-α和IFN-β和免疫球蛋白IgG、IgA和IgM水平采用ELISA法测定。

(2)免疫组织器官中天然免疫相关基因的检测

肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊组织中天然免疫相关基因RIG-I、TLR3、TLR7、IFN-α、IFN-β、IL-1β和TNF-αmRNA表达水平的检测采用qRT-PCR方法。

(3)免疫组织器官中炎症相关基因的检测

肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊组织中炎症相关基因COX2和iNOS mRNA表达水平的检测采用qRT-PCR方法；COX2和iNOS蛋白质水平的检测采用Western Blot方法。

(4)免疫组织器官中细胞凋亡相关基因的检测

肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊组织中细胞凋亡相关基因Bcl2和Caspase3mRNA表达水平的检测采用qRT-PCR方法；、Bcl2和Caspase3蛋白质水平的检测采用Western Blot方法。

5.试验结果

(1)血清细胞因子和免疫球蛋白水平的检测

试验组和对照组鸭血清细胞因子IL-1β/12p40、IL-1β、IFN-α和IFN-β和免疫球蛋白IgG、IgA和IgM水平见表1和表2。

表1血清细胞因子水平

表2血清免疫球蛋白水平

由表1和表2可知，试验组鸭血清细胞因子IL-1β/12p40、IL-1β、IFN-α和IFN-β水平均显著高于对照组，而血清细胞因子IL-1β/12p40和免疫球蛋白IgA、IgG和IgM水平差异不显著。表明本发明提供的基于中药提取物的鸭天然免疫增强剂可以显著升高鸭血清细胞因子IL-1β、IFN-α和IFN-β水平，而对于血清细胞因子IL-1β/12p40及免疫球蛋白IgA、IgG和IgM水平无显著影响。

(2)免疫组织器官中天然免疫相关基因的检测

试验组和对照组鸭肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊组织中天然免疫相关基因RIG-I、TLR3、TLR7、IFN-α、IFN-β、IL-1β和TNF-αmRNA表达水平见表3～表6。

表3肝脏组织中天然免疫相关基因表达水平

表4脾脏组织中天然免疫相关基因表达水平

表5胸腺组织中天然免疫相关基因表达水平

表6法氏囊组织中天然免疫相关基因表达水平

由表3～表6可知，试验组鸭肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊组织中天然免疫相关基因RIG-I、TLR3、TLR7、IFN-α、IFN-β、IL-1β和TNF-αmRNA表达水平大多高于或显著高于对照组，表明本发明提供的基于中药提取物的的鸭天然免疫增强剂可以上调或显著上调鸭免疫器官组织中天然免疫相关基因的表达水平。

(3)免疫组织器官中炎症相关基因的检测

试验组和对照组鸭肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊组织中炎症相关基因COX2和iNOSmRNA与蛋白质表达水平见表7～表10。

表7肝脏组织中炎症相关基因COX2和iNOS mRNA和蛋白质表达水平

表8脾脏组织中炎症相关基因COX2和iNOS mRNA和蛋白质表达水平

表9胸腺组织中炎症相关基因COX2和iNOS mRNA和蛋白质表达水平

表10法氏囊组织中炎症相关基因COX2和iNOS mRNA和蛋白质表达水平

由表7～表10可知，试验组鸭肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊组织中炎症相关基因COX2和iNOS mRNA与蛋白质表达水平几乎全部(除脾脏和胸腺中iNOS mRNA外)高于或显著高于对照组，表明本发明提供的基于中药提取物的鸭天然免疫增强剂可以上调或显著上调鸭免疫器官组织中炎症相关基因COX2和iNOS mRNA与蛋白质表达水平。

(4)组织器官中细胞凋亡相关基因的检测

试验组和对照组鸭肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊组织中细胞凋亡相关基因Bcl2和Caspase3 mRNA与蛋白质表达水平见表11～表14。

表11肝脏组织中凋亡相关基因Bcl2和Caspase3mRNA和蛋白质表达水平

表12脾脏组织中凋亡相关基因Bcl2和Caspase3mRNA和蛋白质表达水平

表13胸腺组织中凋亡相关基因Bcl2和Caspase3mRNA和蛋白质表达水平

表14法氏囊组织中凋亡相关基因Bcl2和Caspase3mRNA和蛋白质表达水平

由表11～表14可知，试验组鸭肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊中的Caspase3基因mRNA与蛋白质表达水平均显著高于对照组，而试验组与对照组鸭Bcl2基因mRNA与蛋白质表达水平之间差异不显著。表明本发明提供的基于中药提取物的鸭天然免疫增强剂可以上调鸭免疫器官组织中细胞凋亡相关的Caspase3基因mRNA与蛋白质表达水平，而对Bcl2基因mRNA与蛋白质表达水平无显著影响。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。