阅读说明：本技术 黄芪甲苷在降低纳米氧化锌诱导的神经毒性中的应用 (Application of astragaloside IV in reducing neurotoxicity induced by nano zinc oxide ) 是由 梁泰刚 李青山 王丽伟 孙丽倩 闫超群 杨聪聪 梁马丹 段治宇 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了黄芪的主要成分之一黄芪甲苷的新用途,黄芪甲苷在降低纳米氧化锌诱导的神经毒性中的应用；经本发明试验表明黄芪甲苷能够通过诱导自噬来保护ZnONPs造成的神经细胞毒性,还能进一步通过PINK1/Parkin通路诱导线粒体自噬来保护受损的线粒体,逆转ZnONPs造成的细胞内ROS含量升高,MMP下降,钙离子稳态失衡以及线粒体质量的下降。本发明确定了黄芪对于纳米氧化锌造成的神经损伤的保护作用,以及确定了黄芪甲苷的神经损伤保护作用,通过体外实验对其保护作用机制进行探究,为神经保护类新药研发奠定基础。(The invention discloses a new application of astragaloside IV which is one of the main components of astragalus root, and the application of the astragaloside IV in reducing the neurotoxicity induced by nano zinc oxide; the experiment of the invention shows that the astragaloside IV can protect the nerve cell toxicity caused by ZnONPs by inducing autophagy, can further protect damaged mitochondria by inducing mitochondrial autophagy through a PINK1/Parkin pathway, and reverses the increase of intracellular ROS content, MMP reduction, calcium ion steady state unbalance and mitochondrial quality reduction caused by ZnONPs. The invention determines the protective effect of astragalus root on nerve injury caused by nano zinc oxide and the protective effect of astragaloside IV on nerve injury, explores the protective effect mechanism through in vitro experiments, and lays a foundation for the research and development of new neuroprotective drugs.)

黄芪甲苷在降低纳米氧化锌诱导的神经毒性中的应用

技术领域

本发明涉及黄芪甲苷的新用途，具体涉及一种黄芪甲苷在降低纳米氧化锌诱导的神经毒性中的应用。

背景技术

近年来，纳米氧化锌(ZnONPs)作为一种应用广泛的纳米材料被用于口腔医学材料、食品添加剂、皮肤用药、化妆品等领域。纳米氧化锌具有pH相关的离子释放特性，是最具毒性的金属氧化物纳米颗粒之一。在酸性条件下，纳米氧化锌更易溶解释放锌离子，因此，内吞的氧化锌颗粒处于溶酶体酸性囊泡中，可溶解释放锌离子，适量锌离子展现出一些积极地生理效应，而高浓度的纳米氧化锌进入细胞，会导致一些细胞毒害作用。人们被暴露于越来越多的纳米应用中，纳米氧化锌可通过皮肤、呼吸道或消化道进入生物体并在体内蓄积，但机体很难排除这类微小物质，因此存在一定的生物毒性，对其生物安全性的研究越来越得到重视。近年来研究发现，纳米氧化锌除对正常肝细胞、肺上皮细胞等细胞有毒性外，还能穿过动物BBB或经神经转运进入CNS，进而导致神经毒性效应。同时，体外实验也表明纳米氧化锌表现出显著的神经毒性，机制主要是诱导ROS产生、细胞凋亡、氧化损伤、炎症反应激活等。而课题组前期实验也表明，在多种纳米颗粒如纳米氧化铝、纳米氧化铁等难溶纳米颗粒中，纳米氧化锌表现出的离子释放效应使它表现出显著不同的神经毒性机制。

那么如何来保护神经免受纳米氧化锌诱导的神经毒性呢？经查阅相关文献我们发现，黄芪具有抗炎，抗氧化，抗衰老，抗病毒，提高机体免疫力等作用，黄芪可以提高大鼠脑组织中的过氧化物酶的活性，降低乳酸脱氢酶和NOS的活性，降低氧化应激产生的有害物质从而保护神经元；还可以通过p53、Bcl-2、JNK、ERK1/2等通路或者抑制某些蛋白(热休克蛋白，c-jun蛋白等)的表达来达到神经保护的作用。黄芪中主要含黄酮类，多糖类，皂苷类等多种化学成分。对小鼠应用黄芪甲苷后可以激活巨噬细胞，从而促进脂多糖诱生肿瘤坏死因子，并增强机体免疫力，减轻肿瘤坏死因子的毒副作用；黄芪甲苷可有效延缓机体细胞衰老过程，抑制炎症(如LPS)对单核细胞的损伤等作用，有研究表明黄芪甲苷可以通过激活p38/MAPK通路对过氧化氢导致的PC12细胞氧化应激损伤起到保护作用。目前，黄芪甲苷已被报道具有增强免疫功能、抗氧化、效延缓机体细胞衰老过程，抑制炎症等用途。许多药学研发人员都在进一步发掘其新用途，以充分利用黄芪的药用价值。目前，未见黄芪甲苷在神经保护类药物中的应用的研究报道。

发明内容

本发明提供了黄芪在降低纳米氧化锌诱导的神经毒性中的应用。

本发明采用CCK法检测SH-SY5Y细胞存活率，Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡；结果显示：黄芪与纳米氧化锌共同干预后发现，黄芪在10-80μg/mL时，对纳米氧化锌产生的细胞毒性具有明显的抑制作用。黄芪能够减少纳米氧化锌对于神经细胞造成的凋亡。纳米氧化锌可明显造成SH-SY5Y细胞产生毒性作用，黄芪对SH-SY5Y细胞无明显的细胞毒性，黄芪可以抑制纳米氧化锌产生的SH-SY5Y细胞毒性，减少细胞凋亡。表明黄芪具有降低纳米氧化锌诱导的神经毒性的作用。

本发明采用CCK8法检测SH-SY5Y细胞存活率：采用不同浓度的黄芪甲苷，黄芪多糖，毛蕊异黄酮检测对细胞存活率的影响，结果显示：单独纳米氧化锌(7μg/mL)存活率约为70.6％，黄芪甲苷(10，30μg/mL)干预后，存活率约为76.4％、80.6％；而黄芪多糖以及毛蕊异黄酮则对纳米氧化锌产生的神经细胞毒性没有表现出抑制作用。表明黄芪甲苷具有降低纳米氧化锌诱导的神经毒性的作用。

因此本发明提供了黄芪甲苷在降低纳米氧化锌诱导的神经毒性中的应用。

本发明采用Western blot法检测黄芪甲苷作用前后SH-SY5Y细胞内自噬相关蛋白的含量变化；结果显示，黄芪甲苷与纳米氧化锌共同作用能够使自噬诱导增强，且自噬程度在一定范围内随黄芪甲苷剂量增加而增加。采用免疫荧光染色观察浓度为3μg/mL的纳米氧化锌、30μg/mL的黄芪甲苷、二者共同干预对SH-SY5Y细胞LC3蛋白表达影响的免疫荧光染色结果显示，单独纳米氧化锌与单独黄芪甲苷都能够诱导自噬的发生，而两者共同作用自噬进一步增强。采用CCK8法检测黄芪甲苷与自噬抑制剂3-MA共同作用发现，细胞存活率明显下降；而与自噬诱导剂雷帕霉素共同作用，细胞存活率明显升高。表明黄芪甲苷的神经保护作用与自噬相关，且自噬起到的是保护作用。

本发明采用Western blot法，免疫荧光染色法观察黄芪甲苷作用前后线粒体自噬水平，结果表明，单独的纳米氧化锌与单独黄芪甲苷都能够诱导线粒体自噬的发生，而两者共同作用线粒体自噬进一步增强。

因此本发明提供了黄芪甲苷在通过诱导自噬以及线粒体自噬对纳米氧化锌造成的神经毒性产生保护作用中的应用。

还提供了黄芪甲苷在干预细胞内PINK1蛋白表达升高、胞浆内Parkin表达下调、线粒体内Parkin表达上调中的作用。

本发明还采用活性氧检测试剂盒测定细胞内ROS水平变化，NAO荧光法测定线粒体质量变化；JC-1检测线粒体膜电位，钙离子荧光探针检测细胞内钙离子水平，结果表明纳米氧化锌可造成SH-SY5Y细胞的线粒体质量下降；细胞内ROS水平升高，细胞内氧化-抗氧化平衡打破；钙稳态平衡打破；线粒体膜电位下降，影响细胞内正常功能，诱导产生细胞线粒体毒性，而黄芪甲苷能够逆转纳米氧化锌对线粒体产生的毒性，保护线粒体，维持细胞代谢正常。

因此本发明提供黄芪甲苷在逆转纳米氧化锌造成的细胞内线粒体质量下降、细胞内ROS水平升高，MMP的升高，钙离子稳态失衡中的应用。结合前面的结论，初步判断PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在黄芪甲苷保护纳米氧化锌诱导SH-SY5Y细胞毒性中起到的是保护作用。

综上所述，黄芪能够通过诱导自噬，抗凋亡以及降低细胞内ROS含量降低纳米氧化锌诱导产生的神经细胞毒性；黄芪中的有效成分黄芪甲苷能通过诱导自噬来保护神经细胞，进一步通过PINK1/Parkin诱导线粒体自噬来保护受损的线粒体，维持细胞代谢正常，从而达到保护纳米氧化锌产生的神经细胞毒性。

因此本发明提供黄芪甲苷在神经保护类药物中的应用。

与现有技术相比本发明具有以下有益效果：

黄芪具有明显的神经保护作用，且成剂量相关性；黄芪甲苷具有明显的神经保护作用，且成剂量相关性；黄芪甲苷能够通过诱导自噬以及PINK1/parkin介导的线粒体自噬来保护纳米氧化锌造成的神经毒性。黄芪甲苷能够逆转纳米氧化锌诱导的神经细胞ROS含量的升高，以及线粒体质量下降，线粒体膜电位下降，钙离子稳态失衡，呈明显的剂量相关；黄芪甲苷能够随时间延长对纳米氧化锌造成的神经损伤产生保护作用；本发明对黄芪甲苷发现了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域；黄芪甲苷药理效果好，且毒性低，预示着有良好的药用前景。

附图说明

图1为实施例1纳米氧化锌和黄芪单独作用以及共同作用对SH-SY5Y细胞存活率的影响。(A)单独纳米氧化锌对SH-SY5Y细胞存活率的影响；(B)相同浓度条件下，单独黄芪，黄芪+纳米氧化锌(7μg/mL)共同作用对SH-SY5Y细胞存活率的影响。

图2为实施例1黄芪在降低纳米氧化锌引起的SH-SY5Y细胞凋亡中的作用。

图3为实施例2黄芪甲苷(ASIV)，黄芪多糖(APS)，毛蕊异黄酮(Calycosin)单独作用以及与纳米氧化锌共同作用时对SH-SY5Y细胞存活率的影响。(A)黄芪甲苷(ASIV)，黄芪多糖(APS)，毛蕊异黄酮(Calycosin)单独作用对对SH-SY5Y细胞存活率的影响；(B)相同浓度条件下，单独APS，APS+纳米氧化锌(7μg/mL)共同作用对SH-SY5Y细胞存活率的影响；(C)相同浓度条件下，单独ASIV，ASIV+纳米氧化锌(7μg/mL)共同作用对SH-SY5Y细胞存活率的影响；(D)相同浓度条件下，单独Calycosin，Calycosin+纳米氧化锌(7μg/mL)共同作用对SH-SY5Y细胞存活率的影响。

图4为实施例3不同浓度黄芪甲苷在降低纳米氧化锌引起的SH-SY5Y细胞毒性中对自噬相关蛋白p62，LC3 II，Beclin1表达的影响。

图5为实施例3黄芪甲苷(30μg/mL)在不同时间与纳米氧化锌共同作用时对SH-SY5Y细胞中自噬相关蛋白p62，LC3 II表达的影响。

图6为实施例3自噬抑制剂3-MA，自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)与黄芪甲苷和纳米氧化锌共同作用时对SH-SY5Y细胞存活率的影响。(A)3-MA与黄芪甲苷和纳米氧化锌共同作用时对SH-SY5Y细胞存活率的影响；(B)Rapamycin与黄芪甲苷和纳米氧化锌共同作用时对SH-SY5Y细胞存活率的影响。

图7为实施例3黄芪甲苷(30μg/mL)与纳米氧化锌(5μg/mL)单独作用及共同作用时，LC3免疫荧光的变化。

图8为实施例4不同浓度黄芪甲苷在降低纳米氧化锌引起的SH-SY5Y细胞毒性中对线粒体自噬相关蛋白PINK1，mito-parkin，cyto-parkin表达的影响。

图9为实施例4黄芪甲苷(30μg/mL)与纳米氧化锌(5μg/mL)单独作用及共同作用时，PINK1免疫荧光的变化。

图10为实施例4Mito-Tracker Green标记的线粒体和Alexa Fluor 555荧光二抗标记的LC3蛋白共定位。

图11为实施例4Mito-Tracker Green标记的线粒体与Lyso-Tracker Red标记的溶酶体共定位。

图12为实施例5不同浓度黄芪甲苷在降低纳米氧化锌造成的SH-SY5Y线粒体损伤中的作用。(A)NAO荧光法检测线粒体质量变化；(B)Fluo-4钙离子荧光探针检测细胞内钙离子浓度；(C)JC-1荧光探针检测线粒体膜电位变化；(D、E)DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平变化。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实例1

黄芪对ZnONPs诱导的神经毒性有保护作用

采用CCK法检测SH-SY5Y细胞存活率，Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡：具体如下，采用不同浓度的ZnONPs(0-7μg/mL，8个浓度)，不同浓度的黄芪(0，10，30，50，80，100，200μg/mL)；纳米氧化锌(7μg/mL)与不同浓度黄芪共同，作用于SH-SY5Y细胞24h，检测对细胞存活率的影响。选择有保护作用的黄芪浓度(30，80μg/mL)与纳米氧化锌(6μg/mL)干预细胞24h，检测细胞凋亡情况。实验结果如图1A所示，图中，标号AM为黄芪，不同浓度的ZnONPs作用于细胞24h后，对细胞产生明显的抑制作用，当纳米氧化锌在7μg/mL时，细胞存活率约65％，8μg/mL时，存活率仅43％。如图1B所示，黄芪作用于细胞24h后，对细胞没有抑制作用，黄芪200μg/mL时，细胞存活率约113.5％；黄芪与ZnONPs共同干预后发现，黄芪在10-80μg/mL时，对ZnONPs产生的细胞毒性具有明显的抑制作用。流式细胞术检测细胞凋亡结果如图2所示，单独黄芪30μg/mL，80μg/mL对神经细胞的凋亡基本没有明显抑制作用，单独ZnONPs 6μg/mL，凋亡率为26.28％，而30μg/mL，80μg/mL黄芪干预后，凋亡率分别降为21.74％、20.3％，表明黄芪能够减少ZnONPs对于神经细胞造成的凋亡。ZnONPs可明显造成SH-SY5Y细胞产生毒性作用，黄芪对SH-SY5Y细胞无明显的细胞毒性，黄芪可以抑制ZnONPs产生的SH-SY5Y细胞毒性，减少细胞凋亡。

实例2

黄芪甲苷对ZnONPs诱导的神经毒性有保护作用

采用CCK8法检测SH-SY5Y细胞存活率：具体如下，实施方法同实例1，采用不同浓度的黄芪甲苷，黄芪多糖，毛蕊异黄酮(0，1，10，30，50，100，200，300μg/mL，8个浓度)，检测对细胞存活率的影响；选择细胞存活率大于80％的浓度范围(0-30μg/mL)进行保护实验，实施方法同实例1。实验结果如图3A所示，不同浓度的黄芪甲苷，黄芪多糖，毛蕊异黄酮作用于细胞24h后，对细胞产生明显的抑制作用，当黄芪甲苷，黄芪多糖，毛蕊异黄酮在30μg/mL时，细胞存活率分别约85.3％、96.8％、83.7％，而300μg/mL时，细胞存活率分别约69.4％、42.8％、42.6％。选择三种成分浓度为1-30μg/mL时与ZnONPs(7μg/mL)共同干预神经细胞，如图3B、C、D所示，作用细胞24h后，当黄芪甲苷浓度为10-30μg/mL时，表现出对于神经毒性的抑制作用，单独ZnONPs(7μg/mL)存活率约为70.6％，黄芪甲苷(10，30μg/mL)干预后，存活率约为76.4％、80.6％；而黄芪多糖以及毛蕊异黄酮则对ZnONPs产生的神经细胞毒性没有表现出抑制作用。

实例3

黄芪甲苷能够诱导自噬

采用Western blot法检测黄芪甲苷作用前后SH-SY5Y细胞内自噬相关蛋白的含量变化：具体如下，选择具有保护作用的黄芪甲苷(30μg/mL)在不同时间(0，3，6，9，12h)与ZnONPs(5μg/mL)共同作用细胞，用Western blot法观察细胞内自噬蛋白的含量变化；根据筛选出的自噬程度较强的时间，用不同浓度的黄芪甲苷(10，15，30μg/mL)，ZnONPs(5μg/mL)，二者共同作用，分别干预神经细胞，用Western blot法观察细胞内自噬蛋白的含量变化。如图4所示，通过Western blot检测LC3型别转换，p62的变化发现，与单独ZnONPs作用相比，细胞内p62表现出下调的趋势，LC3-Ⅱ型表达上调，Beclin1表现出上调的趋势，证明黄芪甲苷与ZnONPs共同作用能够使自噬诱导增强，且自噬程度在一定范围内随黄芪甲苷剂量增加而增加。如图5所示，随着黄芪甲苷加入的时间延长，LC3-Ⅱ型表达上调，p62表达下降，表明自噬程度在黄芪甲苷加入24h时自噬程度最明显。

图6A所示，从Western blot结果可看出，0.5mM(前期实验表明，基本不引起凋亡)的3-MA对纳米氧化锌引起的细胞自噬有明显的抑制作用。从CCK-8试剂盒检测结果看出，与单独纳米氧化锌组比，纳米氧化锌与3-MA的联合处理使细胞存活率下降。图6B所示，0.1nM(前期实验表明，基本不引起凋亡)雷帕霉素可以增强纳米氧化锌诱导SH-SY5Y细胞发生的自噬，根据CCK-8的实验结果可知，纳米氧化锌与0.1nM雷帕霉素的联合处理与相同浓度纳米氧化锌单独处理细胞相比，可以明显提高细胞增殖活性。

采用免疫荧光染色观察浓度为3μg/mL的ZnONPs、30μg/mL的黄芪甲苷、二者共同干预对SH-SY5Y细胞LC3蛋白表达影响的免疫荧光染色结果如图7所示。正常状态下，细胞中LC3主要以LC3-I的形式存在于胞浆中，呈弥散状态；自噬形成时，胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3-II)，呈点状分布。与对照组相比，单独ZnONPs以及黄芪甲苷使细胞中的红色荧光从从弥散状转变为点状聚集，且荧光强度增强明显；而二者共同干预时，红色荧光点状聚集相比单独作用增多，与Western blot结果结合，进一步表明，单独ZnONPs与单独黄芪甲苷都能够诱导自噬的发生，而两者共同作用自噬进一步增强。结合之前的结果初步判断，黄芪甲苷的神经保护作用与自噬相关，且自噬起到的是保护作用。

实例4

黄芪甲苷能够诱导线粒体自噬

采用Western blot法，免疫荧光染色法观察黄芪甲苷作用前后线粒体自噬水平，实施方法同实例3，图8所示，各组细胞的总PINK1，胞浆Parkin，线粒体Parkin的表达水平如图所示，采用Image J软件对每个Western blot结果条带进行灰度值分析。结果表明，细胞胞浆中Parkin水平下降，线粒体中Parkin水平上调。细胞内PINK1的水平在纳米氧化锌处理后呈现出上升的趋势，且与对照组相比具有统计学差异。

浓度为3μg/mL的ZnONPs、30μg/mL的黄芪甲苷、二者共同干预对SH-SY5Y细胞线粒体自噬影响的免疫荧光染色结果如图9所示。从免疫荧光结果看出，单独ZnONPs、黄芪甲苷、二者共同干预处理后的细胞与对照组相比，图9所示，细胞PINK1蛋白表达影响的免疫荧光染色结果表明，细胞中红色荧光二抗标记的PINK1蛋白表达增多，荧光强度增强，荧光斑点数量增多；图10所示，Mito-Tracker Green标记的线粒体和Alexa Fluor 555荧光二抗标记的LC3蛋白共定位后可叠加出黄色荧光斑点，证实含线粒体的自噬体的发生；图11所示，Mito-Tracker Green标记的线粒体的绿色荧光从弥散网状变成分散点状，且与Lyso-Tracker Red标记的溶酶体所呈现的红色荧光线粒体荧光强度和数量也有所增加，出现了绿色荧光和红色荧光的共定位现象，呈现红色荧光的溶酶体包裹绿色荧光的线粒体并呈现出黄色荧光斑点，表示线粒体自噬体已经与溶酶体融合，并逐渐开始降解。与Western blot结果结合，进一步表明，单独ZnONPs与单独黄芪甲苷都能够诱导线粒体自噬的发生，而两者共同作用线粒体自噬进一步增强。

实例5

黄芪甲苷对ZnONPs导致的线粒体损伤有保护作用

采用活性氧检测试剂盒测定细胞内ROS水平变化，NAO荧光法测定线粒体质量变化；JC-1检测线粒体膜电位，钙离子荧光探针检测细胞内钙离子水平，具体如下：用ZnONPs(4μg/mL)与不同浓度的黄芪(10，15，30μg/mL)共同作用SH-SY5Y细胞24h，检测对细胞内线粒体变化的影响。如图12A所示，采用NAO荧光法检测线粒体质量发现，ZnONPs单独处理神经细胞24h时，细胞内线粒体质量相对于对照组下降约10％，而加入黄芪甲苷(10、15、30μg/mL)共同作用后，线粒体质量上升分别约2.8％、2.9％、8.9％，且随着黄芪甲苷剂量增加而增加。如图12B所示，采用Fluo-4钙离子荧光探针检测细胞内钙离子浓度发现，ZnONPs单独处理神经细胞24h时，细胞内钙离子浓度相对于对照组下降约6.0％，钙离子外流，而加入黄芪甲苷(10、15、30μg/mL)共同作用后，钙离子内流，细胞内钙离子相对于单独ZnONPs组上升分别约13.0％、7.6％、6.8％。如图12C所示，采用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位发现，ZnONPs单独处理神经细胞24h时，细胞内线粒体膜电位相对于对照组约3.6％，而加入黄芪甲苷(10、15、30μg/mL)共同作用后，线粒体膜电位相对于单独ZnONPs分别上升约2.4％、5.7％、9.1％，且随着黄芪甲苷剂量增加而增加。如图12D、E所示，采用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平发现，ZnONPs单独处理神经细胞24h时，细胞内ROS水平相对于对照组上升约82.8，而加入黄芪甲苷(10、15、30μg/mL)共同作用后，ROS水平先上升后下降，分别与单独ZnONPs比上升55.35、下降30.89、26.39。表明ZnONPs可造成SH-SY5Y细胞的线粒体质量下降；细胞内ROS水平升高，细胞内氧化-抗氧化平衡打破；钙稳态平衡打破；线粒体膜电位下降，影响细胞内正常功能，诱导产生细胞线粒体毒性，而黄芪甲苷能够逆转ZnONPs对线粒体产生的毒性，保护线粒体，维持细胞代谢正常。结合前面的结论，初步判断PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在黄芪甲苷保护纳米氧化锌诱导SH-SY5Y细胞毒性中起到的是保护作用。

总之，黄芪能够降低纳米氧化锌诱导产生的神经细胞毒性；黄芪中的有效成分黄芪甲苷能通过诱导自噬来保护神经细胞，进一步通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬来保护受损的线粒体，维持细胞代谢正常，从而达到保护纳米氧化锌产生的神经细胞毒性。