阅读说明：本技术 制备水性透明质酸凝胶的方法 (Method for preparing aqueous hyaluronic acid gel ) 是由 F·贝尔泰恩 A·盖里 C·塞卡尔迪 于 2018-05-17 设计创作，主要内容包括：根据第一方面,本发明涉及制备水性透明质酸凝胶的方法,其包括以下步骤：a)制备交联水性透明质酸凝胶,b)通过压延均质化步骤(a)中形成的所述水性凝胶,c)中和步骤(b)中均质化的所述水性凝胶。根据第二方面,本发明还涉及能够通过这种方法获得的水性透明质酸凝胶。根据第三方面,本发明进一步涉及这种水性凝胶在修复或重建组织,特别是用于填充皱纹和细纹中的美容用途,或所述水性凝胶用于组织修复或重建的医疗用途。(According to a first aspect, the present invention relates to a process for preparing an aqueous hyaluronic acid gel, comprising the steps of: a) preparing a cross-linked aqueous hyaluronic acid gel, b) homogenizing the aqueous gel formed in step (a) by calendering, c) neutralizing the aqueous gel homogenized in step (b). According to a second aspect, the invention also relates to an aqueous hyaluronic acid gel obtainable by such a method. According to a third aspect, the invention further relates to the cosmetic use of such an aqueous gel in the repair or reconstruction of tissue, in particular for filling wrinkles and fine lines, or the medical use of said aqueous gel for tissue repair or reconstruction.)

制备水性透明质酸凝胶的方法

技术领域

本发明涉及制备均质水性透明质酸凝胶的方法，由此获得的水性凝胶及其用途，特别是用于填充皱纹和细纹的用途。

背景技术

长期以来，胶原蛋白一直是选择用于面部的填充产品，特别是用于填充皱纹和细纹，或者用于重塑唇部。但是，随着透明质酸的销售，越来越多地使用透明质酸。实际上，除了胶原蛋白的生物降解性(被认为太快)之外，还存在与其动物(牛或猪)来源有关的安全性问题。

注射透明质酸具有两个优点：即时的机械填充作用和由于其生物相容性而没有炎症现象。当以线性(非交联)形式施用时，透明质酸具有优异的生物相容性，但会很快被机体降解(约一周内)。通过使用交联透明质酸，可以将基于透明质酸的注射产品的寿命显著延长至约12个月。实际上，交联透明质酸是具有粘弹性的内聚凝胶的形式，其特别有利地用于皱纹填充产品。

但是，在交联期间，透明质酸凝胶内会形成“硬区”颗粒，使其非均质。这些硬区影响产品的可注射性，并且容易引起患者的耐受性问题。因而，必须从交联透明质酸凝胶中消除这些硬区，以便获得其用于施用的完全均质的产品。常规地，通过筛分或挤出将交联透明质酸凝胶均质化。这些方法仅允许部分消除硬区。另外，施加在凝胶上的剪切应力导致其结构和其粘弹性的劣化。因此，经过筛分、过滤或挤出的凝胶不是完全均质的，并且粘度降低。一旦注射，它就有迁移到组织中并更快地降解的风险。因此，其填充性能下降。

因此，需要获得一种方法，该方法能够有效地消除交联透明质酸凝胶中存在的硬区，从而获得均质凝胶而不会劣化其粘弹性。

因此，本发明提出了制备均质交联透明质酸凝胶的方法，其中该凝胶的均质化通过压延(roll)获得。

特别地，根据第一方面，本发明的一个主题是制备水性透明质酸凝胶的方法，其包括以下步骤：

a)制备水***联透明质酸凝胶，

b)通过压延均质化步骤(a)中形成的所述水性凝胶，

c)中和步骤(b)中均质化的所述水性凝胶。

根据第二方面，本发明的另一个主题是能够通过该方法获得的水性透明质酸凝胶。

根据第三方面，本发明的另一个主题是这种水性凝胶在修复或重建组织，特别是用于填充皱纹和细纹中的美容用途，或所述水性凝胶用于修复或重建组织的医疗用途。

附图说明

图1示出了在以相同切线速度旋转的两个辊之间进行的凝胶压延。

图2示出了在三个辊之间进行的凝胶压延，这些辊的切线速度增加以使凝胶能够夹带在相邻辊的表面上。

图3、4和5示出了在示例性实施方案中制备的水性凝胶组合物3、4和5的喷射力。

水性凝胶

本发明提出了制备水性透明质酸凝胶的新方法。

为了本申请的目的，“凝胶”应理解为是指内聚组合物，其在其自身重量下不会流动，并且具有赋予其一定变形性的粘弹性。如果凝胶被剪切，它不会像粘性流体那样重新形成。

因此，根据本发明的透明质酸凝胶不同于透明质酸溶液。凝胶/溶液的区别可以通过在25℃下的应变和恒定频率下的流变研究来观察，以便测定线性粘弹性区域中的粘性模量G”和弹性模量G’。具体地，在本发明的含义内，凝胶的特征特别在于以下事实：其弹性模量G’大于根据Winter和Chambon(1986)定义的粘性模量G”。另一方面，在粘性溶液的情况下，粘性模量G”大于其弹性模量G’。

根据连续模式(在25℃下，10％应变，频率1Hz，持续120s)，在Discovery HR1(TAIndustries)流变仪和40mm板/板几何结构上进行测量。将约1.2ml的样品沉积在1000μm的间隙中。

根据本发明的透明质酸凝胶优选是均质的。为了本发明的目的，“均质透明质酸凝胶”应理解为是指交联透明质酸均匀地分散在凝胶内。

特别地，透明质酸凝胶的均质性可以通过测量通过注射器喷射凝胶的力的变化来表征，该注射器的针的内径为300μm(27G TSK UTW)。喷射力(或挤出力)的测量通过配备50NCell的Shimadzu EZ-Test SX测力平台进行。挤出以10mm.min^-1进行，并且采样设置为100点.s^-1。使用配备1/2"TSK 27G针的长1ml BD注射器进行测试。在挤出的第20-第140秒进行采集，以不考虑挤出开始和结束时的接触应力。在采集结束时，将一系列点N＝f(t)(挤出力作为时间的函数)线性化。描绘出相对于线性度的裕度为±10％。曲线N＝f(t)与线性化N＝f(t)直线N+10％＝f(t)和N-10％＝f(t)的每个交点对应于异质部分的挤出。

因此，根据一个优选实施方案，相对于线性挤出力，均质透明质酸凝胶的挤出力变化不超过±10％。

透明质酸

根据本发明的水性凝胶包括至少一种透明质酸。

透明质酸是线性糖胺聚糖(GAG)，其由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺重复单元通过交替的β-1,4和β-1,3糖苷键结合在一起组成。

透明质酸具有以下结构：

优选地，在制备根据本发明的水性凝胶中使用的透明质酸的摩尔质量为1000000Da-5000000Da，优选为1500000Da-3500000Da。特别地，分子量可以通过WatersGPCV Alliance 2000排阻色谱，洗脱剂：0.1M NaNO₃溶于水，与三个Wyatt检测器(折光仪、粘度计和光散射测量仪)耦合串联来测定。

透明质酸以1mg/ml-300mg/ml，优选75-200mg/ml，更优选100-175mg/ml的含量存在于步骤a)中获得的水性透明质酸凝胶中。

水相

除透明质酸外，根据本发明的水性凝胶还包括水相。

相对于组合物的总重量，该凝胶可包含含量为60重量％-99重量％，优选为70重量％-99重量％，并且优选为80重量％-99重量％的水。

该凝胶可进一步包含在环境温度(25℃)下可与水混溶的多元醇，特别是选自具有2-20个碳原子，优选具有2-10个碳原子，更优选具有2-6个碳原子的多元醇，诸如丙三醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、二丙二醇、二甘醇；二醇醚(特别是具有3-16个碳原子)，诸如单，二或三丙二醇(C1-C4)烷基醚、单，二或三乙二醇(C1-C4)烷基醚；及它们的混合物。

相对于组合物的总重量，可与水混溶的多元醇可以0.1重量％-20重量％，优选为3重量％-15重量％的含量存在于本发明的凝胶中。

制备水***联透明质酸凝胶

根据本发明的方法实施制备水***联透明质酸凝胶的第一步骤a)。

该步骤a)优选至少包括在至少一种交联剂存在下，在酸或碱介质中将所述透明质酸交联。

根据一个具体实施方案，该交联在碱介质中进行且至少包括以下步骤：

-将至少一种透明质酸和/或至少一种其盐溶解在pH大于7.5，优选大于或等于10，更优选为10-14的碱溶液中，

-在至少一种交联剂存在下，在碱溶液中将所述透明质酸交联。

在碱介质中的交联有利于在透明质酸和交联剂之间形成醚键，该键缓慢降解。

根据另一个具体实施方案，该交联在酸介质中进行且至少包括以下步骤：

-将至少一种透明质酸和/或至少一种其盐溶解在pH小于6.5，优选小于或等于5，更优选为4.5-2的酸溶液中，

-在至少一种交联剂存在下，在酸溶液中将所述透明质酸交联。

在酸介质中的交联本身有利于在透明质酸和交联剂之间形成酯键，该酯键比醚键降解得更快。

根据一个优选实施方案，将透明质酸交联的步骤至少包括在碱介质中将透明质酸交联和在酸介质中将透明质酸交联，以控制形成的醚键和酯键，以及如此形成的交联透明质酸凝胶的降解速率。

更优选地，将透明质酸交联的步骤包括首先在碱介质中将透明质酸交联，随后在酸介质中将透明质酸交联。

在溶解之前，在根据本发明的方法中使用的透明质酸典型地为干燥形式，优选为粉末或薄片形式。

当以盐形式使用时，透明质酸可以优选为透明质酸的钠盐、钙盐、锌盐或钾盐，并且优选为钠盐。

溶解在水溶液中的线性透明质酸的含量(对应于步骤a)中的透明质酸的含量)为50mg/ml-300mg/ml，优选为100-200mg/ml。

溶解在水溶液中的线性透明质酸的交联在至少一种交联剂存在下进行。

该交联剂优选选自双官能环氧化物、多官能环氧化物、双官能或多官能酯、二乙烯基砜、碳二亚胺、甲醛、二醛及它们的混合物，优选地，该交联剂是1,4-丁二醇二缩水丙三醇醚(BDDE，也称为1,4-二缩水丙三醇氧基丁烷、四亚甲基二醇二缩水丙三醇醚和IUPAC名称2-[4-(环氧乙烷-2-基甲氧基)丁氧基甲基]环氧乙烷)。

在交联步骤中，相对于加入的每克线性透明质酸，加入的交联剂的量特别为10mg-250mg。

该交联步骤优选在30℃-70℃，优选在45℃-55℃的温度下进行，这使得可以催化透明质酸的交联。

通过压延均质化

然后，在本发明方法的范围内，将步骤a)中制备的水***联透明质酸凝胶通过压延均质化，以消除硬区(在交联期间形成的聚集体)，而不会降低凝胶的机械和粘弹性能。

特别地，压延包括在至少两个反向旋转辊之间，优选三个反向旋转辊之间的连续压缩。

例如，进料辊可以以0.1m.s^-1-5m.s^-1，优选0.5m.s^-1-3m.s^-1的切线速度旋转。

如图1所示，当在两个辊之间进行压延时，它们优选以相同的切线速度旋转，并且将凝胶加入两个辊之间。

当在三个辊之间进行压延时，应增加各个辊的切线速度，以能够将凝胶夹带到第二辊的表面上，从而在第二和第三辊之间进行第二压延。举例来说，如图2所示，如果第一辊以切线速度×1旋转，则第二辊可以以该切线速度×2旋转，而第三个辊可以以该切线速度×3旋转，以能够加倍压延凝胶。

根据一个优选实施方案，反向旋转辊之间的间隔(也称为间隙)为20μm-1mm，优选为20μm-100μm。

优选地，辊可以由不锈钢制成，以便能够容易地被清洁，并且任选地设置有微孔或陶瓷涂层，以能够促进凝胶对辊表面的粘附。

根据一个优选实施方案，通过压延而均质化的步骤b)进行1分钟-2小时，优选15分钟-45分钟。在本发明的范围内，只要在中和步骤c)之前(这导致所述水性凝胶溶胀)进行使水性凝胶均质化的步骤b)，则可以使用这些相对较短的压延时间。具体而言，在溶胀之前，待通过压延而均质化的水性凝胶的体积比溶胀之后显著减小。

纯化

根据一个具体实施方案，特别是在不通过透析进行中和的情况下，可以在中和水性凝胶的步骤c)之前或之后纯化水***联透明质酸凝胶，以消除痕量的残留交联剂。

根据一个优选实施方案，纯化优选在上述条件下通过透析进行。

除了消除残留交联剂外，通过透析纯化使得可以进一步精制中和后获得的pH并控制凝胶的渗透压。

纯化可导致透明质酸的新稀释。纯化后凝胶中存在的交联透明质酸的含量为1mg/ml-60mg/ml，优选为5-50mg/ml。

中和

通过压延均质化后，在步骤c)期间将水性透明质酸凝胶中和。

通过将pH调节至6.5-7.5的pH来进行中和。该中和可以通过添加酸或碱来进行，这取决于交联是否在碱或酸介质中进行。

中和导致透明质酸的稀释。中和后凝胶中存在的交联透明质酸的含量为10mg/ml-100mg/ml，优选为20-80mg/ml。

例如，当已经在酸介质中进行交联时，可以通过添加诸如氢氧化铵、氢氧化钠、碳酸氢钠、小苏打、碳酸钠或其衍生物或磷酸盐缓冲溶液(PBS“磷酸盐缓冲盐水”)的化合物来调节pH。

当已经在碱介质中进行交联时，可以通过添加诸如盐酸、乙酸、磷酸和磷酸二氢钠或其衍生物的化合物来进行用于中和的pH调节。

或者，中和可以通过透析进行。通过透析来中和使得能够以非常渐进的方式调节pH，这使得可以最佳地保持所形成的透明质酸凝胶的机械和粘弹性能。

透析是用于分离溶液中分子或离子的膜分离过程。因此，在本申请的上下文中，可以将根据本发明的透明质酸凝胶用pH等于或接近透明质酸凝胶所需的最终pH(目标pH)，即6.5-7.5，优选6.75-7.2的缓冲溶液透析。

例如，该缓冲溶液可以是磷酸盐缓冲盐水(PBS，PBS-乳酸)溶液、三(羟甲基)甲胺(TRIS)溶液、TRIS盐溶液(TBS)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)溶液、2-{[三(羟甲基)-甲基]-氨基}乙磺酸(TES)溶液、3-(N-吗啉代)-丙烷-磺酸(MOPS)溶液、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)溶液、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸(PIPES)溶液以及氯化钠(NaCl)溶液。

根据一个优选实施方案，缓冲溶液是由“酸”盐NaH₂PO₄、“碱”盐Na₂HPO₄和NaCl组成的PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液。

根据一个具体实施方案，该缓冲液是生理上可接受的，即当注射根据本发明的透明质酸凝胶或使其与组织接触时，其不存在不耐受或毒性的风险。

根据本发明的一个具体实施方案，可以在一个或几个浴中用如上所述的缓冲溶液进行透析。

根据一个更优选实施方案，可以在多个连续浴中用具有不同pH值的缓冲溶液进行透析，该缓冲溶液的pH值越来越接近透明质酸溶液所需的最终pH(目标pH)。因此，可以根据所用缓冲浴的数量更逐步地增加pH。

根据一个优选实施方案，为了同时控制透明质酸凝胶的渗透压，可以将用于透析的缓冲液与所谓的中性盐(即不与缓冲液相互作用的中性盐，特别是盐浓度达到280mOsmol.l^-1-380mOsmol.l^-1的组织渗透压的钠盐(NaCl)或钾盐(KCl))组合。

特别地，该缓冲溶液的渗透压可以为250-350mOsm/l，优选为280-330mOsm/l。

在本发明的上下文中，中和步骤c)导致交联透明质酸凝胶溶胀。通常，相对于步骤a)中获得的水***联透明质酸凝胶的体积，该溶胀特别地导致透明质酸凝胶的体积增加2-4倍。

在本发明范围内，重要的是，在压延步骤b)之前，该溶胀(因而该中和)不开始或开始得很小，以能够使用足够窄的间隙(20μm-1mm)，以便有效消除硬区(在交联期间形成的聚集体)，而不会降低凝胶的机械和粘弹性能。

具体地，如果同时进行压延(例如，如文献US2013/0217872中所述的)，或者在中和之后并且因此在凝胶溶胀之后进行压延，则压延机的辊之间的间隔必须显著增大以允许占据更大体积的溶胀凝胶通过。辊之间的这种大于1mm的间隔不再能有效地消除存在于凝胶中的硬区，以确保其优异的均质性和可注射性。在这种情况下，文献US2013/0217872没有描述可注射的透明质酸凝胶，并且也没有寻求通过压延来消除凝胶中存在的硬区。在该文献中，压延使得能够混合中和的凝胶18-24h的非常长的时间，以实现溶胀平衡。

为了使通过根据本发明的方法获得的凝胶具有良好的可注射性，优选该凝胶不含直径大于1mm，优选大于20μm的硬区。

线性透明质酸

根据具体的实施方案，可以在制备水***联透明质酸凝胶的步骤(a)之后添加线性透明质酸，以降低凝胶的粘度并因此调节其机械性能，特别是减小凝胶的喷射力并促进注射器的填充。

线性透明质酸的加入可以在上述通过压延进行均质化的步骤b)，中和(稀释)步骤c)或纯化步骤之前或之后进行。根据优选的实施方案，线性透明质酸的加入可以在上述纯化步骤之前或之后进行。

交联透明质酸凝胶中加入的线性透明质酸的量优选小于或等于在中和和任选纯化后存在于凝胶中的交联透明质酸的量，以便不进一步稀释透明质酸。

特别地，纯化后凝胶中存在的交联透明质酸的含量为0.1mg/ml-100mg/ml，优选为1mg-50mg/ml。

其它聚合物

根据一个具体实施方案，水性透明质酸凝胶还包含至少一种透明质酸以外的其他聚合物，诸如软骨素、纤维素、藻酸盐、聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、胶原蛋白、丝、PTFE及它们的衍生物。

可以在将透明质酸交联之前，在步骤a)期间加入其它聚合物，或在制备水***联透明质酸凝胶的步骤a)之后，特别是在通过压延进行均质化的步骤b)之前加入其它聚合物，以使透明质酸与其他聚合物发生共交联。

例如，可以以0.1％-5％，优选0.5％-4％的含量加入其它聚合物。

可注射组合物

根据优选的实施方案，根据本发明的方法制备的水性凝胶是可注射的。

就本发明而言，可注射凝胶应理解为是指凝胶形式的组合物，其具有令人满意的可注射性(或注射性，即由于通过针头进入注射器的流动或多或少令人满意而易于注射)，特别是能够通过具有内径约等于300μm的针头的注射器注射。为了本申请的目的，从流变学角度考虑，可注射的凝胶优选具有小于或等于10000Pa.s的粘度且损失系数(Tanδ)为0.01-5。

流变测量(G’，G”和Tanδ)根据连续模式(在25℃下，10％应变，频率为1Hz，持续120s)，在Discovery HR1(TA Industries)流变仪和40mm板/板几何结构上进行。将约1.2ml的样品沉积在1000μm的间隙中。

最大粘度测量在动态模式下进行(角频率为0.1-100rad.s^-1)。将约1.2ml的样品沉积在1000μm的间隙中。

因而，根据本发明的方法制备的水性凝胶可以装在注射器中，以能够被注射到组织中。

因此，根据另一方面，本发明的主题是注射器，其含有如上所述的根据本发明的方法制备的凝胶。这种注射器特别旨在用于填充皱纹或细纹。

根据该实施方案，可以在填充注射器之前进行脱气以消除任何可能的气泡。

用途

在一个具体实施方案中，根据本发明获得的水性凝胶旨在用于修复或重建组织。

特别地，根据本发明的水性凝胶可用于形成或替代生物组织，例如作为植入物；或填充生物组织，例如注射入骨软骨或关节；或用于填充机体或面部的空腔，诸如皱纹或细纹；用于创建或增加人体或面部的体积；或用于皮肤愈合。

根据其他具体实施方案，可以将根据本发明的水性凝胶用于：

-外科手术，特别是器官修复或美容手术或医学，

-泌尿外科，特别是用于治疗尿失禁，

-传染病学，特别是作为疫苗的载液，

-眼科，特别是用于角膜愈合，

-牙科，特别是用于植入牙齿植入物或用于骨修复，

-整形外科，特别是在骨膜中用于创造体积，

-在治疗性细胞或双重作用因子向量化的范围内，进行细胞治疗或组织工程，

或血管学。

根据本发明的水性凝胶也可用于风湿病。

有利地，根据本发明的水性凝胶也可用作活性成分，特别是治疗活性成分(诸如细胞、疫苗或胰岛素或***类型的激素)，更通常用于所有活性成分的载体，其控制和/或延长释放或递送具备优势。

本发明还涉及根据本发明的水性凝胶用于治疗或对抗皮肤衰老的美容用途。

以下实施例旨在说明本发明，而不以任何方式限制其范围。

实施例

根据以下方法制备根据本发明的水性透明质酸凝胶(组合物1)：

将透明质酸(HTL,法国)完全溶解在碱性磷酸盐缓冲溶液(300mOsmol^-1，pH＝12.9，Merck，法国)中，以获得150mg.ml^-1的最终透明质酸浓度。

缓慢添加20重量％的BDDE(SA，法国)溶液。然后，将混合物在50℃加热，直到质地不再改变并且混合物被染成黄色。

然后，使用EXAKT 50i G-Line三辊磨机(Exakt，德国)压延获得的凝胶。

当压延结束时，添加酸性磷酸盐缓冲溶液(472mOsmol.l^-1,pH＝1.59)以中和反应混合物并将凝胶稀释至32.5mg.ml^-1的透明质酸浓度。

然后，将凝胶用磷酸盐缓冲液(300mOsmol.l^-1,pH 7.4,Merck,法国)透析。当达到中性时，停止透析。最后，添加4％(w/w)的25mg.ml^-1透明质酸溶液(HTL，法国)。然后，将酸性凝胶置于1ml注射器(BD，长1ml)中，然后通过高压灭菌来灭菌(121℃、持续15min)。

除了未进行的压延步骤之外，还根据相同的方法制备了对比水性透明质酸凝胶(组合物2)。

通过测量喷射力证实了压延对凝胶均质性的影响。在通过注射器和针头挤出产品期间，喷射力越稳定，凝胶越均质。

测量上述制备的水性凝胶组合物1和2的喷射力。这些测量结果如图3和4所示。

对于根据本发明的组合物1，观察到喷射力的优异稳定性(图3)。另一方面，对于未压延、未筛分且未研磨的组合物2(对比)，观察到喷射力的巨大变化，其相对于线性化N＝F(t)挤出力的±10％裕度超出数倍。

还测量了水***联透明质酸凝胶的商业化组合物Teosyal Ultradeep(组合物3)的喷射力，其制造方法使用如专利申请US 2013/0237615中所述的筛分/研磨步骤。该测量的结果示于图5中。在喷射期间观察到喷射力的大幅变化，这表明凝胶的异质性。