具有针对屎肠球菌的溶菌能力的新型抗细菌蛋白efal-2
阅读说明：本技术 具有针对屎肠球菌的溶菌能力的新型抗细菌蛋白efal-2 (Novel antibacterial protein EFAL-2 having bacteriolytic ability against enterococcus faecium ) 是由 尹圣君 康明松 俊苏云 金钟铉 郑奇慕 孙杰苏 白邢岩 康桑贤 于 2018-01-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种来源于噬菌体Ent-FAP-4(登录号：KCTC 12854BP)的抗细菌蛋白EFAL-2,所述抗细菌蛋白EFAL-2具有杀死屎肠球菌的能力和以SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列,一种含有所述抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分的药物组合物,以及一种使用所述药物组合物来预防或治疗屎肠球菌导致的疾病的方法。(The present invention relates to an antibacterial protein EFAL-2 derived from bacteriophage Ent-FAP-4 (accession number: KCTC 12854BP), said antibacterial protein EFAL-2 having an ability to kill enterococcus faecium and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:2, a pharmaceutical composition comprising said antibacterial protein EFAL-2 as an active ingredient, and a method for preventing or treating diseases caused by enterococcus faecium using said pharmaceutical composition.)
技术领域
本发明涉及一种具有针对屎肠球菌(Enterococcus faecium)的溶菌能力的抗细菌蛋白，以及一种使用含有所述抗细菌蛋白作为活性成分的组合物来预防或治疗屎肠球菌感染的方法。具体而言，本发明涉及一种抗细菌蛋白EFAL-2，所述抗细菌蛋白EFAL-2具有杀死屎肠球菌的能力和以SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列，并且所述抗细菌蛋白EFAL-2使用噬菌体Ent-FAP-4(登录号：KCTC 12854BP)的遗传信息来开发，一种含有所述抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分的药物组合物，以及一种使用所述药物组合物来预防或治疗屎肠球菌感染的方法。
背景技术
肠球菌(Enterococcus)是驻留在胃肠道和***中的兼性厌氧革兰氏阳性菌。正如所报道，肠球菌属有大约19个种，包括粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)和铅黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)，在这些种中粪肠球菌和屎肠球菌可以作为导致实际感染的主要菌种。过去，粪肠球菌导致的感染是非常常见的。然而，最近，相对而言屎肠球菌导致的感染有所增加。
肠球菌的毒性相对较弱，因此不会在正常人中导致疾病。然而，肠球菌会在老年人、免疫缺陷患者、慢性潜在疾病患者或住院患者中导致各种机会性感染，诸如泌尿道感染、伤口感染、菌血症和心内膜炎。此外，肠球菌可以通过基因杂交从外部获得致病因子，从而导致感染性疾病。泌尿道感染是肠球菌导致的最常见的感染，其次是伤口感染。心内膜炎可以作为肠球菌导致的其他主要感染，并且5％至20％的细菌性心内膜炎是肠球菌导致的。
同时，抗生素(诸如氨基糖苷、头孢菌素、克林霉素和半合成青霉素制备物)通常被用于肠球菌治疗。然而，对这些抗生素的耐药性细菌的观察经常有所报道。已知肠球菌通过获得新DNA(质粒、转座子)或使用突变来获得对抗生素的耐药性。具体而言，当已经获得对氨基糖苷的耐药性的肠球菌导致心内膜炎或严重感染时，因为不能杀死肠球菌，治疗难以成功。据报道，就万古霉素耐药性肠球菌(VRE)导致的菌血症而言，死亡率达到67％。在1986年，首次在法国报道了VRE对万古霉素具有耐药性。在韩国，在1992年首次分离VRE。在美国，从1988年首次分离VRE以来，来自NNIS(美国国家院内感染监控(National NosocomialInfection Surveillance))的数据显示，在1990年和1997年期间1％至15％的分离的肠球菌是VRE，并且VRE的比率从1999年的25％增加至2003年的28.5％。近年来，VRE的出现在欧洲、美国、亚洲(包括韩国)和大洋洲的全球范围内有所增加。因此，迫切需要开发可以用于预防或治疗抗生素耐药性肠球菌感染的药物。
最近，使用噬菌体作为针对细菌感染性疾病的对策已引起相当大的关注。具体而言，噬菌体的使用由于具有针对抗生素耐药性细菌的极好抗细菌活性而受到更大的关注。噬菌体是感染细菌的非常小的微生物，通常简单地称为“噬体(phage)”。一旦噬菌体感染细菌，该噬菌体即可在细菌细胞内部增殖。在增殖之后，噬菌体的子代会破坏细菌细胞壁，并从作为宿主的细菌中逃出，这表明噬菌体具有杀死细菌的能力。噬菌体感染细菌的方式通过其非常高的特异性来表征，以致于感染特定细菌的噬菌体的类型数量是有限的。也就是说，某些噬菌体可以仅感染特定细菌，这表明某些噬菌体可以赋予仅针对特定细菌的抗细菌作用。
为了克服这种抗细菌活性范围相对较窄的困难，已提出了使用在噬菌体表现出针对细菌的抗细菌作用时实际发挥作用的抗细菌蛋白的方法。噬菌体来源的抗细菌蛋白称为细胞溶素或内溶素。通常，噬菌体来源的抗细菌蛋白可以提供与作为其宿主噬菌体相比更宽的抗细菌活性范围。
与常规抗生素相比，噬菌体或噬菌体来源的抗细菌蛋白对细菌菌种具有高特异性。也就是说，它们不会影响除目标细菌菌种之外的细菌菌种。噬菌体和噬菌体来源的抗细菌蛋白的细菌特异性提供了仅针对目标细菌的抗细菌作用(溶菌能力)，不影响环境中或动物中的共生细菌。通常，已经广泛用于细菌治疗的常规抗生素会同时影响若干细菌类型。这会导致诸如环境污染和动物的正常菌群紊乱的问题。相比之下，噬菌体或噬菌体来源的抗细菌蛋白仅针对特定细菌发挥作用，以致于噬菌体或噬菌体来源的抗细菌蛋白的使用不会导致身体中正常菌群的紊乱。所以，与抗生素的使用相比，噬菌体或噬菌体来源的抗细菌蛋白的使用是非常安全的，并且使用导致的副作用的可能性相对而言非常低。
发明内容
技术问题
因此，本发明人使用本发明人分离的噬菌体的遗传信息提供了可以杀死肠球菌中的屎肠球菌(它们是有害的病原菌)的抗细菌蛋白。此外，本发明人提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有所开发的抗细菌蛋白作为活性成分，并且被用于预防或治疗屎肠球菌感染，以及一种使用所述药物组合物来有效地用于预防或治疗屎肠球菌感染的方法。
因此，本发明的一个目的是提供一种抗细菌蛋白EFAL-2，所述抗细菌蛋白EFAL-2具有杀死屎肠球菌的能力和以SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列，并且所述抗细菌蛋白EFAL-2使用噬菌体Ent-FAP-4(登录号：KCTC 12854BP)的遗传信息来开发。
因此，本发明的另一个目的是提供一种有效地制造来源于噬菌体Ent-FAP-4(登录号：KCTC 12854BP)的抗细菌蛋白EFAL-2的方法，所述抗细菌蛋白EFAL-2具有杀死屎肠球菌的能力和以SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列。
本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗屎肠球菌感染的药物组合物，所述药物组合物含有来源于噬菌体Ent-FAP-4的抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供一种使用药物组合物来预防屎肠球菌感染的方法，所述药物组合物含有来源于噬菌体Ent-FAP-4的抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供一种使用药物组合物来治疗屎肠球菌感染的方法，所述药物组合物含有来源于噬菌体Ent-FAP-4的抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分。
技术方案
为了实现上述目的，本发明的发明人致力于使用由本发明人从自然界分离的长尾病毒科噬菌体Ent-FAP-4(登录号：KCTC 12854BP)的遗传信息来开发抗细菌蛋白EFAL-2，所述抗细菌蛋白EFAL-2具有以SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列和针对屎肠球菌的极好的溶菌能力，所述长尾病毒科噬菌体Ent-FAP-4具有杀死屎肠球菌的能力。本发明人还开发了一种有效地制造所述抗细菌蛋白EFAL-2的方法，并且最终开发了一种药物组合物，所述药物组合物含有所述抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分，并且用于预防或治疗屎肠球菌感染的目的，从而完成本发明。
因此，根据本发明的一个方面，本发明提供具有针对屎肠球菌的溶菌能力的抗细菌蛋白EFAL-2的氨基酸序列。具体而言，所述抗细菌蛋白EFAL-2具有以SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列，并且编码所述抗细菌蛋白EFAL-2的基因优选地具有以SEQ ID NO:1表示的碱基序列。可以杀死屎肠球菌的抗细菌蛋白EFAL-2包含324个氨基酸并且具有约35.7kDa的分子量。
显然，本领域的技术人员可以使用已知的技术来部分修饰以SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列。这些修饰包括氨基酸序列的部分置换、氨基酸序列的部分添加和氨基酸序列的部分缺失。然而，最优选的是应用如本发明所公开的以SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列。
本说明书中所用的术语“基因”意指涵盖DNA(gDNA和cDNA)分子和RNA分子二者的基因。核苷酸是基因中的基本组成单元，它不仅包括天然的核苷酸，而且还包括具有经修饰的糖或碱基部分的类似物(Chemical Reviews 90:543-584,1990(《化学评论》，第90卷：第543-584页，1990年))。
此外，本发明提供了大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10-pBAD-EFAL-2，它是不能产生具有以SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列抗细菌蛋白EFAL-2的经转化的大肠杆菌菌株。本发明人开发了大肠杆菌TOP10-pBAD-EFAL-2，然后在2016年12月27日保藏于韩国典型培养物保藏中心(登录号：KCTC 13177BP)。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种含有抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分的药物组合物，所述抗细菌蛋白EFAL-2具有以SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列和针对屎肠球菌的溶菌能力，并且所述抗细菌蛋白EFAL-2可以有效地用于预防屎肠球菌感染或在屎肠球菌感染之后进行治疗的目的。药物组合物的实例可以包括杀菌剂或抗生素，但是不限于此。
在含有根据本发明的抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分的药物组合物中含有抗细菌蛋白EFAL-2，具有以本发明的SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的抗细菌蛋白EFAL-2具有针对屎肠球菌的溶菌能力。因此，抗细菌蛋白EFAL-2在屎肠球菌导致的疾病(诸如泌尿道感染、伤口感染、菌血症和心内膜炎)的预防(感染的预防)或治疗(感染的治疗)方面是有效的。所以，本发明的药物组合物可以用于预防或治疗屎肠球菌导致的疾病的目的。在本说明书中屎肠球菌导致的疾病统称为泌尿道感染、伤口感染、菌血症和心内膜炎。
在本说明书中屎肠球菌与它是对常规抗生素敏感的细菌，还是具有对常规抗生素的耐药性的耐药性细菌无关。也就是说，是否获得对常规抗生素的耐药性并不重要。
在本说明书中，术语“预防(prevention或prevent)”表示(i)阻断屎肠球菌的感染；以及(ii)阻断屎肠球菌感染导致的疾病的发展。
在本说明书中，术语“治疗(treatment或treat)”表示(i)抑制屎肠球菌导致的疾病；以及(ii)缓解屎肠球菌导致的疾病的所有作用。
含有根据本发明的抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分的药物组合物中包含的药学上可接受的载剂是通常用于制备药物制剂的载剂，所述载剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、***橡胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但是不限于此。除了上述成分之外，含有根据本发明的抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分的药物组合物还可以另外包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、矫味剂、乳化剂、混悬剂和防腐剂。
含有根据本发明的抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分的药物组合物可以施用或喷涂于疾病部位，或可以口服或肠胃外施用于该部位。肠胃外施用可以使用静脉内施用、腹膜内施用、肌肉内施用、皮下施用或局部施用来进行。
含有根据本发明的抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分的药物组合物的适当施用、喷涂和剂量可以根据诸如以下因素而变化：配制方法、施用方式、受试动物或患者的年龄、体重、性别和患病状况、饮食、施用时间、施用途径、***率和反应性。普通的熟练内科医生或兽医可以容易地确定和规定用于所期望的治疗的有效剂量。
通常，含有根据本发明的抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分的药物组合物含有0.0001％至10％(w/v或w/w)、优选地0.001％至1％(w/v或w/w)、最优选地0.1％(w/v或w/w)的根据本发明的抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分。
含有根据本发明的抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分的药物组合物可以根据可由本发明所属领域的普通技术人员容易地进行的方法使用药学上可接受的载剂和/或赋形剂以单位剂型配制或在多剂量容器中配制。制剂可以是油或水溶性介质中的溶液剂、混悬剂或者乳剂、提取物、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂的形式。还可以另外包含分散剂或稳定剂。
含有根据本发明的抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分的药物组合物可以根据使用目的制备为杀菌剂或抗生素，但不限于此。在本说明书中，术语“抗生素”统称为防腐剂、杀细菌剂和抗细菌剂。
出于此目的，可以将赋予针对其他细菌菌种的抗细菌活性的抗细菌材料添加至本发明的药物组合物，以改善其有效性。此外，可以将来源于其他类型的噬菌体的抗细菌蛋白(内溶素)(它具有针对屎肠球菌的抗细菌活性)添加至其中。可以适当组合来源于噬菌体的抗细菌蛋白，以使抗细菌作用最大化，因为所述抗细菌蛋白针对屎肠球菌的抗细菌活性可以在其强度或展示类型方面彼此不同。
有益效果
使用含有根据本发明的抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分的药物组合物来预防或治疗屎肠球菌感染的方法，与基于抗生素的常规方法相比，可以具有非常高的针对屎肠球菌的特异性，所述抗细菌蛋白EFAL-2来源于噬菌体Ent-FAP-4(登录号：KCTC 12854BP)，并且具有以SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列。这意味着，药物组合物可以用于预防或治疗屎肠球菌感染，而不影响其他有用的共生细菌，并且具有较少的根据其使用的副作用。通常，当使用抗生素时，还会伤害共生细菌，因此必然伴有由于其使用的副作用。
附图说明
图1是示出噬菌体Ent-FAP-4的电子显微照片；
图2是示出抗细菌蛋白EFAL-2的分离和纯化过程的电泳照片，其中第M泳道是蛋白质大小标记物，第1泳道是纯化前的样品，第2泳道是纯化期间的穿过色谱柱的溶液，第3至9泳道是纯化的级分；
图3示出了抗细菌蛋白EFAL-2针对屎肠球菌的抗细菌活性(溶菌活性)的结果，其中透明部分是由于抗细菌蛋白EFAL-2的抗细菌活性(溶菌活性)而产生的。以及
图4示出了降浊测定的实验结果，其中阴性对照是不含抗细菌蛋白EFAL-2的缓冲液，横轴是时间(min)，纵轴是600nm下的吸光度。
具体实施方式
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，实施例仅仅是本发明的实施例，并且本发明的范围不限于这些实施例。
实施例1：能够杀死屎肠球菌的噬菌体的分离
从自然界收集样品，以分离能够杀死屎肠球菌的噬菌体。同时，本发明人已预先分离用于噬菌体分离的屎肠球菌，并将其鉴定为屎肠球菌。
在下文中详细地描述了噬菌体的分离程序。将收集的样品添加至TSB(胰蛋白酶大豆培养液)培养基(酪蛋白消化物，17g/L；大豆消化物，3g/L；葡萄糖，2.5g/L；NaCl，5g/L；磷酸氢二钾，2.5g/L)中，以1/1,000的比率接种屎肠球菌，然后在37℃下振荡培养3至4小时。在培养完成后，以8,000rpm进行离心20min，并回收上清液。以1/1000的比率用屎肠球菌接种所回收的上清液，然后在37℃下振荡培养3至4小时。当样品含有噬菌体时，重复上述程序总共5次，以充分增加噬菌体的数量(滴定度)。在重复所述程序5次后，将培养液以8,000rpm离心20min。在离心后，使用0.45μm过滤器来过滤所回收的上清液。将所得的滤液用于典型点板测定，以检查其中是否包含能够杀死屎肠球菌的噬菌体。
如下所述进行点板测定：以1/1,000的比率用屎肠球菌接种TSB培养基，然后在37℃下振荡培养过夜。将3ml(OD600为1.5)上述制备的屎肠球菌培养液涂布于TSA(胰蛋白酶大豆琼脂：酪蛋白消化物，15g/L；大豆消化物，5g/L；NaCl，5g/L；琼脂，15g/L)平板上。将涂布的平板放置于干净的工作台上约30min，从而使涂布的溶液干燥。在干燥后，将10μl所制备的滤液点在屎肠球菌涂布的平板上。将滤液放置约30min以干燥。在干燥之后，将平板在37℃下固定培养一天，然后检查滴加滤液位置处的亮区产生。就产生亮区的滤液而言，可以判断其中包含能够杀死屎肠球菌的噬菌体。通过上述检查，可以获得含有具有杀死屎肠球菌能力的噬菌体的滤液。
从上述确认具有能够杀死屎肠球菌的噬菌体的滤液分离纯噬菌体。使用常规噬菌斑测定来分离纯噬菌体。详细地讲，使用灭菌吸头来回收在噬菌斑测定过程中形成的噬菌斑，然后将所述噬菌斑添加至屎肠球菌的培养液中，然后在37℃下培养4至5小时。在培养后，以8,000rpm进行离心20min以获得上清液。将屎肠球菌培养液以1/50的体积比添加至所得的上清液，然后在37℃下培养4至5小时。为了增加噬菌体的数量，重复上述程序至少5次。然后，以8,000rpm进行离心20min，以获得最终上清液。使用所得的上清液进一步进行噬菌斑测定。通常，纯噬菌体的分离不是通过程序的一次重复完成的，所以使用上述形成的所得噬菌斑来重复上述程序。在重复该程序至少5次之后，获得含有纯噬菌体的溶液。通常重复纯噬菌体的分离程序直到所产生的噬菌斑在大小和形态方面彼此类似。此外，使用电子显微镜检查来确认纯噬菌体的最终分离。直到使用电子显微镜检查确认纯噬菌体的分离，即可重复上述程序。根据常规方法来进行电子显微镜检查。简而言之，将含有纯噬菌体的溶液添加到铜载网上，然后用2％乙酸铀酰进行负染色并干燥。然后使用透射电子显微镜来观察纯噬菌体的形态。所分离的纯噬菌体的电子显微照片如图1所提供。根据形态特征，确认新分离的噬菌体属于长尾病毒科噬菌体。
使用上述确认的含有纯噬菌体的溶液来进行以下纯化过程。将屎肠球菌培养液以基于噬菌体溶液的总体积计1/50的体积比添加至含有纯噬菌体的溶液，然后进一步培养4至5小时。在培养后，以8,000rpm进行离心20min以获得上清液。重复该程序总共5次以获得含有足够数量的噬菌体的溶液。使用0.45μm过滤器来过滤从最终离心步骤获得的上清液，然后进行常规聚乙二醇(PEG)沉淀过程。具体而言，将PEG和NaCl添加至100ml滤液中直到达到10％PEG 8000/0.5M NaCl，然后将所述滤液放置在4℃下2至3小时。其后，以8,000rpm进行离心30min，以获得噬菌体沉淀物。将所得的噬菌体沉淀物悬浮于5ml缓冲液(10mM Tris-HCl，10mM MgSO4，0.1％明胶，pH8.0)中。所得的材料称为噬菌体悬浮液或噬菌体溶液。
结果，收集上述纯化的纯噬菌体，将其命名为噬菌体Ent-FAP-4，并在2015年6月23日保藏于韩国典型培养物保藏中心(登录号：KCTC 12854BP)。
实施例2：噬菌体Ent-FAP-4的基因组的序列分析以及抗细菌蛋白的序列的获得
如下所述分离噬菌体Ent-FAP-4的基因组。使用与实施例1中相同的方法从所获得的噬菌体悬浮液分离基因组。首先，为了除去悬浮液中包含的屎肠球菌的DNA和RNA，将200UDNA酶I和RNA酶A中的每者添加至10ml噬菌体悬浮液中，然后放置在37℃下30min。在放置30min之后，为了终止DNA酶I和RNA酶A活性，将500μl 0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)添加至其中，然后放置10min。此外，将所得的混合物进一步放置在65℃下10min，然后将100μl蛋白酶K(20mg/ml)添加至其中，以破坏噬菌体的外壁，然后在37℃下反应20min。其后，将500μl10％十二烷基硫酸钠(SDS)添加至其中，然后在65℃下反应1小时。在反应1小时之后，将10ml苯酚:氯仿:异戊醇(以25:24:1的组分比混合)的溶液添加至反应溶液中，然后充分混合。此外，将所得的混合物以13,000rpm进行离心15min，从而分离各层。在分离的层中，选择上层，将异丙醇以1.5的体积比添加至其中，然后以13,000rpm离心10min以沉淀基因组。在回收沉淀物之后，将70％乙醇添加至沉淀物中，然后以13,000rpm离心10min以洗涤沉淀物。回收经洗涤的沉淀物，将其真空干燥，然后溶解于100μl水中。重复该程序从而获得大量噬菌体Ent-FAP-4的基因组。
使用所获得的基因组通过首尔大学(Seoul National University)的韩国国家环境管理仪器中心(National Instrumentation Center for Environmental Management)的illumina Mi-Seq设备进行下一代测序分析，从而获得噬菌体Ent-FAP-4的基因组序列信息。从所获得的噬菌体Ent-FAP-4的基因组序列，使用NCBI GLIMMER和BLAST来预测噬菌体Ent-FAP-4的抗细菌蛋白对应的基因序列。在抗细菌蛋白的预测基因序列中，将除信号肽对应的部分之外的其余部分的基因序列(975bp)用于针对来源于噬菌体Ent-FAP-4的抗细菌蛋白的重组制备技术的开发。除信号肽对应的部分之外的所用的抗细菌蛋白的基因序列以SEQ ID NO:1表示。作为参考，以SEQ ID NO:1表示的基因序列对应的抗细菌蛋白的氨基酸序列(由324个氨基酸残基组成)以SEQ ID NO:2表示。
作为所获得的氨基酸序列与其他已知的噬菌体来源的抗细菌蛋白序列比较的结果，来源于噬菌体Ent-FAP-4并且具有以SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的抗细菌蛋白仅与来源于耐久肠球菌的自溶素(WP_016176409.1)(它不是噬菌体)同源，并且同源度非常低，为57％。这表明，具有以SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的抗细菌蛋白是新型抗细菌蛋白，该抗细菌蛋白的功能迄今为止尚未有所报道。该新型抗细菌蛋白被命名为EFAL-2。
此外，根据以下事实：不同类型的来源于噬菌体的抗细菌蛋白通常提供不同的抗细菌性质，可以判断具有以SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的抗细菌蛋白EFAL-2可以提供不同于过去报道的其他噬菌体来源的抗细菌蛋白的抗细菌作用。
实施例3：抗细菌蛋白EFAL-2的表达质粒的构建
对于抗细菌蛋白EFAL-2的产生，构建了抗细菌蛋白EFAL-2的表达质粒。用实施例2中确认的抗细菌蛋白EFAL-2的基因进行PCR(聚合酶链式反应)，使用Nco I和Not I限制性酶位点克隆至pBAD-TOPO载体(Invitrogen)。出于此目的，除去pBAD-TOPO载体中存在的肠激酶切割位点，***Not I限制性酶位点，然后进行克隆，从而构建所需的物质，其后该物质可用于PCR克隆。此外，在克隆之后使用定点诱变试剂盒(iNtRON Biotechnology,Inc.)来调整起始密码子，通过上述程序来最终构建抗细菌蛋白EFAL-2的表达质粒。所构建的抗细菌蛋白EFAL-2的表达质粒被命名为pBAD-EFAL-2。pBAD-EFAL-2的核苷酸序列以SEQ ID NO:3表示。使用pBAD-EFAL-2转化大肠杆菌TOP10以构建抗细菌蛋白EFAL-2的产生菌株，该产生菌株被命名为TOP10-pBAD-EFAL-2。所构建的抗细菌蛋白EFAL-2的产生菌株TOP10-pBAD-EFAL-2在2016年12月27日保藏于韩国典型培养物保藏中心(登录号：KCTC 13177BP)。
实施例4：抗细菌蛋白EFAL-2的制备
具有以SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的抗细菌蛋白EFAL-2的制备如下文所述。在本实施例中，将大肠杆菌TOP10-pBAD-EFAL-2(登录号：KCTC 13177BP)(它是经转化的大肠杆菌菌株，由本发明人在2016年12月27日保藏于韩国典型培养物保藏中心(登录号：KCTC13177BP))作为产生菌株。
用大肠杆菌TOP10-pBAD-EFAL-2接种(添加20μl)含有浓度为50μg/ml的卡那霉素的20mL LB培养基(胰蛋白胨，10g/L；酵母提取物，5g/L；氯化钠，10g/L)，然后在37℃下振荡培养过夜。第二天，针对OD600(600nm下的吸光度)以1/100的体积比添加培养液，该培养液含有1L LB培养基(含有浓度为50μg/ml的卡那霉素)，在培养箱中培养过夜。培养在200rpm、5L/min通气和37℃的条件下进行。根据600nm下的吸光度，当细胞浓度达到1.8至2.0时，将培养温度降至16℃，并将L-***糖添加至其中，使最终浓度为0.2％，从而诱导具有以SEQID NO:2表示的氨基酸序列的抗细菌蛋白EFAL-2的表达。在诱导表达之后，在16℃下进行过夜培养。在培养完成时，回收细胞培养液并在4℃下以7,000rpm离心10min，从而回收细胞沉淀物。将所回收的细胞沉淀物悬浮于50mM Tris-盐酸(Tris-HCl，pH7.0)缓冲液中，每克细胞沉淀物20ml Tris-盐酸。将所制备的细胞悬浮液进行超声处理，以使细胞破碎。超声的施加条件包括重复以下过程：施加超声波3秒以破坏细胞然后停止3秒，总共15min。所述施加在冰浴状态下进行。在细胞破碎之后，将破碎细胞的溶液在4℃下以13,000rpm进行离心20min，以回收上清液。通过典型的阳离子交换色谱纯化过程来纯化所获得的上清液。纯化过程简述如下。将5ml HiTrapTM SP FF(GE Healthcare)作为阳离子交换树脂。在用缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH7.0)预平衡柱子之后进行色谱分离，将样品滴加到柱子上，使10CV(柱体积)的缓冲液A以5ml/min的流速流动，从而进行洗涤。在洗涤之后，以5ml/min的流速进行色谱分离，以使得从缓冲液A至缓冲液B(50mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.0)的浓度梯度在0％至100％的范围内。在该过程中，实现了具有以SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的目标抗细菌蛋白EFAL-2的洗脱。使用电泳进行的纯化的抗细菌蛋白EFAL-2的分析结果如图2所示。
在所获得的纯化的级分中，收集含有高浓度的抗细菌蛋白EFAL-2的级分(图2中的第5泳道、第6泳道和第7泳道对应的纯化的级分)，并使用缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.0)进行透析，从而进行介质交换。从而，获得纯度为90％或更高的抗细菌蛋白EFAL-2溶液。
实施例5：通过点板测定进行的抗细菌蛋白EFAL-2的抗细菌活性研究
本发明人通过典型的点板测定研究了抗细菌蛋白EFAL-2的抗细菌活性。针对5个屎肠球菌菌株、4个粪肠球菌菌株、3个金黄色葡萄球菌菌株、5个沙门氏菌属菌株和7个大肠杆菌菌株进行实验。细菌由抗微生物剂耐药性微生物培养物保藏中心(CCARM；首尔女子大学第一科学馆429号，首尔市芦原区孔陵2洞126号(No.429 of First Science Hall inSeoul Women’s University,126 Gongneung 2-dong,Nowon-gu,Seoul))或美国的美国典型培养物保藏中心(ATCC)分发，或由本发明人分离，然后进行鉴定。
在实验方法中，将2ml每种细菌培养液(在TSB培养基中600nm下的吸光度为约1)涂布于不同的平板上，干燥，并在培养箱中在37℃下培养7小时。在确认细菌生长之后，将10μl抗细菌蛋白EFAL-2溶液(EFAL-2浓度为1mg/ml)滴加到每个平板上。将不含有EFAL-2的缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.0)作为阴性对照滴加。在点板之后，在培养箱中在37℃下进行培养约30min至1小时，并观察每种细菌的溶菌度。结果，抗细菌蛋白EFAL-2具有仅针对屎肠球菌的抗细菌活性(溶菌能力)，并且不具有针对其他菌种的抗细菌活性。确认所有待测试屎肠球菌目标(5个菌株)的针对屎肠球菌的抗细菌活性。屎肠球菌目标的代表性实验结果如图3所示。
从这些结果可以确认，抗细菌蛋白EFAL-2可以提供针对屎肠球菌的极好的溶菌能力，并且可以有效地用于预防或治疗屎肠球菌导致的感染性疾病。
实施例6：通过降浊测定进行的抗细菌蛋白EFAL-2的抗细菌活性研究
使用抗细菌蛋白EFAL-2溶液通过降浊测定来研究抗细菌蛋白EFAL-2的抗细菌活性。待测试的细菌与实施例5的细菌相同。
降浊测定的实验方法如下。在将待测试的细菌悬浮于生理盐水，以使得600nm下的吸光度为约0.6至0.7之后，将0.1ml抗细菌蛋白EFAL-2溶液(EFAL-2浓度：40μg/ml)添加至0.9ml悬浮液(最终EFAL-2浓度：4μg/ml)中，然后测量600nm下的吸光度30min。使用不含有抗细菌蛋白EFAL-2的缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.0)作为阴性对照。
实验结果为，抗细菌蛋白EFAL-2表现出仅针对屎肠球菌的溶菌活性，但是不具有针对待测试的其他细菌的溶菌活性。屎肠球菌的代表性实验结果如图4所示。可以确认，在通过降浊测定进行的抗细菌蛋白EFAL-2的抗细菌活性研究中，非常迅速地表现出抗细菌蛋白EFAL-2的抗细菌活性。可以说，这种抗细菌活性的迅速表现是任何常规抗生素不能提供的特征。
实施例7：抗细菌蛋白EFAL-2在预防屎肠球菌感染中的应用实施例
向含有9ml营养培养液(牛肉提取物，3g/L；蛋白胨，5g/L)的管添加100μl浓度为约1mg/ml的抗微生物蛋白EFAL-2溶液。在对照实验中，作为抗细菌蛋白EFAL-2溶液的替代，将100μl营养培养液添加至含有9ml具有相同的组成的培养基的管。最后，将屎肠球菌的培养液添加至其中，以使得600nm下的吸光度为约0.5，并且将所得的物质转移到37℃的培养箱中，然后进行振荡培养，以观察屎肠球菌的生长状态。从表1中所示的结果可以观察到，就已添加抗细菌蛋白EFAL-2溶液的管而言，屎肠球菌能够非常好地生长，足以确保60min后600nm下的吸光度为约1.4。然而，就已添加抗细菌蛋白EFAL-2溶液的管而言，600nm下的吸光度从10min后的约0.1逐渐减小至60min的约0.05。
[表1]
屎肠球菌的生长抑制(OD600吸光度值)
上述结果表明，本发明的抗细菌蛋白EFAL-2不仅抑制屎肠球菌的生长，而且还具有杀死屎肠球菌的能力。所以，可以得出以下结论：抗细菌蛋白EFAL-2可以用作用于预防屎肠球菌感染的组合物的活性成分。
实施例8：抗细菌蛋白EFAL-2对屎肠球菌感染的治疗作用研究
使用抗细菌蛋白EFAL-2溶液来研究抗细菌蛋白EFAL-2对于针对感染性动物模型的屎肠球菌感染的治疗作用。
使用体重为约20g的五周龄ICR小鼠[无特定病原体(SPF)级]作为实验动物。将总共20只小鼠分为两组(每组10只小鼠)，然后给每只小鼠静脉内施用1×108cfu屎肠球菌(即，1×108cfu/小鼠)，从而诱导感染。在强制感染后30min、12小时和24小时的时间点，向一个组(治疗组)施用0.2ml抗细菌蛋白EFAL-2溶液(10mg/ml)。向另一个组(对照组)仅施用相同的体积的缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.0)。在施用抗细菌蛋白EFAL-2溶液的情况下，在强制感染后30min、12小时和24小时的时间点施用缓冲液。在强制感染之后5天，每日监测死亡的数量，每天在上午和下午观察特定症状的存在两次。
结果，确认了明确的治疗效果。死亡的数量如下表2中所示，本发明的抗细菌蛋白EFAL-2的施用在感染动物的存活率方面提供了显著的改善。此外，与在对照组中观察道的各种特定反应(诸如睑缘的红斑和活性降低)相比，在已施用抗细菌蛋白EFAL-2的组中未观察到特定反应。
[表2]
从上述结果可以确认，本发明的抗细菌蛋白EFAL-2在治疗屎肠球菌感染方面可以是有效的。这些特征显示，含有抗细菌蛋白EFAL-2作为活性成分的药物组合物可以用于治疗屎肠球菌感染的目的，并且还可以用于以与常规抗生素相同的方式治疗屎肠球菌感染的目的。
虽然已经参考本发明的示例性实施方案具体示出并描述了本发明，但是本领域的技术人员将理解，具体描述仅仅是优选的实施方案，并且本发明的范围不限于此。因此，本发明的范围旨在由所附权利要求及其等同物限定。
[登录号]
保藏机构名称：KCTC
登录号：KCTC 13177BP
登录日期：20161227
国际承认用于专利程序的
微生物保藏
布达佩斯条约
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原始保藏情况下的收据
依照细则7.1出具
保藏方名称：尹特荣生物科技株式会社
地址：韩国京畿道城南市中院区沙器膜谷路137号中央工业大厦V 903
(Joongang Induspia V 903,137Sagimakgol-ro,Joongwon-gu,Seongnam,Kyeonggi-do,Republic of Korea)(13202)
序列表
<110> 尹特荣生物科技株式会社
<120> 具有针对屎肠球菌的溶菌能力的新型抗细菌蛋白EFAL-2
<130> KP090509
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 975
<212> DNA
<213> Gene coding antibacterial protein EFAL-2
<400> 1
atgtacacaa ttgacactag tcagaagtta gcacctaatg aaggctccag ccaagtagct 60
aaccctaact acattatttt gcatgaaacc gctaacccaa acgctggtgg actaaacaat 120
gctaaatata tgaaacgtac atggtataac gcttacacag cttatatcgt tggcgagggt 180
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<210> 2
<211> 324
<212> PRT
<213> antibacterial protein EFAL-2
<400> 2
Met Tyr Thr Ile Asp Thr Ser Gln Lys Leu Ala Pro Asn Glu Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gln Val Ala Asn Pro Asn Tyr Ile Ile Leu His Glu Thr Ala Asn
20 25 30
Pro Asn Ala Gly Gly Leu Asn Asn Ala Lys Tyr Met Lys Arg Thr Trp
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