具体实施方式

本发明将相对于具体实施例并参考某些附图来说明，但本发明并不受限于此而只受权利要求限制。权利要求中的任何附图标记不应被解释为限制范围。当然，应当理解的是，不一定所有方面或优点可以根据本发明的任何特定实施例来实现。因此，例如，本领域技术人员将认识到，本发明可以以实现或优化如本文所教导的一个优点或一组优点的方式体现或执行，而不必实现如本文可以教导或建议的其它方面或优点。

当结合附图阅读时，通过参考以下详细描述，可以最好地理解本发明(关于组织和操作方法两者)以及其特征和优点。本发明的各方面和优点将根据下文描述的一个或多个实施例而变得显而易见，并且将参考所述实施例进行阐述。在整个本说明书中对“一个实施例”或“实施例”的提及意味着结合实施例描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一个实施例中。因此，在整个本说明书中各个地方出现的短语“在一个实施例中(in oneembodiment)”或“在实施例中(in an embodiment)”不一定都是指同一个实施例，但是可以指代同一个实施例。类似地，应理解，在本发明的示例性实施例的描述中，出于简单化本公开并且帮助理解各种发明性方面中的一个或多个的目的，本发明的各种特征有时被一起分组在单个实施例、附图或其描述中。然而，本公开的方法不应被解释为反映所要求保护的发明需要的特征比在每个权利要求中明确地叙述的更多的意图。相反，如以下权利要求书所反映，发明性方面在于比单个前述公开的实施例的所有特征更少。

另外，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非内容另外明确指明，否则单数形式的“一种(a)”、“一个(an)”以及“所述(the)”包含复数对象。因此，例如，对“多核苷酸”的提及包含两个或更多个多核苷酸；对“多核苷酸结合蛋白”的提及包含两个或更多个此类蛋白质；对“解旋酶”的提及包含两个或更多个解旋酶；对“单体”的提及是指两个或更多个单体；对“孔”的提及包含两个或更多个孔等。

在本文的所有讨论中，使用针对氨基酸的标准单字母代码。这些代码如下：丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)。也使用标准的取代记法，即Q42R意指位置42处的Q被R置换。

门户蛋白

纳米孔是病毒DNA包装马达如噬菌体DNA包装马达的经修饰的门户蛋白。

噬菌体DNA包装马达的门户蛋白具有截短的圆锥结构。所述蛋白质具有由十二个门户蛋白亚基(也被称为连接蛋白亚基)形成的中心通道。来自噬菌体phi29的示例性未经修饰的病毒DNA包装马达门户蛋白已被纯化，并且其三维结构已被晶体学表征(例如，Guasch等人,1998《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)》430:283；Marais等人,2008《结构(Structure)》16:1267)。phi29通道具有3.6nm窄端和6nm宽端，所述通道比大多数膜蛋白通道大。因此，如本文所描述的多个实施例是指phi29 DNA包装gp10马达门户蛋白(例如，GenBank登录号ACE96033 UniProt ID:P04332；基因ID：6446518；SEQ ID NO:1)和/或其多肽亚基，包含能够形成通道的片段、变体和衍生物(例如，登录号gi 29565762、gi31072023、gi 66395194、gi 29565739、gi 157738604)。

尽管病毒的门户蛋白几乎不共享序列同源性并且分子量不同，但存在显著的潜在结构相似性。具体地，其它dsDNA病毒(例如，T4、λ、P22、P2、T3、T5和T7)的DNA包装马达连接蛋白，尽管与phi29连接器几乎不共享序列同源性，并且在分子量上与所述连接器不同，但表现出显著的潜在结构相似性(例如，Bazinet等人,1985《微生物学年度评论(AnnRev.Microbiol.)》39:109-29)。

在某些实施例中，考虑使用来自其它dsDNA病毒的分离的病毒DNA包装马达门户蛋白，包含但不限于来自噬菌体λ、P2、P3、P22、T3、T4、T5、SPP1、HK97和T7中的任一种的分离的病毒DNA包装马达门户蛋白，如分离的dsDNA病毒DNA包装马达门户蛋白(例如，T4(登录号NP—049782)(Driedonks等人,1981《分子生物学杂志(J Mol Biol)》152:641)、λ(登录号gi549295、gi 6723246、gi 15837315、gi 16764273)(Kochan等人,1984《分子生物学杂志》174:433)、SPP1(登录号P54309)、P22(登录号AAA72961)(Cingolani等人,2002《结构生物学杂志(J Struct Biol)》139:46)、G20c(登录号KX987127.1)、P2(登录号NP—046757)、P3(Nutter等人,1972《病毒学杂志(J.Viral.)》10(3):560-2)、T3(登录号CAA35152)(Carazo等人,1986《超微结构与分子结构研究杂志(Jl.Ultrastruct Mol Struct Res)》94:105)、T5(登录号AAX12078、YP—006980；AAS77191；AAU05287)、T7(登录号NP-041995)(Cerritelli等人,1996《分子生物学杂志》285:299；Agirrezabala等人,2005《分子生物学杂志》347:895))。在一些实施例中，连接蛋白包括噬菌体T3连接蛋白gp8。在一些实施例中，连接蛋白包括噬菌体T7连接蛋白gp8。在一些实施例中，连接蛋白包括噬菌体T4连接蛋白gp20。在一些实施例中，连接蛋白包括噬菌体T5连接蛋白gp7。在一些实施例中，连接蛋白包括噬菌体SPP1连接蛋白gp6。在一些实施例中，连接蛋白包括噬菌体HK97连接蛋白gp3。

与本文所例示的phi29 DNA包装马达门户蛋白一样，已经基本上在结构上表征的这些和其它dsDNA病毒包装马达门户蛋白可以进行修饰，使得所述门户蛋白结合到膜层中以形成孔，通过所述孔可以发生电导当以与phi29 DNA包装马达的门户蛋白相同的方式跨膜施加电位时。因此，本文关于phi29门户蛋白的公开旨在说明使用此类其它分离的dsDNA病毒DNA包装马达门户蛋白中的任何门户蛋白设想的相关实施例。

phi29 DNA包装马达的门户蛋白，或来自另一个噬菌体DNA包装马达的门户蛋白，可以根据本文发现的教导进行修饰。

根据本公开，已被人工工程化以具有膜结合性质(例如，膜层中的稳定跨膜整合)的分离的DNA包装马达门户蛋白可以用作癌症生物标志物的导电生物传感器。也可以人工工程化门户蛋白以影响由门户蛋白形成的跨膜通道的导电性质。

经修饰的分离的双链DNA病毒DNA包装马达蛋白连接器如phi29连接器可以被工程化成具有用于当前所公开的实施例的期望的结构，其中蛋白质晶体学结构数据是可容易获得的。用于phi29连接器的大规模生产和纯化程序已经开发出来(Guo等人,2005；Ibanez等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》12,2351-2365(1984)、Robinson等人,《核酸研究》34,2698-2709(2006)、Xiao等人,《ACS纳米(ACS Nano)》3,100-107(2009)。

在一个实施例中，经修饰的噬菌体phi29病毒DNA包装马达门户蛋白(例如SEQ IDNO:1)与野生型蛋白或野生型phi29病毒DNA包装马达连接蛋白衍生的一部分具有至少80％、90％或95％的同一性，所述部分含有至少150、175、200、225、250、275，包含至少240、260、280、285、290、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330或更多个氨基酸。

在其它实施例中，经修饰的门户蛋白是来自另一种噬菌体的经修饰的双链DNA门户蛋白，如噬菌体T4、λ噬菌体(登录号gi549295、gi6723246、gi15837315、gi16764273)、噬菌体SPP1(P54309)、噬菌体P22(登录号AAA72961)、噬菌体P2(登录号NP—046757)、噬菌体P3(Nutter等人,1972《病毒学杂志》10(3):560-2)、噬菌体T3(登录号CAA35152)、噬菌体T5(登录号AAX12078、YP006980；AAS77191；AAU05287)、噬菌体T7(登录号NP041995)和噬菌体HK97(登录号NP_037699)。例如，经修饰的门户蛋白可以是这些噬菌体病毒DNA包装马达门户蛋白中的任何门户蛋白的突变体，并且可以例如与本文所公开的多肽并且与此类多肽的片段具有至少80％、90％或95％同一性。突变门户蛋白亚基的“片段”通常含有至少150、175、200、225、250、275个氨基酸，包含至少240、260、280、285、290、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330或更多个氨基酸。

如本文所用，术语“氨基酸同一性”是指序列在氨基酸对氨基酸的基础上在比较窗口上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”通过以下来计算：在比较窗口上比较两个经过最佳比对的序列，确定相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)出现在这两个序列中的位置的数量以产生匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以比较窗口中的位置的总数(即，窗口大小)，以及将结果乘以100以产生序列同一性百分比。

门户蛋白可以是上述噬菌体门户蛋白中的任何噬菌体门户蛋白的经修饰类似物。“类似物”在提及病毒DNA包装马达门户蛋白时意指病毒DNA包装马达门户蛋白的天然存在的同源物或变体。门户蛋白通常由能够自组装成寡聚体(例如同十二聚体)通道的亚基构成。

门户蛋白可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基(优选地保守的氨基酸残基)取代并且此类经取代的氨基酸残基可以是或可以不是由基因密码编码的氨基酸残基的门户蛋白，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包含取代基的门户蛋白，或(iii)其中另外的氨基酸与一个或多个门户蛋白亚基基因融合的门户蛋白，所述另外的氨基酸包含用于对突变门户蛋白进行检测或特异性功能改变的氨基酸。

分离经修饰的门户蛋白。术语“分离的”意指将材料从其原始环境(例如，如果其天然存在的话，自然环境)中去除。例如，存在于完整的天然存在的病毒中的天然存在的蛋白质不是分离的，但是与天然系统中的一些或全部共存材料分离的相同蛋白质是分离的。此类蛋白质可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为此类载体或组合物不是其天然环境的一部分。分离噬菌体马达蛋白的门户蛋白的方法是本领域已知的。用于本文所描述的方法和组合物的噬菌体马达蛋白的门户蛋白可以通过本领域公知的重组方法产生。

在一个实施例中，经修饰的蛋白质是门户蛋白的截短版本，和/或经修饰的蛋白质可以在门户蛋白的亚基中的一个或多个亚基的一端或两端处包括另外的氨基酸，和/或可以包括门户蛋白的氨基酸序列内的一种或多种氨基酸取代、缺失或添加。

截短的门户蛋白可以在N端和/或C端处被截短。例如，N端可以缺失至多约30个氨基酸，如N端可以缺失至多约20个、10个、9个、8个或7个氨基酸。可替代地或另外地，C端可以缺失至多约30个氨基酸，如C端可以缺失至多约20个、10个、9个、8个或7个氨基酸。一个或多个，如2到约30个氨基酸，如3到约20、4到约10、5到9或6、7或8个氨基酸，可以添加到N端和/或添加到C端，或添加到截短的N端和/或截短的C端。

经修饰的门户蛋白包括通道。在一个实施例中，门户蛋白被修饰以改变纳米孔的通道的一种或多种性质。在一个实施例中，这通过修饰通道内衬和/或通道入口处的一个或多个氨基酸残基来实现。

在一些实施例中，纳米孔仅包括门户蛋白的全长亚基。

在一些实施例中，纳米孔是由六个或更多个门户蛋白亚基(如7、8、9、10、11或12个亚基)形成的多聚体蛋白质。例如，纳米孔可以是十二聚体蛋白质。可以修饰亚基中的一个或多个，如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个。在一个实施例中，亚基中的一种或多种亚基可以在C端和/或N端被修饰，例如以增加纳米孔的一端或两端处的亲水性。例如，可以通过在C端和/或N端处添加柔性接头和/或肽标签来修饰亚基中的一个或多个亚基。在一些实施例中，纳米孔由相同的亚基构成。可以使用任何合适的接头，例如包括3到12个氨基酸，如4或5到10个，优选地6到8个氨基酸的接头。接头中的氨基酸可以选自赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸天冬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸和/或苏氨酸。合适的接头的实例包含但不限于以下：GGGS、PGGS、PGGG、RPPPPP、RPPPP、VGG、RPPG、PPPP、RPPG、PPPPPPPPP、RPPG、GGG、GGGG、GGGGG、GGGGGG和DYDIPTT。

经修饰的门户蛋白可以包括标签，例如以促进其纯化。可以使用任何合适的肽标签来促进门户蛋白的纯化。例如，在一个实施例中，标签可以是链球菌标签。在一个实施例中，链球菌标签具有8到11个氨基酸的长度和/或链球菌标签氨基酸序列含有基序HPQ。链球菌标签可以例如包括氨基酸序列WSHPQSEK、WSHPQFEK、NWSHPQFEK、PWSHPQFEK或GGSHPQFEG或由所述氨基酸序列组成。只要维持核心“HPQ”基序，此序列可以通过添加、缺失或取代一个或多个如2、3、4或5个氨基酸而变化。变体序列通常为8到11个氨基酸NWSHPQFEK、PWSHPQFEK、和GGSHPQFEG。在另一个实施例中，标签可以是His标签(通常是His6(HHHHHH))。

门户蛋白可以包含切割位点以允许在孔组装之前或之后从亚基去除标签和/或接头。可以使用任何合适的切割位点。一个实例是TEV(烟草蚀刻病毒)清除位点(ENLYFQG；其中在Q残基与G残基之间发生切割)。

通过引入氨基酸进行修饰以促进插入

一方面，通过引入一个或多个氨基酸以改变孔的表面的疏水性来修饰门户蛋白以促进其直接插入到膜中。一个或多个氨基酸可以通过取代和/或插入引入。插入的氨基酸可以插入在门户蛋白亚基的氨基酸链的一端或两端处，和/或链中的两个氨基酸之间。当亚基折叠并组装成孔时，引入的氨基酸存在于孔的外表面上。

在孔中的亚基中的一个或多个亚基中引入至少一个氨基酸。孔中的每个亚基可以独立地包括一个或多个引入的氨基酸，如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸引入。孔可以包含相同的经修饰的亚基，但是孔中的亚基中的一个或多个亚基可以与其它亚基不同。例如，孔可以由两个或更多个不同的亚基构成，如来自3个或更多个不同的亚基。例如，孔中可以存在4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个不同的经修饰的亚基。在一个实施例中，所有的亚基可以彼此不同。通常，至少一个氨基酸被引入到孔中的每个亚基中。例如，在孔包括12个亚基的情况下，孔包括十二个或更多个引入或取代的氨基酸以改变孔的表面的疏水性。

修饰通常在围绕孔的外部的中心疏水带中进行。中心疏水带区域的定位如图1所示。孔的中心带区域通常被修饰以增加其疏水性。例如，增加的疏水性可以通过用疏水性更强的残基(例如，亮氨酸、缬氨酸和/或异亮氨酸)取代亲水性、中性或疏水性相对较低的氨基酸(例如，丙氨酸和/或蛋氨酸)来实现。图1D示出了氨基酸的相对疏水性。用于增加疏水性的取代可以是用在如图1D所示的疏水性标度上比被替换的氨基酸具有更多正数的任何氨基酸取代存在于孔中的一个或多个氨基酸。

疏水性的增加可以通过将一个或多个疏水性氨基酸插入到门户蛋白亚基的氨基酸链的末端中和/或所述末端处来实现。疏水性氨基酸在图1D中示出。

引入的疏水性氨基酸的定位可以确定其中孔位于膜中的位置。孔相对于膜的位置可以向上或向下移位(例如在任一方向至多移位0.5nm)。因此，可以控制膜中的孔的位置以提高膜中的孔的稳定性。孔的固有电生理学通常不会因孔的外表面上的氨基酸的改变而改变。

在一个实施例中，通过在翼结构域下方的带区中引入一个或多个氨基酸来改变疏水性。目标定位包含phi29门户蛋白亚基中的Phe24、Ile25、Leu28、Phe60、Phe128、Pro129和Pro132，以及类似亚基中的对应位置。另外的疏水性残基可以在这些目标定位中的任何一个或多个定位(如这些目标定位中的2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个定位)之前和/或之后的一个或两个氨基酸内被取代或插入。例如，与SEQ ID NO:1中的位置22、23、26、27、29、30、58、59、61、62、126、127、130、131、133和/或134相对应的位置处的氨基酸残基的疏水性可以通过氨基酸残基的取代或插入而增加。可以在这些位置中的任何一个或多个位置，如任何2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个位置处进行更改。其它示例性突变位置包含与SEQ ID NO:1中的Arg10、Glu14、Arg17、Gln18和Arg22相对应的位置。这些氨基酸中的任何一个或多个氨基酸可以用更多疏水性残基取代以增加孔的中心区域的表面的疏水性。

在一个实施例中，茎区域中的暴露的电荷残基(如与SEQ ID NO:1的Arg17、Arg22和/或Lys172相对应的残基)以及集中在蛋白质茎的两个远侧部分的Asn/Gln残基(如与SEQID NO:1中的Asn166、Asn167、Gln168、Gln173、Asn176和/或Gln177相对应的残基)可以被改变以改变亲水性。

通过引入氨基酸进行修饰以促进改变疏水性的分子的缀合

一方面，噬菌体DNA包装马达的被修饰使得其可以直接插入到膜中的经修饰的门户蛋白是这样的门户蛋白：其中门户蛋白的外表面上的一个或多个氨基酸残基被在门户蛋白的外表面上引入的另一个氨基酸残基和/或一个或多个氨基酸残基取代，以引入与野生型门户蛋白相比改变门户蛋白的外表面的疏水性的分子的结合位点。结合位点被引入翼结构域的外侧上或茎结构域中。结合位点用作分子的附接位点。所述分子通常是增加门户蛋白的表面的疏水性的疏水性分子。

在一个实施例中，引入的结合位点可以是半胱氨酸残基。在另一个实施例中，结合位点可以是非天然氨基酸。

非天然氨基酸是非天然存在于蛋白质中的氨基酸。非天然氨基酸优选地不是组氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丝氨酸或酪氨酸。非天然氨基酸更优选地不是前一句中的二十个氨基酸中的任一个或硒代半胱氨酸。

用于本发明的优选非天然氨基酸包含但不限于4-叠氮基-L-苯丙氨酸(Faz)、4-乙酰-L-苯丙氨酸、3-乙酰-L-苯丙氨酸、4-乙酰乙酰-L-苯丙氨酸、O-烯丙基-L-酪氨酸、3-(苯硒基)-L-丙氨酸、O-2-丙炔-1-基-L-酪氨酸、4-(二羟基硼基)-L-苯丙氨酸、4-[(乙基硫烷基)羰基]-L-苯丙氨酸、(2S)-2-氨基-3-{4-[(丙-2-基硫烷基)羰基]苯基}丙酸，(2S)-2-氨基-3-{4-[(2-氨基-3-硫烷基丙酰基)氨基]苯基}丙酸，O-甲基-L-酪氨酸、4-氨基-L-苯丙氨酸、4-氰基-L-苯丙氨酸、3-氰基-L-苯丙氨酸、4-氟-L-苯丙氨酸、4-碘-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、O-(三氟甲基)酪氨酸、4-硝基-L-苯丙氨酸、3-羟基-L-酪氨酸、3-氨基-L-酪氨酸、3-碘-L-酪氨酸、4-异丙基-L-苯丙氨酸、3-(2-萘基)-L-丙氨酸、4-苯基-L-苯丙氨酸、(2S)-2-氨基-3-(萘乙酰胺-2-基氨基)丙酸、6-(甲基硫烷基)正亮氨酸、6-氧代-L-赖氨酸、D-酪氨酸、(2R)-2-羟基-3-(4-羟基苯基)丙酸、(2R)-2-辛酸胺3-(2,2'-二吡啶-5-基)-D-丙氨酸、2-氨基-3-(8-羟基-3-喹啉)丙酸、4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、S-(2-硝基苄基)半胱氨酸、(2R)-2-氨基-3-[(2-硝基苄基)硫烷基]丙酸、(2S)-2-氨基-3-[(2-硝基苄基)氧基]丙酸、O-(4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)-L-丝氨酸、(2S)-2-氨基-6-({[(2-硝基苄基)氧基]羰基}氨基)己酸、O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸、2-硝基苯丙氨酸、4-[(E)-苯基二氮烯基]-L-苯基丙氨酸、4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]-D-苯基丙氨酸、2-氨基-3-[[5-(二甲基氨基)-1-萘基]磺酰基氨基]丙酸、(2S)-2-氨基-4-(7-羟基-2-氧代-2H-色烯-4-基)丁酸、(2S)-3-[(6-乙酰基萘乙酰胺-2-基)氨基]-2-氨基丙酸、4-(羧基甲基)苯基丙氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、O-磺基-L-酪氨酸、(2R)-6-乙酰胺基-2-氨基己酸、1-甲基组氨酸、2-氨基壬酸、2-氨基癸酸、L-同型半胱氨酸、5-磺酰正缬氨酸、6-磺酰基-L-正亮氨酸、5-(甲基磺酰基)-L-戊氨酸、N⁶-{[(2R,3R)-3-甲基-3,4-二氢-2H-吡咯-2-基]羰基}-L-赖氨酸、N⁶-[(苄基氧基)羰基]赖氨酸、(2S)-2-氨基-6-[(环戊基羰基)氨基]己酸、N⁶-[(环戊基氧基)羰基]-L-赖氨酸、(2S)-2-氨基-6-{[(2R)-四氢呋喃-2-基羰基]氨基}己酸、(2S)-2-氨基-8-[(2R,3S)-3-乙炔基四氢呋喃-2-基]-8-氧代辛酸、N⁶-(叔-丁氧基羰基)-L-赖氨酸、(2S)-2-羟基-6-({[(2-甲基-2-丙烷基)氧基]羰基}氨基)己酸、N⁶-[(烯丙氧基)羰基]赖氨酸、(2S)-2-氨基-6-({[(2-叠氮苄基)氧基]羰基}氨基)己酸、N⁶-L-脯氨酰基-L-赖氨酸、(2S)-2-氨基-6-{[(丙-2-炔-1-基氧基)羰基]氨基}己酸和N⁶-[(2-叠氮乙氧基)羰基]-L-赖氨酸。最优选的非天然氨基酸是4-叠氮基-L-苯丙氨酸(Faz)。

可以与门户蛋白缀合的合适疏水性分子的实例包含卟啉、四苯基卟啉、原卟啉IX、八乙基卟啉、胆固醇、血红素和胆绿素。这些和其它疏水性分子可以附接到门户蛋白，以实现门户蛋白的膜锚定。

可以控制疏水性分子的结合位点的确切定位，以确定孔位于膜中的位置。疏水性分子可以用于改变孔相对于膜的位置。例如，疏水性分子可以使孔在膜中向上或向下移位(例如，在任一方向上至多移位0.5nm)。从而可以控制膜中的孔的稳定性。疏水性分子在孔的外表面上的定位不会改变孔的固有电生理性质。

其中结合(或缀合)位点可以引入在Phi29 Gp10门户蛋白中的定位的实例包含Q32、Y36、F52、K55、Q59、F60、Y62、N77、G78、A79、L80、S81、R84、R94、A96、S97、P98、Q101、P129、T131、E135、Q168。Phi29 Gp10门户蛋白中的这些位置或其它门户蛋白中的对应位置处的残基中的任何一个或多个残基可以被例如半胱氨酸或非天然氨基酸取代以引入疏水性分子的结合侧。半胱氨酸残基或非天然氨基酸残基可以可替代地插入这些位置的一或两个残基内。

在一个实施例中，通过在亚基分子的末端中的一个或两个末端处添加一个或多个天然或非天然氨基酸来调整疏水性以促进门户蛋白插入到膜中。例如，亲水性或疏水性标签可以添加到末端之一或两者。通常，疏水标签被添加到存在于分子的中心带区域中的N端处和/或亲水标签可以添加到C端结构域。亲水性和/或疏水性标签可以通过接头连接到门户蛋白。合适的接头如上所述。

标签可以包括例如两个到十二个氨基酸，如3或4到10个，例如5个、6个、7个、8个或9个氨基酸。在一个实施例中，标签中的所有氨基酸都是亲水性氨基酸。亲水性氨基酸是在疏水性标度上具有负数的氨基酸(如图1D所示)。亲水性标签中的残基中的一个或多个残基可以是疏水性标度上位置0处的残基。在一个实施例中，亲水性标签可以总体上是亲水性的，但包括在疏水性标度上具有正数的一个或多个疏水性残基。

在使用疏水性标签的实施例中，疏水性标签可以例如仅包含在疏水性标度中具有正数的残基。可替代地，疏水性标签可以包含疏水性为0的一个或多个残基。只要标签总体上是疏水性的，标签就可以包含在疏水性标度上具有负数的一个或多个极性或带电氨基酸。

用于促进用作纳米孔传感器的突变

经修饰的门户蛋白可以包含用于改变孔的其它性质的一种或多种另外的修饰。此类改变通常促进孔用作纳米孔传感器。此类修饰的实例包含以下：

通过改变带负电的Arg/Lys或Asp/Glu残基的环来改变通道内部的整体电负性性质。Arg/Gly残基可以例如被带正电或中性氨基酸取代。一个或多个Asp/Glu残基可以被带正电、带负电或中性氨基酸取代。用任何氨基酸改变窄端处的内通道入口处的酸性残基，如SEQ ID NO:1中的Glu189、Asp19和Asp194，以改变亲水性。

在末端处添加若干个氨基酸(任何天然或非天然的)，其中目的是使用这些氨基酸作为锚定点以增加功能或改变孔的电生理性质。

改变(缺失、截短、突变)内部柔性环，例如phi29 Gp10门户蛋白中的残基229-244，以改变孔的电生理性质和/或检测能力。

突变体或经修饰的蛋白质、单体或肽还可以以任何方式和在任何位点进行化学修饰。优选地通过将分子附接到一个或多个半胱氨酸(半胱氨酸连接)、将分子附接到一个或多个赖氨酸、将分子附接到一个或多个非天然氨基酸、表位的酶修饰或末端的修饰对突变体或经修饰的单体进行化学修饰。用于进行此类修饰的合适方法在本领域是众所周知的。经修饰的蛋白质、单体或肽的突变体可以通过任何分子的附接进行化学修饰。例如，经修饰的蛋白质、单体或肽的突变体可以通过染料或荧光团的附接进行化学修饰。

膜

系统中可以使用任何合适的膜。膜优选地是两亲层。两亲层是由如磷脂等两亲分子形成的层，其具有亲水性和亲脂性两者。两亲性分子可以是合成的或天然存在的。非天然存在的两亲物和形成单层的两亲物在所属领域中是已知的，并且包含例如嵌段共聚物(Gonzalez-Perez等人,《朗缪尔(Langmuir)》,2009,25,10447-10450)。嵌段共聚物是聚合在一起的两个或更多个单体亚基产生单一聚合物链的聚合材料。嵌段共聚物通常具有通过每个单体亚基贡献的性质。然而，嵌段共聚物可具有由个别子单元形成的聚合物不拥有的独特特性。嵌段共聚物可进行工程改造，使得单体子单元中的一个在水性介质中是疏水性的(即亲脂性)，而其它子单元是亲水性的。在这种情况下，嵌段共聚物可拥有两亲特性，且可形成模拟生物膜的结构。嵌段共聚物可以是二嵌段的(其由两个单体子单元组成)，但也可由超过两个的单体子单元来构建，形成表现为两亲物的更复杂的排列。共聚物可以是三嵌段、四嵌段或五嵌段共聚物。膜优选地是三嵌段共聚物膜。

古细菌双极性四醚脂质是天然存在的脂质，其被构建成使得脂质形成单层膜。这些脂质一般发现于在苛刻生物环境中存活的嗜极生物、嗜热生物、嗜盐生物和嗜酸生物中。认为其稳定性是源于最终双层的融合性质。直接了当的做法是，通过产生具有一般基序亲水性-疏水性-亲水性的三嵌段聚合物来构建模拟这些生物实体的嵌段共聚物材料。这种材料可以形成表现类似于脂质双层并且涵盖从囊泡到层状膜的一系列阶段表现的单体膜。由这些三嵌段共聚物形成的膜在生物脂质膜上保持若干优势。因为合成三嵌段共聚物，所以可小心地控制准确的构建，以提供形成膜和与孔和其它蛋白质相互作用所需的正确链长度和特性。

还可以由不分类为脂质亚材料的子单元来构建嵌段共聚物；例如可由硅氧烷或其它非基于烃的单体来制成疏水性聚合物。嵌段共聚物的亲水性亚区段还可以具备低蛋白质结合特性，这允许产生当暴露于原始生物样品时具有高度抗性的膜。此头基单元还可来源于非经典的脂质头基。

与生物脂质膜进行比较，三嵌段共聚物膜还具有增加的机械和环境稳定性，例如高许多的操作温度或pH范围。嵌段共聚物的合成性质提供定制用于广泛范围应用的基于聚合物的膜的平台。

膜最优选地是国际申请第WO2014/064443号或第WO2014/064444号中所公开的膜中的一个。

两亲分子可进行化学修饰或官能化，以便于偶联聚核苷酸。两亲层可以是单层或双层。两亲性层通常是平面的。两亲性层可以是弯曲的。两亲层可以是支撑式的。

两亲膜通常是天然可移动的，基本上以大约10^-8cm s^-1的脂质扩散速率充当二维液体。这意味着孔和偶联的多核苷酸可通常在两亲膜内移动。

膜可以是脂质双层。脂质双层是细胞膜的模型，且用作一系列实验研究的极佳平台。例如，脂质双层可用于通过单通道记录对膜蛋白的活体外研究。可替代地，脂质双层可以用作检测一系列物质的存在的生物传感器。脂质双层可以是任何脂质双层。合适的脂质双层包含但不限于平面脂质双层、支持双层或脂质体。脂质双层优选地是平坦脂质双层。合适脂质双层公开于WO 2008/102121、WO 2009/077734和WO 2006/100484中。

用于形成脂质双层的方法在所属领域中是已知的。脂质双层通常通过Montal和Mueller的方法(《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)》,1972；69:3561-3566)来形成，其中脂质单层携载于通过开孔两侧的水溶液/空气界面上，所述开孔垂直于所述界面。通常通过首先将脂质溶解在有机溶剂中，且接着使在开孔两侧上的水溶液的表面上蒸发一滴溶剂，来将脂质添加到水性电解质溶液的表面。一旦有机溶剂已蒸发，那么开孔两侧上的溶液/空气界面来回物理地移动通过开孔，直到形成双层为止。可跨越膜中的开孔或跨越凹槽中的开口形成平坦脂质双层。

Montal和Mueller的方法是常用的，这是因为是节约成本的，且是形成适合于蛋白孔插入的良好品质脂质双层的相对直接了当的方法。双层形成的其它常见方法包含脂质体双层的尖端浸没、双层涂刷和贴片夹持。

尖端浸没双层形成需要使开孔表面(例如移液管尖端)接触到携载脂质单层的测试溶液的表面。同样，通过将溶解于有机溶剂中的一滴脂质在溶液表面处蒸发来首先在溶液/空气界面处产生脂质单层。接着，通过朗缪尔-沙佛(Langmuir-Schaefer)过程形成双层，且需要机械自动以使开孔相对于溶液表面移动。

对于涂刷的双层，将溶解于有机溶剂中的一滴脂质直接应用于开孔，所述开孔浸没在水性测试溶液中。使用笔刷或等效物，使脂质溶液稀薄地扩散在开孔内。溶剂的薄化使得形成脂质双层。然而，从双层完全去除溶剂是非常困难的，且因此通过这种方法形成的双层较不稳定且更倾向于在电化学测量期间具有噪声。

贴片夹持是在生物细胞膜研究中常用的。通过抽汲将细胞膜夹持到移液管的末端，且膜贴片变为附接在开孔内。所述方法适用于通过夹持接着爆裂以离开密封在移液管的开孔内的脂质双层的脂质体来产生脂质双层。所述方法需要稳定的、巨大的且单层脂质体和在具有玻璃表面的材料中制造小开孔。

脂质体可以通过超声处理、挤出或Mozafari方法(Colas等人(2007)《微米(Micron)》38:841-847)来形成。

在一优选实施例中，如国际申请第WO 2009/077734号中所描述形成脂质双层。在此方法中有利的是，由干燥脂质形成脂质双层。在一最优选实施例中，跨越开口形成脂质双层，如WO2009/077734中所描述。

由脂质的两个相对层形成脂质双层。两个脂质层被布置成使得其疏水尾部基团面朝彼此，形成疏水性的内部。脂质的亲水性头基朝外面向双层每侧上的水性环境。双层可存在于多种脂质阶段中，所述阶段包含但不限于液体无序阶段(液体片层)、液体有序阶段、固体有序阶段(片层凝胶阶段、交错结合的凝胶阶段)和平坦双层晶体(片层亚凝胶阶段、片层结晶阶段)。

可以使用形成脂质双层的任何脂质组合物。选择脂质组合物，使得脂质双层具有所需的特性，例如表面电荷、支持膜蛋白的能力、充填密度或所形成的机械特性。脂质组合物可以包括一种或多种不同脂质。例如，脂质组合物可以含有至多100种脂质。脂质组合物优选地含有1到10种脂质。脂质组合物可以包括天然存在的脂质和/或人工脂质。

脂质通常包括头基、界面部分和可相同或不同的两个疏水尾部基团。合适的头基包含(但不限于)：中性头基，例如二酰基甘油酯(DG)和脑酰胺(CM)；两性离子头基，如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和鞘磷脂(SM)；带负电荷的头基，如磷脂酰甘油(PG)；磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)和心磷脂(CA)；以及带正电荷的头基，如三甲基铵丙烷(TAP)。合适界面部分包含但不限于天然存在的界面部分，例如基于甘油或基于脑酰胺的部分。合适的疏水尾部基团包含但不限于：饱和烃链，例如月桂酸(正十二烷酸)、肉豆蔻酸(正十四烷酸)、棕榈酸(正十六烷酸)、硬脂酸(正十八烷酸)和花生酸(正二十烷酸)；不饱和烃链，如油酸(顺-9-十八烷酸)；和支链烃链，如植烷酰基。链的长度和不饱和烃链中的双键的位置与数量可变化。链的长度和分支链烃链中的分支(如甲基)的位置和数量可变化。疏水尾部基团可以作为醚或酯连接到界面部分。脂质可以是分枝菌酸。

脂质还可以进行化学修饰。脂质的头基或尾部基团可以进行化学修饰。头基已进行化学修饰的合适的脂质包含但不限于：经PEG修饰的脂质，如1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]；官能化PEG脂质，如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3磷酸乙醇胺-N-[生物素基(聚乙二醇)2000]；以及针对缀合修饰的脂质，如1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰基)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基)。尾基已进行化学修饰的合适的脂质包含但不限于：可聚合脂质，如1,2-双(10,12-二十三碳二炔基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱；氟化脂质，如1-软脂酰基-2-(16-氟软脂酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱；氘化脂质，如1,2-二棕榈酰基-D62-sn-甘油-3-磷酸胆碱；以及醚连接的脂质，如1,2-二-O-植烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。脂质可以进行化学修饰或官能化，以便于偶联多核苷酸。

两亲层，例如脂质组合物，通常包括将影响层的特性的一种或多种添加剂。合适的添加剂包含但不限于：脂肪酸，如棕榈酸、肉豆蔻酸和油酸；脂肪醇，如棕榈醇、肉豆蔻醇和油醇；甾醇，如胆固醇、麦角固醇、羊毛甾醇、谷甾醇和豆甾醇；溶血磷脂，如1-酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；以及神经酰胺。

在另一个优选实施例中，膜包括固态层。固态层可以由有机材料和无机材料两者形成，所述材料包含但不限于：微电子材料、绝缘材料(如Si₃N₄、A1₂O₃和SiO)、有机和无机聚合物(如聚酰胺)、塑料(如)或弹性体(如双组分加成固化硅橡胶)以及玻璃。固态层可以由石墨烯形成。合适的石墨烯层公开于WO 2009/035647中。如果膜包括固态层，则孔通常存在于两亲膜或层中，所述两亲膜或层包含在固态层内，例如在固态层内的孔洞、孔、间隙、通道、沟槽或缝隙内。技术人员可以制备合适的固态/两亲性杂合系统。合适的系统公开于WO 2009/020682和WO 2012/005857中。可以使用以上所论述的两亲膜或层中的任一个。

通常使用以下来实行方法：(i)包括孔的人工两亲层，(ii)包括孔的分离的天然存在的脂质双层，或(iii)其中插入孔的细胞。通常使用人工两亲层(如人工三嵌段共聚物层)来实行方法。层可以包括其它跨膜和/或膜内蛋白质以及除孔以外的其它分子。以下论述了合适的设备和条件。通常在体外进行本发明的方法。

用于将经修饰的孔插入到膜中的方法

本文公开了用于将噬菌体DNA包装马达的经修饰的门户蛋白插入到膜中用作纳米孔的方法。

可以通过使膜与纯化的蛋白质接触并向膜施加电压电位来将经修饰的门户蛋白插入到共聚物膜中。此类方法在本领域中用于将纳米孔插入到膜中。

一种示例性方法涉及使膜与经修饰的门户蛋白接触并施加斜升电压以帮助门户蛋白插入到膜中以形成通道。技术人员将能够容易地确定合适的门户蛋白浓度和电压。例如，可以施加+50到+350mV的斜升电压，其中电压以5mV的增量增加，其中例如在每个电压下保持约20秒。在用作传感器之前，可以洗掉多余的门户蛋白。

阵列

本公开提供了包括纳米孔的膜阵列，其中纳米孔包含经修饰的门户蛋白。在优选实施例中，阵列中的每个膜包括一个纳米孔。由于其中形成阵列的方式，例如，阵列可以包括一个或多个不包括纳米孔的膜，和/或一个或多个包括两个或更多个纳米孔的膜。阵列可以包括约2到约1000，例如约10到约800，约20到约600或约30到约500个膜。

在一个实施例中，含有经修饰的门户蛋白纳米孔的膜阵列可以存在于适合高通量测序的装置中。

传感器装置

本公开提供了一种装置，所述装置包括含有经修饰的门户蛋白纳米孔的膜阵列。例如，装置可以包括包含水溶液的腔室和将腔室分成两段的屏障。屏障通常具有孔口，在其中形成含有纳米孔的膜。可替代地，屏障可以形成其中存在孔的膜。

因此，所述装置可以包括第一腔室和第二腔室，其中所述第一腔室和第二腔室被包括经修饰的门户蛋白纳米孔的膜分离。当用于表征靶多核苷酸时，装置可以进一步包括靶多核苷酸，其中所述靶多核苷酸短暂地定位在由门户蛋白形成的通道内，并且其中靶多核苷酸的一端定位在第一腔室中，并且靶多核苷酸的一端定位在第二腔室中。

在一个实施例中，所述装置能够支撑多个纳米孔和膜并且可操作以使用纳米孔和膜进行分析物表征。在一个实施例中，所述装置包括至少一个端口，其用于递送执行表征用的材料。在一个实施例中，所述装置包括至少一个储槽，其用于盛放执行表征用的材料。在一个实施例中，所述装置包括流体系统，所述流体系统被配置成可控制地将材料从至少一个储存器供应到传感器装置；以及用于接收相应样品的一个或多个容器，所述流体系统被配置成选择性地将样品从所述一个或多个容器供应到所述传感器装置。所述装置还可以包括能够施加电位并且测量跨膜和孔复合物的电信号的电路。

装置可以是描述于WO 2008/102120、WO 2009/077734、WO 2010/122293、WO 2011/067559或WO 00/28312中的那些设备中的任一种。

在一个实施例中，所述装置形成用于表征分析物的系统的一部分。在一个实施例中，系统可以进一步包括与纳米孔接触的导电溶液、跨膜提供电压电位的电极以及用于测量通过纳米孔的电流的测量系统。在一个实施例中，跨膜和孔复合物施加的电压为+5V到-5V，如-600mV到+600mV或-400mV到+400mV。所使用的电压优选地在100mV到240mV的范围内，并且更优选地在120mV到220mV的范围内。通过使用增加的施加电位，可以通过孔增加不同核苷酸之间的区分度。可以使用任何合适的导电溶液。例如，溶液可以包括电荷载体，如金属盐，例如碱金属盐；卤盐，例如氯化物盐，如碱金属氯化物盐。电荷载体可以包含离子液体或有机盐，例如四甲基氯化铵、三甲基苯基氯化铵、苯基三甲基氯化铵或1-乙基-3-甲基氯化咪唑。在示例性系统中，盐存在于腔室中的水溶液中。通常使用氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、氯化铯(CsCl)或亚铁氰化钾与铁氰化钾的混合物。优选的是KCl、NaCl，以及亚铁氰化钾和铁氰化钾的混合物。电荷载体可以是跨膜不对称的。例如，(例如每个腔室中的)膜的每一侧上的电荷载体的类型和/或浓度可以不同。

盐浓度可以处于饱和状态。盐浓度可以是3M或更低，并且通常是0.1到2.5M、0.3到1.9M、0.5到1.8M、0.7到1.7M、0.9到1.6M或1M到1.4M。盐浓度优选地是150mM到1M。所述方法优选使用至少0.3M的盐浓度进行，例如至少0.4M、至少0.5M、至少0.6M、至少0.8M、至少1.0M、至少1.5M、至少2.0M、至少2.5M或至少3.0M。高盐浓度提供高信噪比并允许相对于正常电流波动的背景鉴定指示核苷酸的存在的电流。

导电溶液中可以存在缓冲剂。通常，缓冲液是磷酸盐缓冲液。其它合适的缓冲液是HEPES和Tris-HCl缓冲液。导电溶液的pH可以是4.0到12.0、4.5到10.0、5.0到9.0、5.5到8.8、6.0到8.7或7.0到8.8或7.5到8.5。使用的pH优选地是约7.5。

所述装置可以与高通量设备兼容。例如，所述装置可以是由牛津纳米孔技术有限公司开发的SmidgION、MinION、GridION、PromethION仪器。这些仪器可以配备不同类型的流通池，其中纳米孔嵌入在共聚物膜中。所述装置可以是流通池。共聚物膜至少稳定几个月，并且还可以耐受更高的电压。每个通道都含有自己的一对电极，从而在通道之间分离电信号。

表征分析物的方法

在另外的方面，公开了一种确定目标分析物的存在、不存在或一个或多个特性的方法。所述方法涉及使目标分析物与包括孔复合物的膜接触，使得目标分析物相对于(如进入或通过)连续通道移动，所述连续通道包括分别由孔复合物中的纳米孔和辅助蛋白或肽提供的至少两种结构，并且当分析物相对于通道移动时进行一次或多次测量，从而确定分析物的存在、不存在或一个或多个特性。分析物可以穿过纳米孔收缩部，然后穿过辅助蛋白收缩部。在替代实施例中，取决于膜中孔复合物的取向，分析物可以穿过辅助蛋白收缩部，然后穿过纳米孔收缩部。

在一个实施例中，方法用于确定目标分析物的存在、不存在或一个或多个特性。方法可以用于确定至少一种分析物的存在、不存在或一个或多个特性。方法可以涉及确定两种或更多种分析物的存在、不存在或一个或多个特性。方法可以包括确定任何数量的分析物(如2种、5种、10种、15种、20种、30种、40种、50种、100种或更多种分析物)的存在、不存在或一个或多个特性。可以确定一种或多种分析物的任何数量的特性，如1种、2种、3种、4种、5种、10种或更多种特性。

分子在孔复合物的通道中或通道的任一开口附近的结合将对通过孔的开放通道离子流产生影响，这是孔通道的“分子感测”的本质。以与核酸测序应用类似的方式，可以使用合适的测量技术通过电流的变化来测量开放通道离子流的变化(例如，WO 2000/28312和D.Stoddart等人,《美国国家科学院院刊》,2010,106,7702-7或WO 2009/077734)。通过电流的减少测量的离子流的减少程度与孔内或孔附近的障碍物的大小有关。因此，孔中或孔附近的所关注分子(也称为“分析物”)的结合提供了可检测和可测量的事件，从而形成了“生物传感器”的基础。用于纳米孔感测的合适的分子包含核酸；蛋白质；肽；多糖和小分子(此处指低分子量(例如，<900Da或<500Da)有机或无机化合物)，如药物、毒素、细胞因子和污染物。检测生物分子的存在可应用于个性化药物开发、医学、诊断、生命科学研究、环境监测以及安全和/或国防工业。

目标分析物可以是金属离子、无机盐、聚合物、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、多糖、染料、漂白剂、药物、诊断剂、娱乐性药物、爆炸物、有毒化合物或环境污染物。方法可以涉及确定两种或更多种相同类型的分析物(例如两种或更多种蛋白质、两种或更多种核苷酸或两种或更多种药物)的存在、不存在或一个或多个特性。可替代地，方法可以涉及确定两种或更多种不同类型的分析物(例如一种或多种蛋白质、一种或多种核苷酸和一种或多种药物)的存在、不存在或一个或多个特性。

可以从细胞分泌目标分析物。可替代地，目标分析物可以是存在于细胞内部的分析物，使得在实施方法之前必须从细胞中提取分析物。

在一个实施例中，分析物是氨基酸、肽、多肽或蛋白质。氨基酸、肽、多肽或蛋白质可以是天然存在的或非天然存在的。多肽或蛋白质可以包含在合成或经修饰的氨基酸内。对氨基酸的若干不同类型的修饰在本领域中是已知的。合适的氨基酸和其修饰如上所述。应理解，可以通过本领域中可用的任何方法来修饰目标分析物。

在优选实施例中，分析物是多核苷酸，如核酸。多核苷酸定义为包括两个或更多个核苷酸的大分子。DNA和RNA中天然存在的核酸碱基可以通过其物理大小来区分。当核酸分子或单独的碱基穿过纳米孔的通道时，碱基之间的大小差异会导致通过通道的离子流直接相关地减少。可以记录离子流的变化。用于记录离子流变化的合适的电测量技术描述于例如WO 2000/28312和D.Stoddart等人,《美国国家科学院院刊》,2010,106,第7702-7页(单通道记录设备)；以及例如WO 2009/077734(多通道记录技术)中。通过适当的校准，离子流的特性减少可以用于实时鉴定穿过通道的特定核苷酸和相关碱基。在典型的纳米孔核酸测序中，由于通道被核苷酸部分堵塞，当所关注的核酸序列的单个核苷酸按顺序穿过纳米孔的通道时，开放通道离子流减少。使用上述合适的记录技术测量的正是这种离子流的减少。可以将离子流的减少校准为通过通道的已知核苷酸的测量离子流的减少，从而产生用于确定哪个核苷酸正在穿过通道的手段，并且因此，当按顺序进行时，产生确定穿过纳米孔的核酸的核苷酸序列的方式。为了准确地确定单独的核苷酸，通常需要使通过通道的离子流的减少与穿过收缩部(或“读取头”)的单独的核苷酸的大小直接相关。应当理解，例如，可以对完整的核酸聚合物执行测序，所述完整的核酸聚合物例如通过相关聚合酶或解旋酶的作用“穿过”孔。可替代地，可以通过使已经从邻近孔的靶核酸中按顺序去除的核苷酸三磷酸碱基的通路来确定序列(参见例如WO 2014/187924)。

多核苷酸或核酸可以包括任何核苷酸的任何组合。核苷酸可以是天然存在的或人工的。多核苷酸中的一或多个核苷酸可以是氧化的或甲基化的。多核苷酸中的一或多个核苷酸可以是受损的。例如，多核苷酸可以包括嘧啶二聚体。此类二聚体通常与紫外线损伤有关并且是皮肤黑色素瘤的主要病因。多核苷酸中的一或多个核苷酸可以例如用标记或标签修饰，所述标记或标签的合适的实例是技术人员已知的。多核苷酸可以包括一或多个间隔子。核苷酸通常含有核碱基、糖和至少一个磷酸基。核碱基和糖形成核苷。核碱基通常是杂环的。核碱基包含但不限于嘌呤和嘧啶，并且更具体地包含腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)。糖通常是戊糖。核苷酸糖包含但不限于核糖和脱氧核糖。糖优选地是脱氧核糖。多核苷酸优选地包括以下核苷：脱氧腺苷(dA)、脱氧尿苷(dU)和/或胸苷(dT)、脱氧鸟苷(dG)和脱氧胞苷(dC)。核苷酸通常是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。核苷酸通常含有单磷酸、二磷酸或三磷酸。核苷酸可以包括多于三个磷酸，如4个或5个磷酸。磷酸可以附接在核苷酸的5'或3'侧上。多核苷酸中的核苷酸可以以任何方式彼此附接。核苷酸通常通过其糖和磷酸基附接，如在核酸中那样。核苷酸可以通过其核碱基连接，如在嘧啶二聚体中那样。多核苷酸可以是单链的或双链的。多核苷酸的至少一部分优选地是双链的。多核苷酸最优选地是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。具体地，使用多核苷酸作为分析物的所述方法可替代地包括确定选自以下的一个或多个特性：(i)多核苷酸的长度；(ii)多核苷酸的同一性；(iii)多核苷酸的序列；(iv)多核苷酸的二级结构；和(v)多核苷酸是否被修饰。

多核苷酸可以是任何长度(i)。例如，多核苷酸的长度可以是至少10个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少400个或至少500个核苷酸或核苷酸对。多核苷酸的长度可以是1000个或更多个核苷酸或核苷酸对、5000个或更多个核苷酸或核苷酸对、或长度是100000个或更多个核苷酸或核苷酸对。可以研究任何数量的多核苷酸。例如，方法可以涉及表征2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、50个、100个或更多个多核苷酸。如果表征两个或更多个多核苷酸，则其可以是不同的多核苷酸或同一多核苷酸的两个实例。多核苷酸可以是天然存在的或人工的。例如，方法可以用于验证所制造寡核苷酸的序列。方法通常在体外进行。

核苷酸可以具有任何同一性(ii)，并且包含但不限于单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸鸟苷(GMP)、单磷酸胸苷(TMP)、单磷酸尿苷(UMP)、单磷酸5-甲基胞苷、单磷酸5-羟基甲基胞苷、单磷酸胞苷(CMP)、单磷酸环腺苷(cAMP)、单磷酸环鸟苷(cGMP)、单磷酸脱氧腺苷(dAMP)、单磷酸脱氧鸟苷(dGMP)、单磷酸脱氧胸苷(dTMP)、单磷酸脱氧尿苷(dUMP)、单磷酸脱氧胞苷(dCMP)和单磷酸脱氧甲基胞苷。核苷酸优选地是选自AMP、TMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP、dCMP和dUMP。核苷酸可以无碱基(即缺乏核碱基)。核苷酸还可以缺乏核碱基和糖(即，是C3间隔子)。核苷酸(iii)的序列由链的5'到3'方向上在整个多核苷酸菌株中彼此附接的以下核苷酸的连续同一性确定。

以下实例展示本发明。

实例1：蛋白质表达与纯化

将phi29门户蛋白通道的工程化基因克隆到表达载体中。新构建的克隆被转化为BL21(DE3)大肠杆菌细菌。成功转化的细菌在10mL Luria-Bertani(LB)培养基中于37℃培养过夜。将这些培养的细菌转移到500mL的新鲜LB培养基。当OD600达到0.5-0.6时，将0.5mMIPTG添加到培养基以诱导蛋白质表达。离心后诱导3小时后收集细菌。用法式压力机裂解细菌壁，并且通过离心来分化蛋白质和其它组分。施加带有His标签的Ni-NTA His结合树脂来纯化突变蛋白。简言之，将2ml的再生的His树脂装入柱中。将通过离心分化的上清液加载到柱中。然后用洗涤缓冲液洗涤柱以去除任何污染物蛋白质。使用含有500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱蛋白质。收集洗脱液并浓缩至5mL。洗脱液以12000rpm离心10分钟，并且然后吸收上清液，并用注射器注入到AKTA FPLC中。注射之前，样品环用10mL裂解缓冲液洗涤。在通过尺寸排阻柱之后收集蛋白质。运行SDS-PAGE凝胶以检查蛋白质样品。所有野生型和突变蛋白质都以这种方式表达和纯化。通常，蛋白质储存在-20℃下，分装在多个管中，以避免重复冻融循环。

phi29门户蛋白的序列是已知的，并且可在Genbank中获得(Genbank登录号ACE96033)。产生了具有以下突变的突变phi29 gp10门户蛋白：

-A79C；

-E135C；

-Q168C；

-R10L、E14V、R17L和N-7Δ(突变体-b)；

-R10L、E14V、R17L、Q18L、R22I和N端-7Δ(突变体-c)；

-I-L添加到N端(突变体-d)；以及

-R10L、E14V、R17L、N端-7Δ，其中I-L添加到N端(突变体-e)

实例2：MinION装置中的孔插入

为了将工程化蛋白质通道插入到ONT膜中，将1mg/ml浓度的蛋白质在C13缓冲液(25mM磷酸钾、150mM亚铁氰化钾、150mM铁氰化钾，pH 8)中稀释1000倍。通过MinION流通池的灌注端口添加200μl稀释的蛋白质样品。然后施加从+50到+350mV的斜升电压(5mV增量；保持20秒)以帮助插入蛋白质通道。然后用2mL C13缓冲液冲洗流通池。然后通常运行I-V曲线，±50、±100、±150、±200mV，其中保持时间可变(在每个电压下保持2分钟到10分钟)，以观察随时间变化的孔行为。将如DNA或肽(1pM浓度)等分析物悬浮在C13缓冲液中并且添加到流通池以检查孔功能。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与所公开的本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。本文所引用的出版物以及其所引用的材料通过引用具体并入。

所属领域的技术人员将认识到或顶多使用常规实验就能够确定本文所描述的本发明特定实施例的许多等效物。此类等效物旨在由所附权利要求书涵盖。

序列表

SEQ ID NO: 1-野生型phi29 gp-10的氨基酸序列

1 MARKRSNTYR SINEIQRQKR NRWFIHYLNY LQSLAYQLFE WENLPPTINP

51 SFLEKSIHQF GYVGFYKDPV ISYIACNGAL SGQRDVYNQA TVFRAASPVY

101 QKEFKLYNYR DMKEEDMGVV IYNNDMAFPT TPTLELFAAE LAELKEIISV

151 NQNAQKTPVL IRANDNNQLS LKQVYNQYEG NAPVIFAHEA LDSDSIEVFK

201 TDAPYVVDKL NAQKNAVWNE MMTFLGIKNA NLEKKERMVT DEVSSNDEQI

251 ESSGTVFLKS REEACEKINE LYGLNVKVKF RYDIVEQMRR ELQQIENVSR

301 GTSDGETNE

序列表

<110> 牛津纳米孔科技公司

<120> 孔

<130> N416084WO

<150> 62/831,671

<151> 2019-04-09

<160> 21

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 309

<212> PRT

<213> 噬菌体phi-29

<400> 1

Met Ala Arg Lys Arg Ser Asn Thr Tyr Arg Ser Ile Asn Glu Ile Gln

1 5 10 15

Arg Gln Lys Arg Asn Arg Trp Phe Ile His Tyr Leu Asn Tyr Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Ala Tyr Gln Leu Phe Glu Trp Glu Asn Leu Pro Pro Thr Ile

35 40 45

Asn Pro Ser Phe Leu Glu Lys Ser Ile His Gln Phe Gly Tyr Val Gly

50 55 60

Phe Tyr Lys Asp Pro Val Ile Ser Tyr Ile Ala Cys Asn Gly Ala Leu

65 70 75 80

Ser Gly Gln Arg Asp Val Tyr Asn Gln Ala Thr Val Phe Arg Ala Ala

85 90 95

Ser Pro Val Tyr Gln Lys Glu Phe Lys Leu Tyr Asn Tyr Arg Asp Met

100 105 110

Lys Glu Glu Asp Met Gly Val Val Ile Tyr Asn Asn Asp Met Ala Phe

115 120 125

Pro Thr Thr Pro Thr Leu Glu Leu Phe Ala Ala Glu Leu Ala Glu Leu

130 135 140

Lys Glu Ile Ile Ser Val Asn Gln Asn Ala Gln Lys Thr Pro Val Leu

145 150 155 160

Ile Arg Ala Asn Asp Asn Asn Gln Leu Ser Leu Lys Gln Val Tyr Asn

165 170 175

Gln Tyr Glu Gly Asn Ala Pro Val Ile Phe Ala His Glu Ala Leu Asp

180 185 190

Ser Asp Ser Ile Glu Val Phe Lys Thr Asp Ala Pro Tyr Val Val Asp

195 200 205

Lys Leu Asn Ala Gln Lys Asn Ala Val Trp Asn Glu Met Met Thr Phe

210 215 220

Leu Gly Ile Lys Asn Ala Asn Leu Glu Lys Lys Glu Arg Met Val Thr

225 230 235 240

Asp Glu Val Ser Ser Asn Asp Glu Gln Ile Glu Ser Ser Gly Thr Val

245 250 255

Phe Leu Lys Ser Arg Glu Glu Ala Cys Glu Lys Ile Asn Glu Leu Tyr

260 265 270

Gly Leu Asn Val Lys Val Lys Phe Arg Tyr Asp Ile Val Glu Gln Met

275 280 285

Arg Arg Glu Leu Gln Gln Ile Glu Asn Val Ser Arg Gly Thr Ser Asp

290 295 300

Gly Glu Thr Asn Glu

305

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 2

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 3

Pro Gly Gly Ser

1

<210> 4

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 4

Pro Gly Gly Gly

1

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 5

Arg Pro Pro Pro Pro Pro

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 6

Arg Pro Pro Pro Pro

1 5

<210> 7

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 7

Arg Pro Pro Gly

1

<210> 8

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 8

Pro Pro Pro Pro

1

<210> 9

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 9

Arg Pro Pro Gly

1

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 10

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro

1 5

<210> 11

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 11

Gly Gly Gly Gly

1

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 12

Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 13

Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 14

Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr

1 5

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 标签

<400> 15

Trp Ser His Pro Gln Ser Glu Lys

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 标签

<400> 16

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 标签

<400> 17

Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 标签

<400> 18

Pro Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 标签

<400> 19

Gly Gly Ser His Pro Gln Phe Glu Gly

1 5

<210> 20

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 标签

<400> 20

His His His His His His

1 5

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 21

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5