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一种铜绿假单胞菌噬菌体k8假定蛋白gp075及其突变株、突变蛋白和应用

文档序号：1703288 发布日期：2019-12-13 浏览：26次 >En<

阅读说明：本技术 一种铜绿假单胞菌噬菌体k8假定蛋白gp075及其突变株、突变蛋白和应用 (Pseudomonas aeruginosa bacteriophage K8 putative protein GP075, and mutant strain, mutant protein and application thereof ) 是由杨洪江孙利张志强李东航尤甲甲于 2019-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种铜绿假单胞菌噬菌体K8假定蛋白GP075,其核苷酸序列为SEQ No.1,其氨基酸序列为SEQ No.10。本假定蛋白GP075发生突变,突变后的蛋白具有结构蛋白的功能,该类噬菌体突变株在原识别脂多糖的基础上,增加了额外的受体识别蛋白,可识别脂多糖O-抗原缺陷型宿主细胞或者只含有核心寡糖结构(core oligosaccharides)的宿主细胞,同时具有更宽的宿主范围、更强的裂解及吸附宿主细胞的能力,有望应用于噬菌体制剂,防治铜绿假单胞菌引起的各种感染。(The invention relates to a pseudomonas aeruginosa bacteriophage K8 hypothetical protein GP075, the nucleotide sequence of which is SEQ No.1, and the amino acid sequence of which is SEQ No. 10. The protein GP075 is supposed to be mutated, the mutated protein has the function of structural protein, the phage mutant strain is additionally provided with additional receptor recognition protein on the basis of original recognition of lipopolysaccharide, can recognize lipopolysaccharide O-antigen defective host cells or host cells only containing core oligosaccharide structures (core oligosaccharides), and has wider host range and stronger capability of cracking and adsorbing the host cells, so that the phage mutant strain is expected to be applied to phage preparations and can prevent and treat various infections caused by pseudomonas aeruginosa.)

一种铜绿假单胞菌噬菌体K8假定蛋白GP075及其突变株、突变蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种铜绿假单胞菌噬菌体K8假定蛋白GP075及其突变株、突变蛋白和应用。

背景技术

铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，容易感染免疫功能低下、身体虚弱以及囊性纤维病人，导致囊性纤维病人较高的发病率和死亡率。噬菌体作为细菌的天然克星，可特异性杀死细菌，研究噬菌体与宿主之间相互作用，有助于开发噬菌体制剂，用于治疗细菌感染。近几年对铜绿假单胞菌及其噬菌体的研究与日俱增，铜绿假单胞菌的各类噬菌体感染机制越来越清晰，大多数分离的铜绿假单胞菌噬菌体识别受体为脂多糖O-抗原，研究最多是LPS合成相关的基因，主要有wbpL、wbpR、wbpO、algC、wbpV、galU、wbpT、wzy、wapH、migA、ssg和wbpS等。与此同时，大多数噬菌体利用尾部识别细胞受体，在合适的条件下，尾部和受体的相互作用诱导尾部发生结构性重排，最终传导到头-尾连接处，引发其打开，最终使噬菌体DNA释放，完成噬菌体感染过程。在现有的研究基础上铜绿假单胞菌噬菌体受体结合蛋白为尾丝蛋白，对于未知功能的假定蛋白作为受体结合蛋白的研究却很少。

近年来，随着抗菌素的滥用，抗菌素耐受型细菌的数量不断增加，耐受型细菌引起的各类感染疾病问题亟需解决。例如，铜绿假单胞菌是引起院内感染重要的条件致病菌，众所周知，噬菌体能对宿主菌进行感染，而且具有较强的宿主特异性，不影响其它非宿主的正常细胞，所以，研究噬菌体疗法，作为抗菌素的替代品，显得尤为重要。目前研究最多的鸡尾酒疗法，即混合噬菌体疗法(指将多种噬菌体混合使用，达到杀灭多种细菌的一种治疗方法)，早在2014年，欧盟启动Phagoburn计划，针对临床上常见的铜绿假单胞菌、埃希氏菌、变形杆菌、克雷白氏杆菌、葡萄球菌引起的各种感染，“鸡尾酒疗法”起到了良好的效果，并对鸡尾酒疗法的安全性进行了评价。另一方面，在应用噬菌体制剂治疗细菌感染的同时，亦可考虑噬菌体制剂与抗生素联合用药达到治疗效果。

在噬菌体体内和体外的杀菌实验中，针对不同的宿主菌，同一噬菌体杀菌效率不同，这和噬菌体感染宿主菌的过程受到宿主菌基因表达水平的影响有关，噬菌体裂解宿主依赖于宿主菌的机制，从而增加了噬菌体裂解宿主菌的复杂程度。了解更多与噬菌体感染相关的宿主基因，这将有利于噬菌体的治疗效率，并且在未来提供多种临床感染的治疗方案。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种铜绿假单胞菌噬菌体K8假定蛋白GP075及其突变株、突变蛋白和应用，该假定蛋白GP075发生突变，突变后的蛋白具有结构蛋白的功能，该类噬菌体突变株在原识别脂多糖的基础上，增加了额外的受体识别蛋白，可识别脂多糖O-抗原缺陷型宿主细胞或者只含有核心寡糖结构(core oligosaccharides)的宿主细胞，同时具有更宽的宿主范围、更强的裂解及吸附宿主细胞的能力，有望应用于噬菌体制剂，防治铜绿假单胞菌引起的各种感染。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种铜绿假单胞菌噬菌体K8假定蛋白GP075，其核苷酸序列为SEQ No.1，其氨基酸序列为SEQ No.10。

一株铜绿假单胞菌噬菌体K8突变株K8-D7，所述突变株K8-D7能够感染脂多糖O-抗原缺陷型宿主细胞，其序列是在如上所述的假定蛋白GP075的氨基酸105、106之间***1个与106至112完全重复的氨基酸序列；所述突变株K8-D7的核苷酸序列为SEQ No.2，其氨基酸序列为SEQ No.11。

一种含有如上所述的假定蛋白GP075的突变蛋白GP075-14，其序列是在所述GP075氨基酸105、106之间***2个与106至112完全重复的氨基酸序列，所述突变蛋白GP075-14的核苷酸序列为SEQ No.3，其氨基酸序列为SEQ No.12。

一种含有如权利要求1所述的假定蛋白GP075的突变蛋白GP075-21，其序列是GP075氨基酸105、106之间***3个与106至102完全重复的氨基酸序列，所述突变蛋白GP075-21的核苷酸序列为SEQ No.4，其氨基酸序列为SEQ No.13。

一株铜绿假单胞菌噬菌体K8突变株K8-E126K，所述突变株K8-E126K能够感染脂多糖O-抗原缺陷型宿主细胞，其序列是在如上所述的假定蛋白GP075发生突变E126K，所述突变株K8-E126K的核苷酸序列为SEQ No.5，其氨基酸序列为SEQ No.14。

一株铜绿假单胞菌噬菌体K8突变株K8-S142L，所述突变株K8-S142L能够感染脂多糖O-抗原缺陷型宿主细胞，其序列是在如上所述的假定蛋白GP075发生突变S142L，所述突变株K8-S142L的核苷酸序列为SEQ No.6，其氨基酸序列为SEQ No.15。

一株铜绿假单胞菌噬菌体K8突变株K8-L189R，所述突变株K8-L189R能够感染脂多糖O-抗原缺陷型宿主细胞，其序列是在如上所述的假定蛋白GP075发生突变L189R，所述突变株K8-L189R的核苷酸序列为SEQ No.7，其氨基酸序列如为SEQ No.16。

一株铜绿假单胞菌噬菌体K8突变株K8-P197L，所述突变株K8-P197L能够感染脂多糖O-抗原缺陷型宿主细胞，其序列是在如上所述的假定蛋白GP075发生突变P197L，所述突变株K8-P197L的核苷酸序列为SEQ No.8，其氨基酸序列为SEQ No.17。

一株铜绿假单胞菌噬菌体K8突变株K8-T239A，所述突变株K8-T239A能够感染脂多糖O-抗原缺陷型宿主细胞，其序列是在如上所述的假定蛋白GP075发生突变T239A，所述突变株K8-T239A的核苷酸序列为SEQ No.9，其氨基酸序列为SEQ No.18。

一株铜绿假单胞菌噬菌体K8突变株K8-X，所述突变株K8-X能够感染脂多糖O-抗原缺陷型宿主细胞，GP075未发生突变。

如上所述的铜绿假单胞菌噬菌体K8突变株K8-X在铜绿假单胞菌O-抗原缺陷型菌株的生长抑制方面中、或在铜绿假单胞菌自发突变的抑制方面中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明研究过程中发现，噬菌体K8突变群体中包含多种GP075突变型噬菌体，分离得到的噬菌体K8突变株主要包括K8-D7,K8-E126K,K8-S142L,K8-L189R,K8-P197L,K8-T239A，另外在研究GP075突变多样性过程中，还发现了比例较高的两种突变蛋白GP075-14，GP075-21。以上噬菌体中假定蛋白GP075发生突变，突变后的蛋白具有结构蛋白的功能，该类噬菌体突变株在原识别脂多糖的基础上，增加了额外的受体识别蛋白，可识别脂多糖O-抗原缺陷型宿主细胞或者只含有核心寡糖结构(core oligosaccharides)的宿主细胞，同时具有更宽的宿主范围、更强的裂解及吸附宿主细胞的能力，有望应用于噬菌体制剂，防治铜绿假单胞菌引起的各种感染。

2、本发明中分离得到的K8突变株能够识别宿主细胞上新的受体核心寡糖，同时保留原对原始受体O-抗原的识别，具有双重受体的识别能力，大大提高了对铜绿假单胞菌的杀菌能力，具有对铜绿假单胞菌自发突变的抑制能力，可以应用在噬菌体制剂的开发及应用领域，解决耐受型铜绿假单胞菌引起的感染问题。

3、本发明中挖掘出噬菌体K8假定蛋白GP075突变体的新功能，经本研究该类蛋白突变体的功能被重新定义，在噬菌体感染宿主细胞过程中发挥重要作用。含有该类GP075突变体的噬菌体，强杀菌活性，可作为铜绿假单胞菌的一种噬菌体制剂，指导临床上铜绿假单胞菌感染用药，达到治疗铜绿假单胞菌感染的效果。

4、本发明中出发噬菌体K8遗传背景清晰，在此基础上力求寻找新的具有识别O-抗原缺陷型的突变噬菌体，使后续研究更具科学性。使用O-抗原缺陷型宿主细胞为指示菌分离得到噬菌体K8突变株，研究更加具有目的性。

5、本发明提供一类假定蛋白GP075突变体功能与噬菌体感染相关，该类突变体是噬菌体识别宿主细胞核心寡糖的重要结构蛋白；本发明提供多株广谱的铜绿假单胞菌噬菌体，感染脂多糖O-抗原缺陷型或者只含有核心寡糖的宿主细胞。

6、本发明的意义在于：近年来，铜绿假单胞菌已经成为医院感染疾病的主要致病菌株，但在使用抗生素治疗的过程中，铜绿假单胞菌逐渐对抗生素产生抗性，并进化出多重耐药性。为了更好地治疗铜绿假单胞菌引起的感染，科学家积极发展新型抗生素的同时，不断寻找抗生素替代品。噬菌体作为细菌的克星，能识别并杀死细菌对细菌造成的感染具有良好的治疗作用。在噬菌体K8及其噬菌体突变株全基因组中所有已知功能的蛋白中未发现毒力因子，这就为以后的噬菌体疗法奠定了良好的基础，未来噬菌体制剂使用过程中提供安全保障。

7、本发明以铜绿假单胞菌噬菌体K8为出发噬菌体，前期研究证实野生型铜绿假单胞菌噬菌体K8识别受体为脂多糖O-抗原，在宿主细胞O-抗原缺失的情况下，噬菌体K8无法感染该宿主细胞，且在现有阶段对GP075的功能没有任何研究。分离得到多株K8自发突变株，其最大的共同特点是能够感染脂多糖O-抗原缺陷型宿主细胞，并对噬菌体K8-T239A全基因组测序，分析发现该噬菌体中只有蛋白GP075的第239位由苏氨酸T突变为丙氨酸A，同时对其它噬菌体的GP075进行测序发现，该基因发生不同的突变。本发明中以此为出发点，研究GP075的新功能及对铜绿假单胞菌生长抑制的应用。

附图说明

图1为本发明中噬菌体K8突变株与宿主细胞相互作用的基本性质分析图；其中，A为噬菌体K8及突变株K8-T239A宿主范围图，B为PAK及突变株吸附率图，C为宿主菌LPS结构图；

图2为本发明中噬菌体K8突变株突变基因鉴定图；

图3为本发明中LC-MS检测K8噬菌体突变株的颗粒功能蛋白分析图；

图4为本发明中噬菌体K8突变株的抑菌杀菌能力应用图；其中，A为噬菌体K8及突变株K8-T239A抑制PAK生长曲线图，B为噬菌体K8及突变株K8-T239A抑制SK75生长曲线图，C为PAK耐受噬菌体K8及突变株K8-T239A筛选图，D为SK75耐受噬菌体K8-T239A筛选图，E为宿主菌株耐受噬菌体K8及突变株K8-T239A自发突变率图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种铜绿假单胞菌噬菌体K8假定蛋白GP075，野生型GP075蛋白，其核苷酸序列为SEQ No.1，其氨基酸序列为SEQ No.10。

一株铜绿假单胞菌噬菌体K8突变株K8-X，所述突变株K8-X能够感染脂多糖O-抗原缺陷型宿主细胞，GP075未发生突变。

如上所述的铜绿假单胞菌噬菌体K8突变株K8-X在铜绿假单胞菌O-抗原缺陷型菌株的生长抑制方面中、或在铜绿假单胞菌自发突变的抑制方面中的应用。

本发明主要分离了多株铜绿假单胞菌噬菌体K8突变株，测定该类噬菌体宿主范围，通过全基因组测序及GP075体外扩增子测序，鉴定突变噬菌体的具体突变位点，并对该类噬菌体的实际应用价值即抑菌杀菌能力进行评估。

本发明铜绿假单胞菌噬菌体K8突变株的具体分离鉴定步骤可以如下：

(1)构建铜绿假单胞菌噬菌体K8自发突变文库；

(2)采用脂多糖O-抗原缺陷型宿主细胞分离得到噬菌体K8突变株；

(3)噬菌体基因组提取，GP075基因体外扩增；

(4)噬菌体全基因组测序及GP075扩增子测序鉴定；

(5)噬菌体K8突变株作用于O-抗原缺陷型宿主细胞；

(6)噬菌体K8突变株对宿主细胞自发突变的抑制作用。

具体地，本发明相关材料步骤如下：

一、实验材料

实验所用菌株及噬菌体，具体见表1所示。

表1 本发明所用菌株及噬菌体

二、噬菌体K8突变株的分离

噬菌体K8的突变株亚群，分别以受体缺陷型铜绿假单胞菌SK2(wbpV)、SK15(wbpO)、SK45(wbpR)为指示菌200μL(OD₆₀₀＝0.6)与100μLK8噬菌体(10⁹)亚群，利用双层平板法，分离能感染O-抗原缺陷型菌株的突变噬菌体。双层平板于37℃，静置培养4h，待有清晰的噬菌斑出现，此时出现的噬菌斑即为发生突变噬菌体形成的，挑取单个噬菌斑，于新鲜LB培养液中，纯化三次，得到大小均一、透明程度相同的突变噬菌体，此时噬菌体即为K8突变株。

三、噬菌体突变株宿主范围分析

吸取200μL对数期指示菌(OD₆₀₀＝0.6)与3mL融化的软琼脂(0.5％，质量浓度m/v)混匀，迅速倒入已凝固的LB固体(琼脂的含量为1.5％，质量浓度m/v)培养基上层，室温静置15min左右，待软琼脂晾干后，1μL稀释100倍噬菌体裂解液(10⁸pfu/mL)，垂直点于双层平板的软琼脂层上，37℃，静置培养4h，观察有无透明噬菌圈形成。

四、噬菌体K8突变株全基因组测序

提取噬菌体K8-T239A基因组DNA，用核酸分析仪分析噬菌体DNA纯度和浓度，符合三项指标即DNA样品浓度不低于10ng/uL，总量不低于5ug；OD260/OD280应在1.8至2.0之间；OD260/OD230大于1.8。将符合指标的样品送去测序公司。

噬菌体全基因DNA测序使用测序平台Illumina Hiseq 2500。对测序结果进行图像识别(Base calling)，初步质量分析，使用二代测序数据质量过滤软件Trimmomatic(v0.30)去除低质量及接头序列等，对预处理后的读取映射(reads mapping)用软件Velvet_v1.2.10进行组装拼接。使用在线软件NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)并选择BLAST中的Align two sequences与噬菌体K8全基因组序列进行比对，寻找噬菌体突变株发生的的突变。

五、基因gp075扩增子测序

分别以提取的噬菌体突变株为模板，使用引物GP075-F：5’-ATATCACCGTAACTACGGT-3’，GP075-R：5’-GTTGACTGTAATCAGCCATT-3’，体外扩增基因gp075片段，进行sanger测序，将测序结果中的碱基序列，先用软件Chromas version2.4观察测序结果的可靠性(无套峰等现象)，测序可靠的序列使用软件Primer Premier 5.exe中TranslationsProtein，将碱基序列翻译成氨基酸序列，使用在线软件NCBI(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)Protein BLAST中的Align two sequences分别与蛋白GP075氨基酸序列进行比对，用于分析单个突变噬菌体中假定蛋白GP075的变化。

六、吸附率

过夜培养的宿主菌，按3％转接量接种于5mL液体LB培养基中，培养至对数期(OD₆₀₀＝0.6)，吸取650μL宿主菌与650μL(MOI＝0.001)噬菌体，混合均匀，静置吸附1min，立即吸取100μL，此时记为噬菌体总感染中心数，后13000rpm，离心30s，弃上清，加入1200μL液体LB混合均匀，再次吸取100μL，此时记为第1次洗涤后噬菌体感染中心数，按照上述洗涤方法，每一分钟洗涤一次，共洗涤6次，每次三个平行，利用双层平板法，测定每次洗涤后剩余吸附噬菌体的感染中心数。噬菌体吸附率的计算公式如下所示：

A—噬菌体的吸附率(％)；

S—离心后上清液中噬菌体的滴度(pfu/mL)；

C—没有加入细菌的对照组中噬菌体的滴度(pfu/mL)；

七、菌株LPS(Lipopolysaccharides)的提取

参照实验方法(Merino S，Gonzalez V，Tomás J M.The Polymerization ofAeromonas hydrophila AH-3O-Antigen LPS：ConcertedAction ofWecP and Wzy[J].PlosOne，2015，10(7)：e0131905.)操作如下：

(1)菌株的培养：分别挑取纯化后单菌落，无菌环境下，接种于5mL LB液体培养基中，37℃，220rpm，过夜培养，次日3％转接量转接至100mL LB液体培养基中，培养至对数期(OD600＝0.6)，4℃，7000rpm，离心10min，弃上清，收集菌体，用5mL蒸馏水，重悬菌体，混合均匀后，待用。

(2)热酚水法：向上述重悬菌液中加入等体积的水饱和酚，68℃、120rpm，水浴摇床，作用30min，后冰浴30min，4℃，7000rpm，离心10min，收集水相，重复上述操作两次。

(3)透析：将上述收集的水相吸取至透析袋中，搅拌蒸馏水进行透析，每4h换一次蒸馏水，透析20h，至完全将水饱和酚透析除去。

(4)浓缩水相：用30％的PEG8000对透析袋中的水相进行浓缩，30-60min左右，至浓缩液体积约为1mL。

(5)乙醇沉降：将浓缩液吸出，加入2倍体积的无水乙醇，1/10体积的醋酸钠溶液，于-20℃，过夜沉降。

(6)LPS的洗涤：沉降后12000rpm，离心10min，弃上清，即得到LPS。后用75％乙醇洗涤两次，弃上清，尽量将多余液体吸干，室温放置30min，待LPS样品晾干后，加入适量无菌水，-20℃保存。

八、LC-MS检测噬菌体蛋白颗粒

参照实验方法描述(Yang H,Liang L,Lin S,&Jia S(2010)Isolation andcharacterization of a virulent bacteriophage AB1 of Acinetobacterbaumannii.BMC microbiology 10:131.)，使用SDS-PAGE对噬菌体颗粒蛋白进行分离，得到分离后的噬菌体颗粒蛋白胶，用特异性的酶解方法将蛋白质切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽的相对分子质量，将所得的蛋白酶解肽段质量数在相应的数据库中检索，寻找与之匹配的蛋白片段。

分离后的SDS-PAGE按照如下质谱检测方法(Hellman J.Polyacrylamidelamination enables mass spectrometry compatible staining and in-gel digestionof proteins separated by agarose IEF[J].Proteomics，2007，7(19)：3441-4.)，进行结构蛋白检测，每个蛋白组样品进行胶内酶切，约按胰蛋白酶：蛋白＝1：40进行酶解；

每个1D胶泳道分成4个部分，分别进行酶切。

LC-MS检测分析

(1)液相条件:A相：water(0.1％甲酸),B相：Acetonitrile(0.1％甲酸)，流速300nL/min；梯度:0-5min,2％B；5-80min,2％-25％B；85-100min,25％-35％B；100-105min,35％-95％；105-120min,95％B；C18柱。

(2)质谱条件：电压2.2kv,MS扫描范围350-1550m/z，检测器orbitrap；MS2采用HCD进行碎裂，利用ion trap进行检测。

LC-MS数据分析

(3)采用mascot v2.5软件(Matrixscience，Boston,USA)搜索提供的数据库进行蛋白鉴定，利用MaxQuant软件进行比较分析。

(4)所使用的液质联用高分辨质谱仪(LC-MS)信息：Obitrap Fusion(Thermofisher,San Jose,USA)。

数据筛选原则：

(1)pep_expect值≤0.01的较为可信

(2)所鉴定的蛋白要求有2个以上独立的特征片段

(3)其他数据作为参考。

九、噬菌体抑菌实验应用

噬菌体抑菌曲线实验方法：过夜培养的宿主菌，按3％转接量接种于96孔细菌培养皿中，加入稀释后的噬菌体(MOI＝0.001)，对照组不加噬菌体(MOI＝0)，每组平行三次。37℃，160rpm培养，每隔0.5h利用多功能酶标仪测定OD₆₀₀，至5.5h，测定噬菌体存在与否情况下，宿主菌的生长速率。

1.铜绿假单胞菌耐受噬菌体自发突变测定

采用返浊法测定噬菌体作用下，野生型铜绿假单胞菌株耐受噬菌体的自发突变频率(张克斌，陈志瑾，金晓琳，等.铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及耐噬菌体突变频率测定关[J].微生物学通报，2002，29(1)：40-45.)。将过夜培养的宿主菌PAK、RO2-15进行梯度稀释，至10^-10。于10^-6、10^-7、10^-8稀释管中各取样100μL，用菌落计数法测出细菌数/mL。同时，向每个稀释度管中加入噬菌体原液(10¹⁰pfu/mL)10μL，混匀，37℃振荡培养，4～6h后可见各管逐渐开始变清，表明细菌已裂解，继续培养至20h，可发现自高浓度菌液管开始逐渐返浊，直到第二天不再有新的返浊管出现为止。此时判读结果：能返浊的最低浓度管中所含细菌数的倒数，即为耐受突变的频率。每组实验做10个平行。

2.结果与讨论

本发明中以O-抗原缺陷型宿主细胞分离得到多株噬菌体K8突变株，本发明以K8-T239A为典型代表，进行一下研究。

(1)噬菌体K8突变株分离及基本性质测定

本发明中以O-抗原缺陷型宿主细胞分离得到多株噬菌体K8突变株，本发明以K8-T239A为典型代表，进行一下研究。铜绿假单胞菌PAK转座子Tn5G***突变株SK98(ssg),SK75(wzy),SK2(wbpV),M21(galU),SK15(wbpO),P2-25(wapH),SK45(wbpR)，spottingassay均耐受K8，其中SK75，SK2,SK15,SK45对噬菌体K8-T239A敏感形成噬菌斑透明圈，SK98,M21,P2-25对噬菌体K8-T239A耐受(图1A)。PAK及7株***突变株与噬菌体K8、K8-T239A吸附能力结果中发现PAK，SK75，SK2,SK15,SK45对K8与K8-T239A的吸附能力存在显著差异，即K8-T239A的吸附能力比K8强，但所有突变株吸附能力均比PAK低(图1B)。

菌株突变基因的表型分析发现，野生型PAK同时具有LPS OSA和Coreoligosaccharide，缺失基因分别为wzy,wbpV,wbpO,wbpR的突变菌株SK75,SK2,SK15,SK45，推测其基因型表现为LPS OSA缺失，由SK98,M21,P2-25***缺失基因分别为ssg,galU,wapH推测，这三株细菌的LPS完全缺失(图1C)。Tricine-SDS-PAGE分析PAK和7株***突变株的脂多糖成分，发现在对噬菌体K8-T239A敏感的菌株PAK,SK75，SK2,SK15,SK45中均存在LPSCore oligosaccharide，耐受噬菌体K8-T239A的SK98,M21,P2-25菌株脂多糖成分完全缺失(图1C)。Tricine-SDS-PAGE结果与之前基因型推测完全吻合，结合spotting assay结果，不难推测K8-T239A识别新受体为LPS Core oligosaccharide，但同时又保留对原受体LPSOSA的识别。

(2)噬菌体全基因组测序及扩增子测序分析

全基因组测序发现，噬菌体K8-T239A与K8相比，整个基因组序列上只有一处发生点突变，进一步分析发现该点突变出现在基因gp075碱基水平第715位由A→G(腺嘌呤突变为鸟嘌呤)，氨基酸水平239位T→A(苏氨酸突变为丙氨酸)，该蛋白注释为假定蛋白；同时对分离得到的其它噬菌体突变株的基因gp075进行扩增子测序，有25株GP075发生SVN(点突变，Single nucleotide site variation)，突变发生在基因gp075上四个不同位置，氨基酸水平分析，E126K第126位由E谷氨酸突变为K赖氨酸(如序列14)，S142L第142位由S丝氨酸突变为L亮氨酸(如序列15)，L189R第189位由L亮氨酸突变为R精氨酸(如序列16)，P197L第197位由P脯氨酸突变为L亮氨酸(如序列17)；有11株GP075没有发生突变，推测突变发生在其它假定蛋白或结构蛋白；另外有一处***重复序列CGGTGCTCCATGGTACTCGGT，位于基因gp075第314和315位之间，该21bp重复序列和基因gp075原始序列315至335的序列完全相同，更有趣的是该重复序列的开始和结束以及与之相邻的4个碱基序列均为CGGT(如核酸序列2),正是由于原始序列的这一特性，才使得***位点位于314和315之间，但编码的氨基酸却没有发生任何移码突变，与GP075的第106至112有7个氨基酸的重复序列即GAPWY S V(如序列11)，(图2)。

(3)LC-MS检测噬菌体突变株颗粒蛋白

SDS-PAGE分离噬菌体K8、K8-T239A颗粒中结构蛋白，LC-MS进一步鉴定凝胶上分离的结构蛋白。鉴定结果分析，K8-T239A中存在13种蛋白质，噬菌体K8颗粒中仅存在12种蛋白质，比较后发现噬菌体K8颗粒比噬菌体K8-T239A少了假定蛋白GP075，两者其它12种鉴定蛋白均一致，包括8个功能蛋白，分别是GP035、GP057、GP062、GP063、GP068、GP074、GP076、GP078，对应的蛋白功能分别为DNA连接酶(DNA ligase)，主要衣壳蛋白(majorcapsidprotein)，假定结构蛋白(putative structural protein)，假定结构蛋白(putative structural protein)，假定卷尺蛋白(putative tape measure protein)，假定基板蛋白(putative baseplate relatedprotein)，假定尾丝蛋白(putative tailfiberprotein)，假定尾丝蛋白(putative tail fiberprotein)；4个假定蛋白分别由GP053，GP056，GP071，GP110编码(图3)。该结果表明GP075蛋白突变体具有了新的功能，可以作为没有被注释功能的结构蛋白发挥作用。

(4)噬菌体抑菌应用

噬菌体的基本性质之一是感染宿主细胞，使宿主细胞裂解，噬菌体与宿主细胞共培养，可抑制宿主细胞的生长。野生型铜绿假单胞菌PAK生长曲线中，未加噬菌体对照组，培养至5.5h，OD600达0.7，分别与噬菌体K8、K8-T239A共培养，至2.0h后PAK几乎停止生长过，噬菌体K8、K8-T239A对PAK的生长有很强的抑制作用(图4A)。相同数量的K8、K8-T239A与不同稀释度(10倍梯度稀释)的PAK共培养，观察各稀释度菌液的浑浊情况，PAK最小浑浊浓度即可计算PAK耐受噬菌体自发突变率，结果显示，PAK与K8共培养，在PAK菌浓为7.0×10⁵cfu/ml时仅有一管出现澄清，但在菌浓7.0×10⁴cfu/ml时，共培养液全部澄清，说明PAK最小浑浊浓度均值为7.0×10⁵cfu/ml，计算PAK耐受K8自发突变频率均值为2.91×10^-6；K8-T239A与PAK共培养，最小浑浊浓度为7.0×10⁸cfu/ml，计算PAK耐受K8-T239A的自发突变频率均值为2.83×10^-9，PAK耐受K8-T239A的自发突变频率远比K8的要低，而且存在显著差异(图4B，4E)。

SK75生长曲线，未加噬菌体的SK75生长状况作为对照，培养至5.5h，OD600达0.7，加入噬菌体K8后，SK75的生长状况并没有收到抑制，OD600达到0.69；加入噬菌体K8-TT239A与SK75共同培养，至3.0h后，SK75的生长受到抑制，而后几乎停止生长，如此可见K8-T239A对SK75的生长有抑制作用(图4C)。SK75与K8-T239A共培养，SK75菌浓为1.04×10²cfu/ml时仍然有两管浑浊，菌浓为1.04×10cfu/ml时共培养液全部澄清，说明SK75最小浑浊浓度主要集中在1.04×10³cfu/ml，计算SK75耐受K8-T239A自发突变频率均值为9.93×10^-4(图4D，图4E)。噬菌体K8、K8-T239A有效抑制PAK的生长，共培养时，PAK耐受K8-T239A的自发突变率远比K8低1000倍；同时K8-T239A抑制SK75生长，K8-T239A作用下能够在一定程度上抑制SK75的自发突变，比PAK耐受K8-T239A的突变频率高10⁶，以上结果进一步证实了K8-T239A能够识别双重受体，很好的应用价值。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

序列1 铜绿假单胞菌噬菌体K8基因gp075核酸序列

ATGGCTGTCAACCAATTTGACAGAGAAGATTATCTGGAGGTGGCCCGGGAACGGGTCACTGAACAGTTTAAAGAGAAGCCGATCTTTGATCGCTTCCTGCAAGTGCTATTGTCTGGTAAGTTTGATATCCAGAATGCACTGGAAGACCTCCAGACTCTCCGGTCTCTGGACACAGCCACCGGGAAGCAACTGGACATTATCGGAGACATTGTAGGGCGACCACGCGGTCTAGTGTACCAAGATATTTTCAACTATTTTGGATTCGCTGGAACGGAGCGTGCAGGTTCTTTCGGAAGCCTGTCGGACCCTACGGTCGGTGCTCCATGGTACTCGGTCGGTGCTCCAACTGGTAACGCCAGAGAGCCGAGCGACGAAGAGTATCGGATGATCCTGAAAGCAAAGATCATCAAGAACAGAACAAACTCAACCCCAGAGCAAGTTATCGAAGCTTATAAATTTGTATTCGGGGTTCCTGAAGTATTCCTAGAGGAGTACGCTCCCGCTGCTGTCCGTATCGGCATCGGTAAGATTCTAACGAACGTAGAGCGTAGTCTTCTATTCGACCTAGGTGGTGCAGGTGCATTGCTTCCTAAGACTATCGGGGTTAACTACACATACACTGAGTTCCAAGCTGGCCGGGTATTTGCTACAGAAGGCTTCCCCGGAGGACAAGGCGTTGGAGACCTAAATGATCCCACTGTTGGTGGAATTCTGACCAACCTAGTGACATAA

序列2 铜绿假单胞菌噬菌体K8-D7基因gp075核酸序列

ATGGCTGTCAACCAATTTGACAGAGAAGATTATCTGGAGGTGGCCCGGGAACGGGTCACTGAACAGTTTAAAGAGAAGCCGATCTTTGATCGCTTCCTGCAAGTGCTATTGTCTGGTAAGTTTGATATCCAGAATGCACTGGAAGACCTCCAGACTCTCCGGTCTCTGGACACAGCCACCGGGAAGCAACTGGACATTATCGGAGACATTGTAGGGCGACCACGCGGTCTAGTGTACCAAGATATTTTCAACTATTTTGGATTCGCTGGAACGGAGCGTGCAGGTTCTTTCGGAAGCCTGTCGGACCCTACGGTCGGTGCTCCATGGTACTCGGTCGGTGCTCCATGGTACTCGGTCGGTGCTCCAACTGGTAACGCCAGAGAGCCGAGCGACGAAGAGTATCGGATGATCCTGAAAGCAAAGATCATCAAGAACAGAACAAACTCAACCCCAGAGCAAGTTATCGAAGCTTATAAATTTGTATTCGGGGTTCCTGAAGTATTCCTAGAGGAGTACGCTCCCGCTGCTGTCCGTATCGGCATCGGTAAGATTCTAACGAACGTAGAGCGTAGTCTTCTATTCGACCTAGGTGGTGCAGGTGCATTGCTTCCTAAGACTATCGGGGTTAACTACACATACACTGAGTTCCAAGCTGGCCGGGTATTTGCTACAGAAGGCTTCCCCGGAGGACAAGGCGTTGGAGACCTAAATGATCCCACTGTTGGTGGAATTCTGACCAACCTAGTGACATAA

序列3 蛋白GP075-14核酸序列

ATGGCTGTCAACCAATTTGACAGAGAAGATTATCTGGAGGTGGCCCGGGAACGGGTCACTGAACAGTTTAAAGAGAAGCCGATCTTTGATCGCTTCCTGCAAGTGCTATTGTCTGGTAAGTTTGATATCCAGAATGCACTGGAAGACCTCCAGACTCTCCGGTCTCTGGACACAGCCACCGGGAAGCAACTGGACATTATCGGAGACATTGTAGGGCGACCACGCGGTCTAGTGTACCAAGATATTTTCAACTATTTTGGATTCGCTGGAACGGAGCGTGCAGGTTCTTTCGGAAGCCTGTCGGACCCTACGGTCGGTGCTCCATGGTACTCGGTCGGTGCTCCATGGTACTCGGTCGGTGCTCCATGGTACTCGGTCGGTGCTCCAACTGGTAACGCCAGAGAGCCGAGCGACGAAGAGTATCGGATGATCCTGAAAGCAAAGATCATCAAGAACAGAACAAACTCAACCCCAGAGCAAGTTATCGAAGCTTATAAATTTGTATTCGGGGTTCCTGAAGTATTCCTAGAGGAGTACGCTCCCGCTGCTGTCCGTATCGGCATCGGTAAGATTCTAACGAACGTAGAGCGTAGTCTTCTATTCGACCTAGGTGGTGCAGGTGCATTGCTTCCTAAGACTATCGGGGTTAACTACACATACACTGAGTTCCAAGCTGGCCGGGTATTTGCTACAGAAGGCTTCCCCGGAGGACAAGGCGTTGGAGACCTAAATGATCCCACTGTTGGTGGAATTCTGACCAACCTAGTGACATAA

序列4 蛋白GP075-21核酸序列

ATGGCTGTCAACCAATTTGACAGAGAAGATTATCTGGAGGTGGCCCGGGAACGGGTCACTGAACAGTTTAAAGAGAAGCCGATCTTTGATCGCTTCCTGCAAGTGCTATTGTCTGGTAAGTTTGATATCCAGAATGCACTGGAAGACCTCCAGACTCTCCGGTCTCTGGACACAGCCACCGGGAAGCAACTGGACATTATCGGAGACATTGTAGGGCGACCACGCGGTCTAGTGTACCAAGATATTTTCAACTATTTTGGATTCGCTGGAACGGAGCGTGCAGGTTCTTTCGGAAGCCTGTCGGACCCTACGGTCGGTGCTCCATGGTACTCGGTCGGTGCTCCATGGTACTCGGTCGGTGCTCCATGGTACTCGGTCGGTGCTCCATGGTACTCGGTCGGTGCTCCAACTGGTAACGCCAGAGAGCCGAGCGACGAAGAGTATCGGATGATCCTGAAAGCAAAGATCATCAAGAACAGAACAAACTCAACCCCAGAGCAAGTTATCGAAGCTTATAAATTTGTATTCGGGGTTCCTGAAGTATTCCTAGAGGAGTACGCTCCCGCTGCTGTCCGTATCGGCATCGGTAAGATTCTAACGAACGTAGAGCGTAGTCTTCTATTCGACCTAGGTGGTGCAGGTGCATTGCTTCCTAAGACTATCGGGGTTAACTACACATACACTGAGTTCCAAGCTGGCCGGGTATTTGCTACAGAAGGCTTCCCCGGAGGACAAGGCGTTGGAGACCTAAATGATCCCACTGTTGGTGGAATTCTGACCAACCTAGTGACATAA

序列5 铜绿假单胞菌噬菌体K8-E126K基因gp075核酸序列

ATGGCTGTCAACCAATTTGACAGAGAAGATTATCTGGAGGTGGCCCGGGAACGGGTCACTGAACAGTTTAAAGAGAAGCCGATCTTTGATCGCTTCCTGCAAGTGCTATTGTCTGGTAAGTTTGATATCCAGAATGCACTGGAAGACCTCCAGACTCTCCGGTCTCTGGACACAGCCACCGGGAAGCAACTGGACATTATCGGAGACATTGTAGGGCGACCACGCGGTCTAGTGTACCAAGATATTTTCAACTATTTTGGATTCGCTGGAACGGAGCGTGCAGGTTCTTTCGGAAGCCTGTCGGACCCTACGGTCGGTGCTCCATGGTACTCGGTCGGTGCTCCAACTGGTAACGCCAGAGAGCCGAGCGACGAAAAGTATCGGATGATCCTGAAAGCAAAGATCATCAAGAACAGAACAAACTCAACCCCAGAGCAAGTTATCGAAGCTTATAAATTTGTATTCGGGGTTCCTGAAGTATTCCTAGAGGAGTACGCTCCCGCTGCTGTCCGTATCGGCATCGGTAAGATTCTAACGAACGTAGAGCGTAGTCTTCTATTCGACCTAGGTGGTGCAGGTGCATTGCTTCCTAAGACTATCGGGGTTAACTACACATACACTGAGTTCCAAGCTGGCCGGGTATTTGCTACAGAAGGCTTCCCCGGAGGACAAGGCGTTGGAGACCTAAATGATCCCACTGTTGGTGGAATTCTGACCAACCTAGTGACATAA

序列6 铜绿假单胞菌噬菌体K8-S142L基因gp075核酸序列

ATGGCTGTCAACCAATTTGACAGAGAAGATTATCTGGAGGTGGCCCGGGAACGGGTCACTGAACAGTTTAAAGAGAAGCCGATCTTTGATCGCTTCCTGCAAGTGCTATTGTCTGGTAAGTTTGATATCCAGAATGCACTGGAAGACCTCCAGACTCTCCGGTCTCTGGACACAGCCACCGGGAAGCAACTGGACATTATCGGAGACATTGTAGGGCGACCACGCGGTCTAGTGTACCAAGATATTTTCAACTATTTTGGATTCGCTGGAACGGAGCGTGCAGGTTCTTTCGGAAGCCTGTCGGACCCTACGGTCGGTGCTCCATGGTACTCGGTCGGTGCTCCAACTGGTAACGCCAGAGAGCCGAGCGACGAAGAGTATCGGATGATCCTGAAAGCAAAGATCATCAAGAACAGAACAAACTTAACCCCAGAGCAAGTTATCGAAGCTTATAAATTTGTATTCGGGGTTCCTGAAGTATTCCTAGAGGAGTACGCTCCCGCTGCTGTCCGTATCGGCATCGGTAAGATTCTAACGAACGTAGAGCGTAGTCTTCTATTCGACCTAGGTGGTGCAGGTGCATTGCTTCCTAAGACTATCGGGGTTAACTACACATACACTGAGTTCCAAGCTGGCCGGGTATTTGCTACAGAAGGCTTCCCCGGAGGACAAGGCGTTGGAGACCTAAATGATCCCACTGTTGGTGGAATTCTGACCAACCTAGTGACATAA

序列7 铜绿假单胞菌噬菌体K8-L142R基因gp075核酸序列

ATGGCTGTCAACCAATTTGACAGAGAAGATTATCTGGAGGTGGCCCGGGAACGGGTCACTGAACAGTTTAAAGAGAAGCCGATCTTTGATCGCTTCCTGCAAGTGCTATTGTCTGGTAAGTTTGATATCCAGAATGCACTGGAAGACCTCCAGACTCTCCGGTCTCTGGACACAGCCACCGGGAAGCAACTGGACATTATCGGAGACATTGTAGGGCGACCACGCGGTCTAGTGTACCAAGATATTTTCAACTATTTTGGATTCGCTGGAACGGAGCGTGCAGGTTCTTTCGGAAGCCTGTCGGACCCTACGGTCGGTGCTCCATGGTACTCGGTCGGTGCTCCAACTGGTAACGCCAGAGAGCCGAGCGACGAAGAGTATCGGATGATCCTGAAAGCAAAGATCATCAAGAACAGAACAAACTCAACCCCAGAGCAAGTTATCGAAGCTTATAAATTTGTATTCGGGGTTCCTGAAGTATTCCTAGAGGAGTACGCTCCCGCTGCTGTCCGTATCGGCATCGGTAAGATTCTAACGAACGTAGAGCGTAGTCTTCTATTCGACCGAGGTGGTGCAGGTGCATTGCTTCCTAAGACTATCGGGGTTAACTACACATACACTGAGTTCCAAGCTGGCCGGGTATTTGCTACAGAAGGCTTCCCCGGAGGACAAGGCGTTGGAGACCTAAATGATCCCACTGTTGGTGGAATTCTGACCAACCTAGTGACATAA

序列8 铜绿假单胞菌噬菌体K8-P142L基因gp075核酸序列

ATGGCTGTCAACCAATTTGACAGAGAAGATTATCTGGAGGTGGCCCGGGAACGGGTCACTGAACAGTTTAAAGAGAAGCCGATCTTTGATCGCTTCCTGCAAGTGCTATTGTCTGGTAAGTTTGATATCCAGAATGCACTGGAAGACCTCCAGACTCTCCGGTCTCTGGACACAGCCACCGGGAAGCAACTGGACATTATCGGAGACATTGTAGGGCGACCACGCGGTCTAGTGTACCAAGATATTTTCAACTATTTTGGATTCGCTGGAACGGAGCGTGCAGGTTCTTTCGGAAGCCTGTCGGACCCTACGGTCGGTGCTCCATGGTACTCGGTCGGTGCTCCAACTGGTAACGCCAGAGAGCCGAGCGACGAAGAGTATCGGATGATCCTGAAAGCAAAGATCATCAAGAACAGAACAAACTCAACCCCAGAGCAAGTTATCGAAGCTTATAAATTTGTATTCGGGGTTCCTGAAGTATTCCTAGAGGAGTACGCTCCCGCTGCTGTCCGTATCGGCATCGGTAAGATTCTAACGAACGTAGAGCGTAGTCTTCTATTCGACCTAGGTGGTGCAGGTGCATTGCTTCTTAAGACTATCGGGGTTAACTACACATACACTGAGTTCCAAGCTGGCCGGGTATTTGCTACAGAAGGCTTCCCCGGAGGACAAGGCGTTGGAGACCTAAATGATCCCACTGTTGGTGGAATTCTGACCAACCTAGTGACATAA

序列9 铜绿假单胞菌噬菌体K8-T239A基因gp075核酸序列

序列10 GP075氨基酸序列

MAVNQFDREDYLEVARERVTEQFKEKPIFDRFLQVLLSGKFDIQNALEDLQTLRSLDTATGKQLDIIGDIVGRPRGLVYQDIFNYFGFAGTERAGSFGSLSDPTVGAPWYSVGAPTGNAREPSDEEYRMILKAKIIKNRTNSTPEQVIEAYKFVFGVPEVFLEEYAPAAVRIGIGKILTNVERSLLFDLGGAGALLPKTIGVNYTYTEFQAGRVFATEGFPGGQGVGDLNDPTVGGILTNLVT

序列11 GP075-7氨基酸序列

MAVNQFDREDYLEVARERVTEQFKEKPIFDRFLQVLLSGKFDIQNALEDLQTLRSLDTATGKQLDIIGDIVGRPRGLVYQDIFNYFGFAGTERAGSFGSLSDPTVGAPWYSVGAPWYSVGAPTGNAREPSDEEYRMILKAKIIKNRTNSTPEQVIEAYKFVFGVPEVFLEEYAPAAVRIGIGKILTNVERSLLFDLGGAGALLPKTIGVNYTYTEFQAGRVFATEGFPGGQGVGDLNDPTVGGILTNLVT

序列12 GP075-14氨基酸序列

MAVNQFDREDYLEVARERVTEQFKEKPIFDRFLQVLLSGKFDIQNALEDLQTLRSLDTATGKQLDIIGDIVGRPRGLVYQDIFNYFGFAGTERAGSFGSLSDPTVGAPWYSVGAPWYSVGAPWYSVGAPTGNAREPSDEEYRMILKAKIIKNRTNSTPEQVIEAYKFVFGVPEVFLEEYAPAAVRIGIGKILTNVERSLLFDLGGAGALLPKTIGVNYTYTEFQAGRVFATEGFPGGQGVGDLNDPTVGGILTNLVT

序列13 GP075-21氨基酸序列

MAVNQFDREDYLEVARERVTEQFKEKPIFDRFLQVLLSGKFDIQNALEDLQTLRSLDTATGKQLDIIGDIVGRPRGLVYQDIFNYFGFAGTERAGSFGSLSDPTVGAPWYSVGAPWYSVGAPWYSVGAPWYSVGAPTGNAREPSDEEYRMILKAKIIKNRTNSTPEQVIEAYKFVFGVPEVFLEEYAPAAVRIGIGKILTNVERSLLFDLGGAGALLPKTIGVNYTYTEFQAGRVFATEGFPGGQGVGDLNDPTVGGILTNLVT

序列14 GP075-E126K氨基酸序列

MAVNQFDREDYLEVARERVTEQFKEKPIFDRFLQVLLSGKFDIQNALEDLQTLRSLDTATGKQLDIIGDIVGRPRGLVYQDIFNYFGFAGTERAGSFGSLSDPTVGAPWYSVGAPTGNAREPSDEKYRMILKAKIIKNRTNSTPEQVIEAYKFVFGVPEVFLEEYAPAAVRIGIGKILTNVERSLLFDLGGAGALLPKTIGVNYTYTEFQAGRVFATEGFPGGQGVGDLNDPTVGGILTNLVT

序列15 GP075-S142L氨基酸序列

MAVNQFDREDYLEVARERVTEQFKEKPIFDRFLQVLLSGKFDIQNALEDLQTLRSLDTATGKQLDIIGDIVGRPRGLVYQDIFNYFGFAGTERAGSFGSLSDPTVGAPWYSVGAPTGNAREPSDEEYRMILKAKIIKNRTNLTPEQVIEAYKFVFGVPEVFLEEYAPAAVRIGIGKILTNVERSLLFDLGGAGALLPKTIGVNYTYTEFQAGRVFATEGFPGGQGVGDLNDPTVGGILTNLVT

序列16 GP075-L189R氨基酸序列

MAVNQFDREDYLEVARERVTEQFKEKPIFDRFLQVLLSGKFDIQNALEDLQTLRSLDTATGKQLDIIGDIVGRPRGLVYQDIFNYFGFAGTERAGSFGSLSDPTVGAPWYSVGAPTGNAREPSDEEYRMILKAKIIKNRTNSTPEQVIEAYKFVFGVPEVFLEEYAPAAVRIGIGKILTNVERSLLFDRGGAGALLPKTIGVNYTYTEFQAGRVFATEGFPGGQGVGDLNDPTVGGILTNLVT

序列17 GP075-P197L氨基酸序列

序列18 GP075-T239A氨基酸序列

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种铜绿假单胞菌噬菌体K8假定蛋白GP075及其突变株、突变蛋白和应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 732

<212> DNA

<213> 假定蛋白GP075的核苷酸序列(Unknown)

<400> 1

atggctgtca accaatttga cagagaagat tatctggagg tggcccggga acgggtcact 60

gaacagttta aagagaagcc gatctttgat cgcttcctgc aagtgctatt gtctggtaag 120

tttgatatcc agaatgcact ggaagacctc cagactctcc ggtctctgga cacagccacc 180

gggaagcaac tggacattat cggagacatt gtagggcgac cacgcggtct agtgtaccaa 240

gatattttca actattttgg attcgctgga acggagcgtg caggttcttt cggaagcctg 300

tcggacccta cggtcggtgc tccatggtac tcggtcggtg ctccaactgg taacgccaga 360

gagccgagcg acgaagagta tcggatgatc ctgaaagcaa agatcatcaa gaacagaaca 420

aactcaaccc cagagcaagt tatcgaagct tataaatttg tattcggggt tcctgaagta 480

ttcctagagg agtacgctcc cgctgctgtc cgtatcggca tcggtaagat tctaacgaac 540

gtagagcgta gtcttctatt cgacctaggt ggtgcaggtg cattgcttcc taagactatc 600

ggggttaact acacatacac tgagttccaa gctggccggg tatttgctac agaaggcttc 660

cccggaggac aaggcgttgg agacctaaat gatcccactg ttggtggaat tctgaccaac 720

ctagtgacat aa 732

<210> 2

<211> 753

<212> DNA

<213> K8-D7的核苷酸序列(Unknown)

<400> 2

atggctgtca accaatttga cagagaagat tatctggagg tggcccggga acgggtcact 60

gaacagttta aagagaagcc gatctttgat cgcttcctgc aagtgctatt gtctggtaag 120

tttgatatcc agaatgcact ggaagacctc cagactctcc ggtctctgga cacagccacc 180

gggaagcaac tggacattat cggagacatt gtagggcgac cacgcggtct agtgtaccaa 240

gatattttca actattttgg attcgctgga acggagcgtg caggttcttt cggaagcctg 300

tcggacccta cggtcggtgc tccatggtac tcggtcggtg ctccatggta ctcggtcggt 360

gctccaactg gtaacgccag agagccgagc gacgaagagt atcggatgat cctgaaagca 420

aagatcatca agaacagaac aaactcaacc ccagagcaag ttatcgaagc ttataaattt 480

gtattcgggg ttcctgaagt attcctagag gagtacgctc ccgctgctgt ccgtatcggc 540

atcggtaaga ttctaacgaa cgtagagcgt agtcttctat tcgacctagg tggtgcaggt 600

gcattgcttc ctaagactat cggggttaac tacacataca ctgagttcca agctggccgg 660

gtatttgcta cagaaggctt ccccggagga caaggcgttg gagacctaaa tgatcccact 720

gttggtggaa ttctgaccaa cctagtgaca taa 753

<210> 3

<211> 774

<212> DNA

<213> GP075-14的核苷酸序列(Unknown)

<400> 3

atggctgtca accaatttga cagagaagat tatctggagg tggcccggga acgggtcact 60

gaacagttta aagagaagcc gatctttgat cgcttcctgc aagtgctatt gtctggtaag 120

tttgatatcc agaatgcact ggaagacctc cagactctcc ggtctctgga cacagccacc 180

gggaagcaac tggacattat cggagacatt gtagggcgac cacgcggtct agtgtaccaa 240

gatattttca actattttgg attcgctgga acggagcgtg caggttcttt cggaagcctg 300

tcggacccta cggtcggtgc tccatggtac tcggtcggtg ctccatggta ctcggtcggt 360

gctccatggt actcggtcgg tgctccaact ggtaacgcca gagagccgag cgacgaagag 420

tatcggatga tcctgaaagc aaagatcatc aagaacagaa caaactcaac cccagagcaa 480

gttatcgaag cttataaatt tgtattcggg gttcctgaag tattcctaga ggagtacgct 540

cccgctgctg tccgtatcgg catcggtaag attctaacga acgtagagcg tagtcttcta 600

ttcgacctag gtggtgcagg tgcattgctt cctaagacta tcggggttaa ctacacatac 660

actgagttcc aagctggccg ggtatttgct acagaaggct tccccggagg acaaggcgtt 720

ggagacctaa atgatcccac tgttggtgga attctgacca acctagtgac ataa 774

<210> 4

<211> 795

<212> DNA

<213> GP075-21的核苷酸序列(Unknown)

<400> 4

atggctgtca accaatttga cagagaagat tatctggagg tggcccggga acgggtcact 60

gaacagttta aagagaagcc gatctttgat cgcttcctgc aagtgctatt gtctggtaag 120

tttgatatcc agaatgcact ggaagacctc cagactctcc ggtctctgga cacagccacc 180

gggaagcaac tggacattat cggagacatt gtagggcgac cacgcggtct agtgtaccaa 240

gatattttca actattttgg attcgctgga acggagcgtg caggttcttt cggaagcctg 300

tcggacccta cggtcggtgc tccatggtac tcggtcggtg ctccatggta ctcggtcggt 360

gctccatggt actcggtcgg tgctccatgg tactcggtcg gtgctccaac tggtaacgcc 420

agagagccga gcgacgaaga gtatcggatg atcctgaaag caaagatcat caagaacaga 480

acaaactcaa ccccagagca agttatcgaa gcttataaat ttgtattcgg ggttcctgaa 540

gtattcctag aggagtacgc tcccgctgct gtccgtatcg gcatcggtaa gattctaacg 600

aacgtagagc gtagtcttct attcgaccta ggtggtgcag gtgcattgct tcctaagact 660

atcggggtta actacacata cactgagttc caagctggcc gggtatttgc tacagaaggc 720

ttccccggag gacaaggcgt tggagaccta aatgatccca ctgttggtgg aattctgacc 780

aacctagtga cataa 795

<210> 5

<211> 732

<212> DNA

<213> K8-E126K的核苷酸序列(Unknown)

<400> 5

atggctgtca accaatttga cagagaagat tatctggagg tggcccggga acgggtcact 60

gaacagttta aagagaagcc gatctttgat cgcttcctgc aagtgctatt gtctggtaag 120

tttgatatcc agaatgcact ggaagacctc cagactctcc ggtctctgga cacagccacc 180

gggaagcaac tggacattat cggagacatt gtagggcgac cacgcggtct agtgtaccaa 240

gatattttca actattttgg attcgctgga acggagcgtg caggttcttt cggaagcctg 300

tcggacccta cggtcggtgc tccatggtac tcggtcggtg ctccaactgg taacgccaga 360

gagccgagcg acgaaaagta tcggatgatc ctgaaagcaa agatcatcaa gaacagaaca 420

aactcaaccc cagagcaagt tatcgaagct tataaatttg tattcggggt tcctgaagta 480

ttcctagagg agtacgctcc cgctgctgtc cgtatcggca tcggtaagat tctaacgaac 540

gtagagcgta gtcttctatt cgacctaggt ggtgcaggtg cattgcttcc taagactatc 600

ggggttaact acacatacac tgagttccaa gctggccggg tatttgctac agaaggcttc 660

cccggaggac aaggcgttgg agacctaaat gatcccactg ttggtggaat tctgaccaac 720

ctagtgacat aa 732

<210> 6

<211> 732

<212> DNA

<213> K8-S142L的核苷酸序列(Unknown)

<400> 6

atggctgtca accaatttga cagagaagat tatctggagg tggcccggga acgggtcact 60

gaacagttta aagagaagcc gatctttgat cgcttcctgc aagtgctatt gtctggtaag 120

tttgatatcc agaatgcact ggaagacctc cagactctcc ggtctctgga cacagccacc 180

gggaagcaac tggacattat cggagacatt gtagggcgac cacgcggtct agtgtaccaa 240

gatattttca actattttgg attcgctgga acggagcgtg caggttcttt cggaagcctg 300

tcggacccta cggtcggtgc tccatggtac tcggtcggtg ctccaactgg taacgccaga 360

gagccgagcg acgaagagta tcggatgatc ctgaaagcaa agatcatcaa gaacagaaca 420

aacttaaccc cagagcaagt tatcgaagct tataaatttg tattcggggt tcctgaagta 480

ttcctagagg agtacgctcc cgctgctgtc cgtatcggca tcggtaagat tctaacgaac 540

gtagagcgta gtcttctatt cgacctaggt ggtgcaggtg cattgcttcc taagactatc 600

ggggttaact acacatacac tgagttccaa gctggccggg tatttgctac agaaggcttc 660

cccggaggac aaggcgttgg agacctaaat gatcccactg ttggtggaat tctgaccaac 720

ctagtgacat aa 732

<210> 7

<211> 732

<212> DNA

<213> K8-L189R的核苷酸序列(Unknown)

<400> 7