一种提高毛豹皮樟外植体组织培养启动率的灭菌方法

文档序号：1662481 发布日期：2019-12-31 浏览：12次 >En<

阅读说明：本技术 一种提高毛豹皮樟外植体组织培养启动率的灭菌方法 (Sterilization method for improving tissue culture starting rate of cinnamomum camphora explants ) 是由戴前莉卢敏朱恒星黄飞逸黄馨于 2019-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高毛豹皮樟外植体组织培养启动率的灭菌方法,属于组织培养技术领域,所述灭菌方法的步骤如下：(1)带嫩芽的枝条活体上喷洒多菌灵溶液进行消毒；(2)采取嫩芽,清洗干净,随后放入洗衣粉液中,搅拌至嫩芽表面附着异物脱离,清洗干净,待用；(3)先剥离掉嫩芽表面一层的嫩叶,随后将嫩芽放入pvp无菌溶液中浸泡,用水冲洗干净后转入无菌水中漂洗3遍,滤干待用；(4)将滤干的嫩芽转入无菌操作台,用75wt％酒精消毒10s后漂洗干净、滤干水分,转入震荡液中消毒,随后漂洗3次,滤干水分即可。本发明的灭菌方法能有效降低毛豹皮樟的污染率,提高启动率。(The invention discloses a sterilization method for improving the tissue culture starting rate of a cinnamomum pantherinum explant, belonging to the technical field of tissue culture, and the sterilization method comprises the following steps: (1) spraying carbendazim solution on the live branches with the tender buds for disinfection; (2) adopting tender shoots, cleaning, then putting the tender shoots into a washing powder liquid, stirring until foreign matters attached to the surfaces of the tender shoots are separated, and cleaning the tender shoots for later use; (3) firstly, stripping off a layer of tender leaves on the surface of the tender shoots, then putting the tender shoots into a pvp sterile solution for soaking, washing with water, then transferring into sterile water for rinsing for 3 times, and filtering to dry for later use; (4) transferring the dried tender shoots into a sterile operating table, sterilizing with 75 wt% alcohol for 10s, rinsing, filtering to remove water, sterilizing in shaking solution, rinsing for 3 times, and filtering to remove water. The sterilization method can effectively reduce the pollution rate of the cinnamomum pantherinum and improve the starting rate.)

技术领域

本发明涉及组织培养技术领域，尤其涉及一种提高毛豹皮樟外植体组织培养启动率的灭菌方法。

背景技术

毛豹皮樟(LitseacoreanaLevl.var.lanuginose(Migo)YangetP.H.Huang)为樟科木姜子属小乔木，是西南地区古茶饮老鹰茶的主要原料植物。近年来，老鹰茶因富含山奈酚、槲皮素等黄酮类抗氧化物质，具有降血糖、降血脂的功效，且纯天然、无污染、风味独特等特性，深受市场青睐，表现较高的应用价值与经济价值。

毛豹皮樟是雌雄异株植物，种子内含有抑制生根的物质，自然成苗率极低，并且野生资源的种子繁殖难度高、遗传分化大。又因其组织中含有大量的多酚类化合物，致使扦插育苗时较难生根，所以采用组培快繁技术是解决毛豹皮樟人工繁育的主要方法之一。但是，植物组培中的污染问题是目前困扰组培工作的三大难题之一。从外植体初代培养到继代培养过程中，由于植物自身带菌或操作手法不当，均易出现内生菌污染，操作污染，环境污染，组培材料一旦出现污染，很难抢救，一般的做法是弃之另做，浪费很大的人力物力财力，更是会贻误生产，造成严重损失。目前，控制污染的研究多偏向于抗生素的控防和物理防范措施，抗生素对污染防治具有一定的针对性，但是需过滤、添加等程序，步骤繁琐；若是将抗生素随培养基高压灭菌，杀菌效果又会降低，防控效果不理想。若按照常规组培灭菌方法，外植体污染率高，增加灭菌时间可以有效降低外植体的污染率，但1‰升汞震荡消毒4min及会导致毛豹皮樟嫩芽出现不同程度的失活，酒精清洗时间过长容易出现褐化，再加上体内还含有大量酚类、醌类等物质，极易发生褐化，降低启动率；若减少灭菌时间外植体启动快，但污染率极高。所以，急需一种提高毛豹皮樟组培启动率，降低污染率的灭菌方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种提高毛豹皮樟外植体组织培养启动率的灭菌方法，能有效的提高毛豹皮樟组织培养的启动率，降低污染率，提高存活率。

本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

一种提高毛豹皮樟外植体组织培养启动率的灭菌方法，所述灭菌方法的步骤如下：

(1)带嫩芽的枝条活体上喷洒多菌灵溶液进行消毒；

(2)采取嫩芽，清洗干净，随后放入洗衣粉液中，搅拌至嫩芽表面附着异物脱离，清洗干净，待用；

(3)先剥离掉嫩芽表面一层的嫩叶，随后将嫩芽放入pvp无菌溶液中浸泡，用水冲洗干净后转入无菌水中漂洗3遍，滤干待用；

(4)将滤干的嫩芽转入无菌操作台，用75wt％酒精消毒10s后漂洗干净、滤干水分，转入震荡液中消毒，随后漂洗3次，滤干水分，随后转接至启动培养基。

进一步，步骤(1)中喷施1‰的多菌灵，早晚各一次，连续3天。

进一步，步骤(2)洗衣粉液浓度为1‰。

进一步，步骤(3)的具体操作为：先剥离掉嫩芽表面一层的嫩叶，随后将嫩芽转入1％pvp无菌溶液中浸泡10min，再转入流动的水中，用水冲洗30min，最后转入无菌水中漂洗3遍，此处用水冲洗，可选用大水10min后转为小水冲洗20min，大水、小水为本领域技术人员的常规选择流速。

进一步，所述步骤(4)中，震荡液是由1‰pvp和1‰升汞溶液按照体积比1:100混合制备而成。

进一步，经过步骤(4)中的震荡液消毒、漂洗、滤干后，再向嫩芽喷洒微晶抗菌剂，所述微晶抗菌剂含有2-5wt％的氯化钠，2-3wt％的微晶颗粒，余量为水，所述微晶颗粒内部以蛭石为核，外部包裹软钾镁矾晶体。

进一步，所述微晶颗粒的粒径为1-1.5μm。

微晶颗粒的原料包括蛭石、氯化铜、氯化钠、软钾镁矾。蛭石为单斜晶系，呈片状，具有层间域，有较大的比表面积，同时还具有一定的离子交换能力和较强的吸附性，但是蛭石中的钙离子离子交换容量较小，不易与铜离子直接置换，所以通过钠化改性，再用铜离子将离子交换容量大的钠离子交换出来，即将具有杀菌效果的铜离子插层进入，可以消灭毛豹皮樟外植体组织培养过程中的病菌，提高启动率。软钾镁矾与蛭石混合后，以蛭石为晶核进行重结晶，具有缓慢释放肥料的作用，进一步提高组织培养的成活率。

进一步，所述微晶抗菌剂的制备方法如下：

A.将粒径为1-1.5μm的蛭石加热至480-500℃，30min后取出，冷却后加入5wt％的盐酸溶液中，于70℃下搅拌2-3h，取出，再次加热至300-350℃，20min后取出，冷却后待用；

经过高温处理后，蛭石膨胀，层与层之间的间距增大，方便盐酸溶液进入，经过盐酸处理后能有效的降低蛭石结构层的负电荷，由于在盐酸溶液中，蛭石重新吸水，所以需再次高温处理，让蛭石重新膨胀，层间距加大、分散性提高，利于进行离子交换；

B.将步骤(1)得到的蛭石与5wt％的氯化钠溶液混合，搅拌均匀后加热至70℃，搅拌反应4h后，离心分离，将沉淀物加热至250-300℃，40min后取出，冷却至90-110℃后加入0.5-1wt％的氯化铜溶液，调节pH＝7.5-8，于50-60℃搅拌反应4-5h后取出，于170℃的温度下煅烧20min，用去离子水清洗后晾干，得到铜离子型蛭石，冷后后待用；

在70℃的条件下，蛭石中的钙离子被氯化钠溶液中的钠离子置换，随后将蛭石再次加热，蛭石膨胀，在弱碱的环境中，氢更容易电离，使蛭石表面带负电，此时铜离子更容易将钠离子置换出来，随后进行煅烧，将未反应完的氯化铜脱水，便于去除。

C.将软钾镁矾溶于去离子水中，加热至60℃制备成软钾镁矾饱和溶液，随后加入铜离子型蛭石、乙二醇，混合均匀，加热至60-80℃，恒温、以300rpm速度搅拌2h后，静置冷却8-10h后，以5℃/min的速率升温至250℃，并通入空气，保温1h，随后取出，得到微晶颗粒；

饱和软钾镁矾在自然蒸发下可以重结晶，软钾镁矾晶体可以将步骤B得到的蛭石作为晶核成长为微晶颗粒，软钾镁矾晶体缓慢溶解的过程中，带有铜离子的蛭石也缓慢露出，提供钾肥、镁肥的同时，将外植体上已经滋生的细菌杀死，保证存活率。

D.将微晶颗粒保存于2-5wt％的氯化钠溶液中，得到微晶抗菌剂。

进一步，所述步骤B中，氯化钠溶液与氯化铜溶液的体积比为3:1。

进一步，所述步骤C中，每100ml软钾镁矾饱和溶液，添加8g铜离子型蛭石、0.05ml乙二醇。

本发明的有益效果如下：

1、本发明的灭菌方法能有效降低毛豹皮樟的污染率，提高启动率。

2、本发明的微晶抗菌剂可以在毛豹皮樟外植体培养过程中持续消毒杀菌，提高启动率，并且采用软钾镁矾还可以作为肥料为外植体生长提供养分。

3、本发明的组织培养方法简单方便，便于推广

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明进行详细说明：

实施例1：

(1)步骤1：活体消毒。查询天气预报，选取连续的晴朗天，剪掉枝条上非当年生的老叶片，仅留下嫩芽，在活体上喷施1‰的多菌灵，早晚各一次，连续3天。

(2)步骤2:表面异物清洗。采取喷施过多菌灵的嫩芽，先用清水冲洗干净嫩芽表面的灰尘，随后放进1‰的洗衣粉液，不断搅动，直至嫩芽表面附着的异物全部脱离，再用清水漂洗干净。

(3)步骤3:体外消毒。先剥离掉嫩芽表面一层的嫩叶，随后将嫩芽放到1％pvp无菌溶液中浸泡10min，再转入流动的水中，大水冲洗10min后转为小水冲洗20min，最后转入无菌水中充分漂洗3遍，滤干待用。大水和小水的流速为本领域技术人员常规采用的流速。

(4)步骤4：无菌操作。将滤干的嫩芽转入无菌操作台，用75wt％酒精消毒10s后漂洗干净、滤干水分后转入震荡液中，震荡液以浓度为1‰的pvp和浓度为1‰升汞溶液按体积比为1:100混合制备而成，震荡液中消毒5min，震荡液没过外植体即可，随后用无菌清水漂洗3次，滤干水分即可。

(5)步骤5：转接。将灭菌后的嫩芽接种到毛豹皮樟启动培养基中，每瓶接种1个，接种50瓶。

启动培养基的制备(本发明所有实施例中采用的启动培养基制备方法相同)：

制备启动培养基，每升启动培养基含有MS培养基、6mg/L核黄素、2mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30mg/L蔗糖、6.5mg/L琼脂，以水作为溶剂，余量为水。