一种细胞组分自动提取方法
阅读说明：本技术 一种细胞组分自动提取方法 (Automatic extraction method of cell components ) 是由 张兵兵 李樑 杨云澜 周雪毅 于 2019-11-07 设计创作，主要内容包括：本发明属于本发明涉及生物技术领域,公开了一种细胞组分自动提取方法,包括如下步骤：(1)将细胞样本和致敏剂混合后加入加样槽孵育；(2)在孵育5-10min后,移液器将样品加到滤管中；(3)喷气加压,细胞在剪切力和惯性冲击作用下破碎；(4)如需收集细胞总蛋白或某种亚细胞结构特殊分布的蛋白,可将步骤(3)所得产物先进行预处理再将系列细胞组分抽提液加入到过滤产物中进行抽提。该方法有别于传统方法中完全依靠裂解液的化学破碎,或者研磨匀浆法破碎,使细胞破碎更均一,效率高,蛋白破坏小。该方法即适用于样本数少的处理,也适用于样本总数量大的情况下的批处理,对单个样品量需求少,可有效节省人力,避免人力操作的差异性。(The invention belongs to the field of biotechnology, and discloses an automatic extraction method of cell components, which comprises the following steps: (1) mixing the cell sample and the sensitizer, and adding the mixture into a sample adding groove for incubation; (2) after incubation for 5-10min, a pipettor added the sample to the filter tube; (3) air injection pressurization, wherein cells are crushed under the action of shearing force and inertial impact; (4) if the total cellular protein or the protein with a special distribution of a certain subcellular structure needs to be collected, the product obtained in the step (3) can be pretreated firstly, and then a series of cell component extracts are added into the filtered product for extraction. The method is different from the traditional method which completely depends on the chemical crushing of the lysate or the grinding and homogenizing method for crushing, so that the cell crushing is more uniform, the efficiency is high, and the protein damage is small. The method is suitable for processing with small number of samples and batch processing under the condition of large total number of samples, has small requirement on single sample amount, can effectively save manpower and avoid the difference of manual operation.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种可自动分离动植物细胞中蛋白和亚细胞结构的装置和方法，适用于多样品批处理。
背景技术
在后基因组时代，开展功能组学的研究是生命科学研究的主要内容，蛋白质是生命活动的主要执行者，因此是研究的重点。通过分析不同生理/病理条件下，组织、细胞或亚细胞结构中蛋白质的异同，以揭示复杂的生命现象，为疾病诊治寻找靶点。由于一个细胞内蛋白质种类繁多（超过10万种），不同蛋白的动态分布范围极广（从102到109个分子），且性质各异，这些因素为蛋白质的分离分析带来困难。采取一些预分离手段使蛋白与非蛋白的生物大分子分离，减少样品复杂性，是对特异蛋白质进行分析研究的基本方法。随着生命科学研究的深入和精细化，已进入对亚细胞结构特异性分布的蛋白质进行研究的阶段，因此分离出亚细胞特异分布的蛋白是亚细胞蛋白质组学研究的前提。
传统分离细胞蛋白的方法是采用RIPA裂解液（主要成分为50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% Triton X-100，1%脱氧胆酸钠，0.1% SDS）裂解细胞，蛋白溶解到裂解液中，通过离心机高速离心，丢弃不溶部分，上清液即为分离得到的蛋白溶液，能够被该方法分离的蛋白必须能够被细胞裂解液溶解，事实上约有30%的蛋白是不溶于RIPA裂解液的，这部分蛋白存在于离心沉淀中被丢弃，由此造成目标蛋白丢失或者蛋白定量不准。经典的分离亚细胞结构的方法是对细胞裂解匀浆以后，以差速离心结合密度梯度离心进行分离，该方法需要配置复制的密度梯度介质，需要超高速离心机，因此对研究人员的实验技能和实验设备要求高，且操作繁琐，样本量需求大，耗时长，重复性差。近年相继出现一些基于抗体亲和法亚细胞分离方法，该方法利用免疫亲和的专一性，因此需要为每种结构制备专门的抗体，虽然专一性得到提高，但抗体价格高昂，实验成本过高。同时由于传统法中大量使用RIPA进行细胞裂解和蛋白溶解，所含的SDS等阴离子表面活性剂虽然能高效裂解，但是也会造成蛋白的丢失变性。传统物理破碎细胞的手段为超声或玻璃匀浆器匀浆，超声法不适用于样品量少的科学研究，且超声的热效应会导致蛋白变性；匀浆效果人为随机性大，容易出现匀浆效果不够或过分匀浆，破坏亚细胞结构，影响下游分离。同时手工操作匀浆，难以保证全程低温环境，造成蛋白变性或降解。同时释放的基因组核酸会使细胞匀浆液极为粘稠，影响进一步的分离实验。
在传统方法中，低温高速离心甚至是超高速离心是必要的分离方法，离心操作需要人工完成样品放置和回收，不适合与其它操作环节进行整合实现自动化，因此目前尚无细胞蛋白自动提取装置。在多样本分离提取的要求下，人工操作工作强度大，批件差异性风险提高，势必影响实验结果的科学性，因此有必要进行技术革新，开发自动提取装置。
发明内容
为克服离心操作的不足，本发明提供了一种细胞组分自动过滤提取方法，该方法有别于传统方法中完全依靠裂解液的化学破碎，或者研磨匀浆法破碎，使细胞破碎更均一。该方法即适用于样本数少的处理，更适用于样本总数量大的情况下的批处理，对单个样品量需求少，处理效率高，可有效节省人力，避免人力操作的差异性。
本发明目的是由以下技术方案实现的：
一种细胞组分自动提取方法，该方法所用仪器包括细胞组分自动提取装置，所用试剂包括致敏剂、系列细胞蛋白抽提液；
所述细胞组分自动提取装置包括：移液系统、过滤系统、冷却系统、自动控制系统，所述冷却系统为移液系统和/或过滤系统提供0-4℃低温，其中，自动控制系统分别与移液系统、过滤系统、冷却系统连接；所述过滤系统包括：滤管放置盒、通气供压系统、滤管，其中滤管包括滤柱、收集管，滤柱包括滤芯，滤芯在压缩气体加压过滤过程中使细胞膜致敏的细胞破碎并将核酸DNA滤除，所得滤液即为不含DNA的其他细胞组分；所述移液系统包括：移液器吸头放置盒、加样槽、移液器、吸头；所述移液器为排式移液器，与加样槽平行排列，所述加样槽为成排连通的尖底圆孔组，其数量和位置与移液器吸头放置盒插孔对应；所述通气供压系统包括围栏、压缩气瓶、通气管道、喷气嘴；压缩气瓶通过通气管道与喷气嘴相接，压缩气瓶与通气管道之间设有总阀门，通气管道与喷气嘴之间通过螺纹连接，通气管道与喷气嘴之间设有分阀门，喷气嘴与滤管接触处设有橡胶垫圈；
所述致敏剂包括聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇、缓冲盐溶液；
所述系列细胞组分抽提液包括：聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐；
该方法包括如下步骤：
（1）将吸头***移液器吸头放置盒插孔中，将预定数量的滤管***滤管放置盒，最后将一定量的细胞样本和致敏剂混合后加入加样槽孵育；
（2）启动自动提取程序，在孵育5-10min后，移液器移动到移液器吸头放置盒上方，下移插取吸头；移液器移动到加样槽上方，下移吸取样本混合液；移液器移动到滤管放置盒上方，下移将样品加到滤管中；移液器回移归位；
（3）通气供压系统下移，喷气嘴***滤管，滤管上沿与橡胶垫圈压紧密封，喷气嘴喷出加压气体，使致敏剂处理过的细胞悬液迅速通过滤芯，细胞在剪切力和惯性冲击作用下破碎，通气供压系统上移回原位；取出滤管，收集管内所得滤液即为不含DNA的其它细胞组分；
（4）如需收集细胞总蛋白或某种亚细胞结构特殊分布的蛋白，可将步骤（3）所得产物离心处理，获得亚细胞结构沉淀，然后加入相应的系列细胞组分抽提液，待不溶物全部溶解后所得产物即为某种亚细胞结构所含特定蛋白提取液。
进一步的，本发明目的还可以由以下技术方案实现：
所述滤芯为疏水聚烯烃高分子材料制成的微孔结构。
所述高分子材料包括聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯。
所述滤芯用高分子材料加工成粒径10-150μm的颗粒，通过加压烧结成微孔结构，孔径范围为20-60μm，厚度范围为1mm-10mm。
所述通气供压系统所用气体为氮气，所述冷却系统可以是接入冰水的水冷换热管，也可以是压缩机冷却系统。
所述细胞致敏剂包括质量百分比为0.10% ~ 2.00%的聚乙二醇辛基苯基醚、质量百分比为0.10% ~ 2.50%的乙基苯基聚乙二醇、缓冲盐溶液；其中缓冲盐溶液为：20-70mMTris-盐酸缓冲盐溶液、pH为6.5-8.0，或者0.1倍~3倍PBS磷酸缓冲盐溶液，pH为6.5-8.0。
所述系列细胞组分抽提液包括：质量百分比为0.30% ~ 2.20% 的聚乙二醇辛基苯基醚、质量百分比为0.10% ~ 4.00% 的聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯、质量百分比为0.20%~ 2.10% 的乙基苯基聚乙二醇、质量百分比为0.10% ~ 3.00% 的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，缓冲液体系包括100-250mM 氯化钠、20-70mM Tris-盐酸缓冲盐溶液，pH为6.5-8.0或0.1倍~ 3倍 PBS磷酸盐缓冲溶液，pH为6.5-8.0。
有益效果
本发明提供了一种用于从细胞中自动提取不含DNA的细胞蛋白及其它组分的装置，该装置通过化学致敏剂结合机械作用实现细胞破碎，该机械作用利用了在气体压力作用下，细胞悬液迅速通过多孔过滤材料时的剪切力和惯性冲击作用，有别于传统方法中完全依靠裂解液的化学破碎，或者研磨法破碎，使细胞破碎更均一，效率更高。该方法即适用于样本数少的处理，也适用于样本总数量大的情况下的批处理，对单个样品量需求少，可有效节省人力，避免人力操作的差异性。
多孔结构的过滤柱，一方面发挥了机械破碎细胞的作用，另一方面对细胞破碎释放出来的黏稠核酸具有过滤作用，有效去除了DNA分子，分离出蛋白质和亚细胞结构。该方法相较于传统的差速离心分离、密度梯度离心分离，分离速度更快，且不需要复杂密度梯度介质和高档的设备。
细胞预处理采用的致敏剂与传统裂解液不同，其组成改变了表面活性剂的种类，用温和的非离子型表面活性剂替代传统离子型表面活性剂（如SDS，脱氧胆酸盐），配合低渗盐溶液。该致敏剂不会直接裂解细胞膜，而是致敏细胞膜，使其对机械力更敏感，有利于样品通过过滤柱时机械力破碎细胞，可以减少对蛋白质的损伤。在膜蛋白分离中，能使细胞膜结构维持较大的碎片，有利于进一步分离；保持细胞器的相对完整，有利于降低后续亚细胞结构的分离难度，不需要超速离心即可分离。
优化的细胞蛋白抽提液，作用在于溶解滤液中的不溶蛋白或抽提亚细胞结构中包含的特殊蛋白。用多种温和的非离子型表面活性剂，替代传统单一离子型表面活性剂，使得溶解蛋白种类范围更广，抽提效果更温和。不同于传统的RIPA，由强阴离子表面活性剂SDS和脱氧胆酸钠组成，能溶解部分蛋白但易使蛋白高级结构受破坏。
附图说明
图1为本发明的自动蛋白提取装置结构示意图。
图2为图1中所述通气供压系统结构示意图。
图3为本发明的滤管结构示意图。
图4为图3中所述收集管结构示意图。
图5为图3中所述滤芯结构示意图。
图6为本发明实施例2所得电泳结果图。
图7为本发明实施例3所得电泳结果图。
图8为本发明实施例3所得蛋白免疫印迹杂交结果图。
图9为本发明实施例4所得电泳结果图。
图中标号：1为移液器吸头放置盒，2为移液器，6为通气供压系统，7为滤管放置盒，8为加样槽，9为滤管。
具体实施方式
为了能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，并结合其附图，对本发明进行详细阐述。应当注意，在附图中所图示的部件不一定按比例绘制。本发明省略了对公知组件和公知技术描述，以避免不必要地限制本发明。所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例是示例性的，旨用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。
下面结合附图对本申请的具体实施方式作进一步详细地说明。
实施例1
如图1~3所示，一种细胞组分自动提取方法，该方法所用仪器包括细胞组分自动提取装置，所用试剂包括致敏剂、系列细胞蛋白抽提液；
所述细胞组分自动提取装置包括：移液系统、过滤系统、冷却系统、自动控制系统，所述冷却系统为移液系统和/或过滤系统提供0-4℃低温，其中，自动控制系统分别与移液系统、过滤系统、冷却系统连接；所述过滤系统包括：包括滤管放置盒7、通气供压系统6、滤管9，其中滤管9包括滤柱9-3、收集管9-1，滤柱9-3包括滤芯9-2，滤芯9-2在压缩气体加压过滤过程中使细胞膜致敏的细胞破碎并将核酸DNA滤除，所得滤液即为不含DNA的其他细胞组分；所述过滤柱上径小于收集管内径，形成空隙使气体排出。多孔结构的过滤柱，一方面发挥了机械破碎细胞的作用，另一方面对细胞破碎释放出来的黏稠核酸分子具有过滤作用，有效去除了DNA分子，使蛋白质和亚细胞结构得到分离。该方法相较于传统的差速离心分离、密度梯度离心分离，分离速度更快，且不需要复杂密度梯度介质和高档的设备；所述移液系统包括：移液器吸头放置盒1、加样槽8、移液器2、吸头；所述移液器2为排式移液器，与加样槽平行排列，所述加样槽为成排连通的尖底圆孔组，其数量和位置与移液器吸头放置盒孔对应；所述移液器吸头放置盒，为一个适用于市面方形移液器吸头盒的插槽，可将开盖移液器吸头盒放入其中；加样槽，为成排连通的尖底圆孔组，其数量和位置与放置盒孔对应，可从任意孔加入细胞和试剂混合样品，并通过连通使每个孔的样品量相同。所述通气供压系统6包括围栏6-1、压缩气瓶6-4、通气管道6-5、喷气嘴6-7；压缩气瓶通过通气管道与喷气嘴相接，压缩气瓶与通气管道之间设有总阀门6-6，通气管道与喷气嘴之间通过螺纹连接，通气管道与喷气嘴之间设有分阀门6-3，喷气嘴6-7与滤管接触处设有橡胶垫圈6-2。***栏长宽略大于放置盒，带一定角度倒角，以保证长期使用中通气供压系统与放置盒对齐合上。内部有成排喷气口，喷气口上有橡胶垫圈，与滤管上沿对接后可实现密封。喷气口通过内螺纹与管道和压缩气瓶相连，每个气口所连管道由一个电控阀门控制，气瓶端连有总阀门，方便更换气瓶。所述滤管放置盒，有可放入滤管的排孔组成。
所述致敏剂包括聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇、缓冲盐溶液；
所述系列细胞组分抽提液包括：聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐；
该方法包括如下步骤：
（1）将吸头***移液器吸头放置盒插孔中，将预定数量的滤管***入滤管放置盒，最后将一定量的细胞样本和致敏剂混合后加入加样槽孵育；
（2）启动自动提取程序，在孵育5-10min后，移液器移动到移液器吸头放置盒上方，下移插取吸头；移液器移动到加样槽上方，下移吸取样本混合液；移液器移动到滤管放置盒上方，下移将样品加到滤管中；移液器回移归位；
（3）通气供压系统下移，喷气嘴***滤管，滤管上沿与橡胶垫圈压紧密封，喷气嘴喷出加压气体，使致敏剂处理过的细胞悬液迅速通过滤芯，细胞在剪切力和惯性冲击作用下破碎，通气供压系统上移回原位；取出滤管，收集管内所得滤液即为不含DNA的其它细胞组分；
（4）如需收集细胞总蛋白或某种亚细胞结构特殊分布的蛋白，可将步骤（3）所得产物离心处理，获得亚细胞结构沉淀，然后加入相应的系列细胞组分抽提液，待不溶物全部溶解后所得产物即为某种亚细胞结构所含特定蛋白提取液。
优先的本实施例所述滤芯为疏水聚烯烃高分子材料制成的微孔结构。
优先的本实施例所述高分子材料包括聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯。
优先的本实施例所述滤芯用高分子材料加工成粒径10-150μm的颗粒，通过加压烧结成微孔结构，孔径范围为20-60μm，厚度范围为1mm-10mm。
优先的本实施例所述通气供压系统所用气体为氮气，所述冷却系统可以是接入冰水的水冷换热管，也可以是压缩机冷却系统。
优先的本实施例所述细胞致敏剂包括质量百分比为0.10% ~ 2.00%的聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、质量百分比为0.10% ~ 2.50%的乙基苯基聚乙二醇（NP-40）、缓冲盐溶液；其中缓冲盐溶液为： 10-250mM 氯化钠、1-20mM 氯化镁、20-70mM Tris-盐酸缓冲盐溶液、pH为6.5-8.0，或者0.1倍~3倍PBS磷酸缓冲盐溶液，pH为6.5-8.0。本发明中，所述聚乙二醇辛基苯基醚是一种非离子型表面活性剂，配合包含氯化钠和氯化镁的低渗缓冲液，能温和高效的致敏细胞膜，只需要普通涡旋振荡器混合样品，无需专业破碎仪，或其他破碎仪器。低温下孵育5-10min，可使细胞对机械力敏感。
优先的本实施例所述系列细胞组分抽提液包括：质量百分比为0.30% ~ 2.20% 的聚乙二醇辛基苯基醚；质量百分比为0.10% ~ 4.00%的 聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯；质量百分比为0.20% ~ 2.10% 的乙基苯基聚乙二醇；质量百分比为0.10% ~ 3.00% 的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐。缓冲液体系包括100-250mM 氯化钠，20-70mM Tris-盐酸缓冲盐溶液，pH为6.5-8.0或0.1倍~ 3倍 PBS磷酸盐缓冲溶液，pH为6.5-8.0。能有效溶解各类双亲性或疏水性的难溶组分。
实施例2提取人肝癌细胞总蛋白
按每孔收集5×106个HepG2细胞，用预冷PBS洗涤后。每孔加入约200μL细胞致敏液，加入细胞样品中，混匀，加入加样槽。在滤管放置盒孔中放入对应的滤管。滤芯由平均粒径50μm的聚四氟乙烯颗粒烧结而成，空隙率45%，平均孔径30μm。选取喷气口，加样槽。
开启自动提取程序，经过5分钟0-4℃低温孵育，排式移液器移动到移液器吸头放置盒上方，下移插好移液器吸头后。移动到加样槽上，吸取200μL的细胞悬液，然后移动到过滤管放置盒上，加入到过滤管中，移液器回移归位。通气供压系统下移，喷气嘴与过滤柱对接密封，载荷气压使混合悬液通过滤柱。
取出收集管，收集管内滤液即为去除基因组DNA的肝癌细胞总蛋白提取液。提取液不粘稠，可直接进行后续分析。传统方法，如碧云天蛋白提取试剂盒（货号P0013B）和ThermoScientific 动物细胞蛋白提取试剂（货号78501），细胞裂解液含基因组DNA的蛋白提取液，需要高速离心去除基因组DNA。经电泳分析，如图6所示，1、泳道为碧云天试剂盒，2泳道为Thermo Scientific试剂盒，3为本方法提取的总蛋白。可知本装置与配套总蛋白提取试剂盒提取，比起实验室所用商用试剂盒，蛋白提取效率更高，提取蛋白谱更全。并且用时短，仅为10分钟，传统方法处理一个样品大约需要45分钟。
实施例3：提取人肝癌膜蛋白
按每孔收集5×106个HepG2细胞，用预冷PBS洗涤后。按每孔加入约200μL膜蛋白致敏液，加入细胞样品中，混匀，加入加样槽。在滤管放置盒孔中放入对应的滤管。选取喷气嘴，加样槽。
开启自动提取程序，经过10分钟0-4℃低温孵育，排式移液器移动到移液器吸头放置盒上方，下移插取吸头后。移动到加样槽上，吸取200μl的混合样品，然后移动到过滤管放置盒上，将样品加入到过滤管中，移液器回移归位。通气供压系统下移，喷气嘴与过滤柱合上，喷气嘴喷出加压气体，使致敏剂处理过的细胞悬液迅速通过滤芯，细胞在剪切力和惯性冲击作用下破碎。通气供压系统上移回原位。取出滤管，收集管内所得滤液即为不含DNA的细胞总组分提取液。
取出收集管，收集管放入普通离心机700g 离心1分钟。上清液转入新的收集管内，16000g离心30分钟。去除上清液在沉淀上加入100μl膜蛋白抽提液（质量百分比0.5%-1.5%乙基苯基聚乙二醇、质量百分比0.5%-1.5%聚乙二醇辛基苯基醚、质量百分比0.1%-0.5%3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、100-250mM 氯化钠、2-10mM EDTA，20-70mM Tris，盐酸调pH 6.5-8）。既得HepG2细胞膜天然蛋白溶液。可直接进行后续的实验分析。经电泳分析和Western Blot蛋白质免疫印迹分析（选取Anti-ATPA1为一抗，可评估提取的膜蛋白提取液中含有的膜蛋白标志蛋白——钠钾ATP酶是否存在和含量，侧面体现提取的效果）。图7为电泳结果：1、3泳道为采用传统方法的商用试剂盒，1为碧云天膜蛋白提取试剂盒（货号P0033），3为Thermo Scientific 动物细胞膜蛋白提取试剂（货号89842），2为本方法所提膜蛋白；图8为蛋白印迹杂交结果：1、3泳道为商用试剂盒，2为本方法所提膜蛋白。可知本装置与配套膜蛋白提取试剂盒，比起实验室所用商用试剂盒有提取效率高，提取蛋白谱全的优点，并且所用细胞量少，用时短，提取蛋白为天然蛋白。
实施例4：提取人肝癌细胞线粒体蛋白
按每孔收集1×107个HepG2细胞，用预冷PBS洗涤后。每孔加入约200μL细胞致敏液，加入细胞样品中，混匀，加入加样槽。在滤管放置盒孔中放入对应的滤管。滤芯由平均粒径50μm的聚四氟乙烯颗粒烧结而成，空隙率45%，平均孔径30μm。选取喷气口，加样槽。
开启自动提取程序，经过5分钟0-4℃低温孵育，排式移液器移动到移液器吸头放置盒上方，下移插好移液器吸头后。移动到加样槽上，吸取200μL的细胞悬液，然后移动到过滤管放置盒上，加入到过滤管中，移液器回移归位。通气供压系统下移，喷气嘴与过滤柱对接密封，载荷气压使混合悬液通过滤柱。
取出收集管，700g离心1分钟后，吸取上清液于新的收集管中，加入400μl线粒体分级缓冲液（为无表面活性剂组分的细胞致敏剂），16000g离心20分钟，去除上清液，再加200μl线粒体分级缓冲液8000g离心五分钟。
取上清液加入1.6ml预冷的PBS，16000g离心20分钟。弃去上清，在沉淀中加入100μl线粒体蛋白抽提液（质量百分比为：0.5%-1.5%乙基苯基聚乙二醇、质量百分比为：0.5%-1.5%聚乙二醇辛基苯基醚、质量百分比为：0.1%-0.5%3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、100-250mM 氯化钠、2-10mM EDTA 20-70mM Tris，盐酸调pH 6.5-8），即为线粒体天然蛋白提取液。与传统方法的商品化试剂盒相比较，图9为电泳分析结果，1为本实施例的方法， 2为碧云天线粒体蛋白提取试剂盒（货号C3601），3为Thermo Scientific 动物细胞线粒体蛋白提取试剂盒（货号89874），本实施例的方法提取的线粒体蛋白浓度高于传统的提取方法，并且节约了操作时间。
应该指出的是，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。