阅读说明：本技术 一种超滤渗滤过程中控制微粒产生的方法 (Method for controlling generation of particles in ultrafiltration and diafiltration process ) 是由 肖志华 罗映 于 2019-10-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及蛋白纯化技术,尤其涉及一种超滤渗滤过程中控制微粒产生的方法。所述方法包括：样品浓缩前往样品中加入吐温。通过加入表面活性剂吐温,有效的防止了超滤膜包堵塞,提高了产品的得率,整个过程无肉眼可见颗粒,透过通量未衰减,能够保证超滤渗滤过程顺利进行。(The invention relates to a protein purification technology, in particular to a method for controlling the generation of particles in an ultrafiltration and diafiltration process. The method comprises the following steps: the sample was concentrated before adding tween to the sample. By adding the surfactant Tween, the blockage of the ultrafiltration membrane package is effectively prevented, the yield of the product is improved, no visible particles exist in the whole process, the permeation flux is not attenuated, and the smooth proceeding of the ultrafiltration and diafiltration process can be ensured.)

一种超滤渗滤过程中控制微粒产生的方法

技术领域

本发明涉及蛋白纯化技术，尤其涉及一种超滤渗滤过程中控制微粒产生的方法。

背景技术

现阶段蛋白纯化下游工艺平台一般主要包括发酵液澄清收获、亲和层析捕获步骤、低pH病毒灭活、精细纯化、病毒灭活、过滤和超滤浓缩。超滤渗滤是使用切向流过滤膜包将目的蛋白进行浓缩换液。图1展示了UF/DF系统装置图。根据分子量的大小选择合适孔径的膜包，将目标蛋白截留，小分子盐透过膜包，然后将超滤缓冲液不断流加至Feed Tank(料液罐)中，搅拌混匀样品，从而实现换液。

蛋白复杂的分子结构使其易于形成从二聚体到微粒等大小不等的聚体。虽然微粒通常占比很少，且不影响药物活性，但有很多报道称蛋白聚体和微粒将引起免疫反应，因此，在纯化和制剂开发过程中，均需控制微粒的产生。微粒形成的路径有很多，最简单的路径为有倾向形成聚体的蛋白形成低聚体，然后低聚体再逐渐增长成为微粒；也有可能是因为蛋白本身构象不稳定或者外部压力的影响使其形成微粒；蛋白可以粘附在气液或固液表面，蛋白在这些表面的积累或这些表面发生构象变化时，便形成了微粒。通常，在纯化的其它步骤中，微粒可以通过过滤去除，但超滤系统是不断循环的，且整个过程通常需持续2-6小时，为保证回流与补液后Feed Tank是均匀的状态，整个过程需搅拌混匀，蛋白受到搅拌、剪切力等外在压力，在现有工艺下，搅拌30分钟后即形成很多肉眼可见微粒，堵塞膜包，使透过通量降低，使得整个流程时间延长，系统进口压力变大，难以进行，并且堵塞后的膜包难清洗，无法重复使用使成本升高。

发明内容

本发明所要解决的问题在于提供一种方法，控制在UF/DF过程中产生微粒，防止膜包堵塞，使整个超滤渗滤过程顺利进行。

具体的，本发明的技术方案如下：

一种超滤渗滤过程中控制微粒产生的方法，包括：样品浓缩前往样品中加入吐温。

优选的，所述吐温为吐温20或吐温80。

更优选的，因吐温20或吐温80不透过膜包，且易形成胶束，通过计算蛋白所需进行的浓缩倍数，使得最终样品中吐温20或吐温80的量不超过0.01％(w/v)。

具体的，通过比较筛选不同缓冲体系及不同添加剂的超滤效果，最终筛选出使用吐温作为添加剂。所述方法中需要用到吐温，须在处方开发时将吐温作为最终辅料，可根据最终辅料中吐温含量适当调整UF/DF前加入的量，在UF/DF结束后对吐温进行检测，再补加吐温至最终辅料浓度。

优选的，加入吐温后使用超滤膜包进行浓缩至目标浓度，得到样品A。

更优选的，所述超滤膜包为聚醚砜材质。

应当理解，本发明的超滤膜包并不限于聚醚砜材质，本领域技术人员可以选择任意合适的超滤膜包来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。

更优选的，所述超滤膜包为30KD的超滤膜包。

应当理解，本发明的超滤膜包并不限于30KD的超滤膜包，本领域技术人员可以选择任意合适的超滤膜包来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。

优选的，将样品A进行换液至目标缓冲液中得到样品B。

优选的，将样品B进行浓缩及回收得到产品，即完成超滤渗滤步骤。

优选的，所述样品为经过粗纯和精纯的蛋白样品。

本发明第二个方面公开了上述方法得到的产品。

本发明第三个方面公开了上述方法在蛋白纯化领域中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

本发明通过在超滤渗滤步骤之前往样品中添加吐温，控制超滤渗滤过程中微粒的产生，有效的防止了超滤膜包堵塞，提高了产品的得率，整个过程无肉眼可见颗粒，透过通量未衰减，能够保证超滤渗滤过程顺利进行。

附图说明

图1为UF/DF系统装置图(图中1-料液罐，2-样品泵，3-阀门，4-过滤模块，5-回流阀，P_R：回流压力，P_P：透过压力，P_F：进口压力，Q_R：回流流速，Q_P：透过流速，Q_F：进口流速)；

图2为本发明实施例中超滤过程中各缓冲体系透过通量的对比实验图；

图3为本发明实施例中不同缓冲液的搅拌对比图。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。本技术方案通过对比缓冲液的和添加剂的影响，查找出了产生微粒的原因，并发明了最优解决方式。下面所描述的实施例为本发明的一部分实施例而不是全部的实施例，基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施案例都属于本发明保护的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明下述实施例中，通过处方开发，确认了最终制剂处方为20mM磷酸盐，10mg/mL精氨酸，300mg/mL海藻糖，0.02％PS20(吐温20)，pH6.0。在UF/DF开发过程中，20mM磷酸盐，10mg/mL精氨酸，pH6.0作为最初的换液缓冲液。

实施例1

样品上一步纯化层析洗脱液为醋酸体系，本实施例目的为将蛋白从醋酸体系中换液至20mM磷酸盐，10mg/mL精氨酸，pH6.0。膜包载量为150g/m²，浓缩至目标浓度。开始换液，换液过程中监测透过通量，如图2所示，从醋酸体系置换至PB-Arg体系时，整个过程通量降低非常快，膜包堵塞严重，整个过程观察到较多肉眼可见微粒。考虑可能为缓冲液体系更换造成蛋白不稳定从而产生微粒。

实施例2

样品将上一步纯化层析缓冲液为柠檬酸体系，从柠檬酸体系换液至20mM磷酸盐，10mg/mL精氨酸，pH6.0，首先使用少量蛋白进行尝试，膜包载量为50g/m²，因蛋白体积小，整个过程未使用搅拌，如图2所示，透过通量未衰减，且无肉眼可见微粒，初步确认为缓冲液间的转换造成微粒。

实施例3

本实施例与实施例2的唯一区别在于：将膜包载量提高至600g/m²，且整个过程进行搅拌混匀样品。从图2可知，整个过程通量衰减较大，且观察到较多肉眼可见微粒。因此从柠檬酸体系换液至PB-Arg仍会产生微粒。

实施例4

样品将上一步纯化层析缓冲液为PB-Arg体系，从PB-Arg体系更换到PB-Arg体系，两种缓冲液pH和精氨酸浓度不一样，膜包载量为320g/m²，整个过程进行搅拌混匀样品，从图2可知，即使在同一体系中进行缓冲液置换，仍有微粒产生，整个过程通量降低。

由如上四个实施例可知，微粒的产生不是由于缓冲液转换造成的，而是由于搅拌。接下来我们进一步开展实施例证实了该点。

实施例5

各取50mL样品，进行搅拌，考察不同缓冲液及添加吐温20，搅拌30分钟后的表现。如图3所示，图3中编号1的缓冲体系为20mM PB，10mg/mL Arg-HCl，pH6.0；编号2的缓冲液体系为20mM Na-Citarte(柠檬酸钠)，160mMNaCl，pH5.0；编号3的缓冲液体系为20mM PB，10mg/mL Arg-HCl，60mg/mL trehalose(海藻糖)，pH6.0；编号4的缓冲液体系为20mM PB，10mg/mL Arg-HCl，pH6.0，0.02％PS20；从图3可以看出，添加了PS20后搅拌30分钟仍无沉淀产生。

实施例6

取部分蛋白，初始缓冲液为柠檬酸体系，初始浓度为12.6mg/mL，需浓缩至18mg/mL再进行换液，换液至20mM PB，10mg/mL Arg-HCl，pH6.0中，通过计算加入0.007％的PS20使其终浓度为0.01％，进行UF/DF过程，整个过程搅拌混匀，监测透过端通量，从图2可以看出，整个过程通量降低较少，整个过程也无明显肉眼可见微粒。

本实施例提供的方法能够控制UF/DF中微粒产生，防止膜包堵塞，使UF/DF正常进行。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。