阅读说明：本技术 一种重组人血小板生成因子原液的制备方法 (Preparation method of recombinant human thrombopoietic factor stock solution ) 是由 钟正明 秦小强 王一凡 于 2019-09-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种重组人血小板生成因子原液的制备方法,所述方法包括以下步骤：1)以批次流加培养模式培养rh-TPO工程细胞；2)将步骤1)培养获得的发酵液采用S/D法灭活；3)将步骤2)灭活后的发酵液依次经过阳离子层析、疏水层析、阴离子层析,得到重组人血小板生成因子原液。采用本发明的方法制备的重组人血小板生成因子原液纯度大于99.5％～100％,蛋白活性为3.0x10<Sup>5</Sup>IU/mg～3.6x10<Sup>5</Sup>IU/mg,收率接近30％。通过采用本发明的方法,能够高产量地获得目的蛋白。(The invention provides a preparation method of recombinant human thrombopoietin stock solution, which comprises the following steps: 1) culturing rh-TPO engineering cells in a batch fed-batch culture mode; 2) inactivating the fermentation liquor obtained by the culture in the step 1) by adopting an S/D method; 3) and (3) sequentially carrying out cation chromatography, hydrophobic chromatography and anion chromatography on the inactivated fermentation liquor obtained in the step 2) to obtain a recombinant human platelet-derived factor stock solution. The purity of the recombinant human thrombopoietin stock solution prepared by the method is more than 99.5-100%, and the protein activity is 3.0x10 5 IU/mg～3.6x10 5 IU/mg, yield close to 30%. By using the method of the present invention, a target protein can be obtained in high yield.)

一种重组人血小板生成因子原液的制备方法

技术领域

本发明属于生物制剂领域，涉及一种重组人血小板生成因子原液的制备方法

背景技术

上世纪50年代，Kelemen等发现并提出体内存在着一种能够刺激血液中血小板生成的体液因子，并命名为血小板生成因子(Thrombopoietin，TPO)，它对巨核细胞系统的发育和成熟有明显促进作用。重组人血小板生成因子(recombinant human thrombopoietin，rh-TPO)是含有332个氨基酸并且经CHO工程菌表达的重组糖蛋白，通过与其特异性受体Mpl结合而调节巨核细胞生长、分化、成熟并***形成有功能的血小板，用于治疗包括实体瘤及急性白血病放化疗后、骨髓移植、再障和其他骨髓功能不全及HIV等造成的血小板严重减少和特发性血小板减少性紫癜(ITP)。

专利ZL00109612.5公开了重组人血小板生成素特定的培养条件，纯化方法。该方法所使用的纯化方法复杂，细胞培养液需经过超滤，阴离子，凝胶过滤，阳离子，反向层析及凝胶过滤层析繁琐步骤，且最后的培养液40L仅获得260mg蛋白，收率低，不适合规模生产。

专利公开号为CN1276382的发明公开了一种大规模生产重组人血小板生成素的制剂方法。该方法包括用特殊培养基，在特定培养条件下培养携带有编码人血小板生成素蛋白基因序列的被转化的哺乳动物细胞，以获得该蛋白质产物的高表达收获液。但是其公开的制备生产方法中存在不被现在认可的动植物源性营养培养基α-MEM，且其中添加胎牛血清量为5-20％，采用较为复杂的灌流工艺，灌流速度为每日0.5-15升，包括将终发酵液依次经过超滤、阳离子交换层析、凝胶层析、阴离子交换层析、反相高效液相层析和凝胶过滤层析等。其生产工艺复杂繁琐，收率低，不利于产业化放大。

美国专利号NO.5，986，049(ZymoGenetics，Seattle，USA)和美国专利号NO.5，744，587(ZymoGenetics，Seattle，USA.)分别公开了以亲和层析法纯化血小板生成素的方法，前者使用亲和层析和离子交换层析对哺乳动物的血小板生成素进行了纯化，所得TPO纯度达到90％以上。后者以吸附法、亲和层析和疏水层析法制备由BHK细胞表达的人血小板生成素，由700升收获培养基中获得了250毫克蛋白。收率及蛋白纯度太低，不符合要求。

因此，当前对可以大规模制备重组人血小板生成因子的工业化的方法存在需求。

发明内容

基于现有技术的不足，本发明的目的是提供一种大规模制备重组人血小板生成因子的方法。本发明提供的方法步骤简单，产量高。不仅解决了当前重组人血小板生成因子生产工艺繁琐，无法规模化生产放大的问题，同时解决重组人血小板生长细胞因子类传统工艺上无法去除脂胞膜和非脂胞膜病毒，如猪源型病毒、牛源型病毒等的问题，具有重要的意义。

一方面，本发明提供了一种制备重组人血小板生成因子原液的方法，所述方法包括以下步骤：

1)使用生物反应器，以批次流加模式培养重组人血小板生成因子(rh-TPO)工程细胞；

2)将步骤1)培养获得的发酵液使用S/D法灭活；

3)将步骤2)灭活后的发酵液依次经过阳离子层析、疏水层析、阴离子层析，得到重组人血小板生成因子原液。

根据本发明所述的制备方法，其中，在步骤1)中，所述培养使用的基础培养基为EX-CELL Advanced^TM CHO Fed-batch培养基；流加培养基为HyClone^TM Cell Boost^TM 7a和HyClone^TM Cell Boost^TM 7b；

优选地，每隔1～3天补加所述流加培养基HyClone^TM Cell Boost^TM 7a和HyClone^TMCell Boost^TM 7b，其添加量分别为培养体积的4％～6％和0.4％～0.6％；更优选地，每隔2天补加所述流加培养基HyClone^TM Cell Boost^TM 7a和HyClone^TM Cell Boost^TM 7b，其添加量分别为培养体积的5％和0.5％；

本发明采用的细胞株为江苏康禾生物制药有限公司专利号201310491722.7中所构建好的细胞株。

根据本发明所述的制备方法，其中，所述步骤1)是通过包括以下步骤的方法实现的：

①复苏rh-TPO工程细胞并使用EX-CELL Advanced^TM CHO Fed-batch培养基培养至活细胞密度不低于3.0×10⁶个/mL，活力不低于90％；

②接种至生物反应器，继续培养至收获；

其中，接种的第3、5、7、9天分别补加培养体积的4％～6％和0.4～0.6％的HyClone^TM Cell Boost^TM 7a和HyClone^TM Cell Boost^TM 7b；

其中，所述生物反应器为100L生物反应器，并具有如下培养参数：

温度35.5±1.5℃；pH6.9±0.5；溶氧30％～70％；

优选地，所述100L生物反应器还具有如下培养参数：

转速50-80rpm；表层通气10％～30％；

深层通气0-0.1lpm；

深层氧气0-0.5lpm；

深层二氧化碳0-0.4lpm；

优选地，培养过程中，葡萄糖浓度为4～7g/L。

根据本发明所述的制备方法，其中，在步骤2)中，所述S/D法使用的试剂为聚乙二醇辛基苯基醚和磷酸三丁酯；

优选地，在步骤2)中，聚乙二醇辛基苯基醚的工作浓度为1％(V/V)；磷酸三丁酯的工作浓度为0.3％(V/V)。

根据本发明所述的制备方法，其中，所述步骤2)是通过包括以下步骤的方法实现的：

在发酵液中边搅拌边加入S/D试剂，用HCl溶液调节pH值至pH6.5，在25℃±2下灭活1h-2h。

根据本发明所述的制备方法，其中，所述步骤3)中，阳离子层析使用复合型弱阳离子介质MMC Diamond进行；

优选地，所述阳离子层析的条件为：

上样条件20mM磷酸盐缓冲液、0.1M氯化钠，pH 6.5±0.2，电导：11～15ms/cm；

清洗条件：1M氯化钠pH 6.5；

洗脱条件：50mM Tris pH 8.0 1M NH₄Cl 2M尿素。

根据本发明所述的制备方法，其中，所述步骤3)中，疏水层析使用Butyl HP填料进行；

优选地，所述疏水层析的条件为：

上样条件：20mM磷酸盐缓冲液、0.7～0.8M(NH₄)₂SO₄ pH 7.0电导：115ms/cm；

下样条件：3M(NH₄)₂SO₄，调节电导与上样电导相差±2ms/cm，上样量≤6.4mg/mL介质；

清洗条件：20mM磷酸盐缓冲液、0.7M(NH₄)₂SO₄ pH 7.0；

洗脱条件：10mM磷酸盐缓冲液一步洗脱。

根据本发明所述的制备方法，其中，所述步骤3)中，阴离子层析使用MixA Mustang离子交换填料进行；

优选地，所述阴离子层析的条件为：

上样条件：20mM Tris 0.1M NaCl pH 8.0；

下样条件：20mM Tris、1M NaCl、pH 8.0、调节电导为12±2ms/cm，上样量≤2.78mg/mL介质；

清洗条件：20mM磷酸盐缓冲液、0.1M NaCl、pH 7.0±0.1；

洗脱条件：20mM磷酸盐缓冲液、0.5M NaCl、pH 7.0一步洗脱。

根据本发明所述的制备方法，还包括将得到的原液进行纳米膜过滤、除菌过滤和/或分装的步骤。

本发明提供的方法针对当前rh-TPO细胞因子类的生产工艺，进行了高效率，高收率及高纯度的产业化放大，采用本发明的方法制备的重组人血小板生成因子原液纯度为99.5％～100％，蛋白活性为3.0x10⁵IU/mg～3.6x10⁵IU/mg，收率接近30％，培养100L，能够获得1800mg高产量的目的蛋白。与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.用于患者的安全性方面具有明显优势

同类产品中，目前生产采用的培养基为含植物蛋白源性及动物蛋白源性的培养基，而本发明采用目前最为先进的不含动物源性、不含水解蛋白，化学成分明确的进口培养基厂家，替代了老式传统病毒潜在危害的风险工艺。

2.产业化规模及产量方面具有明显优势

同类产品采用的是较为复杂，风险较高的10L灌流工艺，该工艺不稳定，易污染，纯化存放周期长，批间差异大等诸多缺点，培养100L需要35天，3克蛋白，20％收率，10000-15000支/批；而本发明的工艺生产稳定，可靠，污染小，周期短等诸多优势，培养100L只需10-11天，10克蛋白，30％的收率，每批次在28000支左右，在同等时间内产量为传统工艺的8倍之多，解决了难产业化问题，可实现稳定的产业化放大。

3.较同类产品在去除潜在病毒感染的风险方面具有明显优势

同类产品在传统工艺上无法去除脂胞膜和非脂胞膜病毒，如猪源型病毒、牛源型病毒等，极大的增加了患者的使用风险及用药安全，已不符合现在制药行业规范要求，本发明按照最为先进的基因工程制药技术，依据美国FDA、ICH相关要求增加脂包膜和非脂胞膜病毒灭活工艺，极大降低了因病毒灭活不彻底带来的巨大风险。

4.较同类产品在环境健康方面具有明显优势

同类产品采用的是较为繁琐复杂的五步层析工艺，其中，两步分别使用到了异丙醇及乙腈的反向层析法，且在终产品中具有残留的风险，此类物质对人体职业卫生健康具有潜在的危害，不适用于现代生物制品纯化分离。本发明则采用较为先进的，无身体伤害的，简单的三步层析将其蛋白纯度达到98％以上。

5.较同类产品在产品质量方面具有明显优势

较同类产品相比较，影响产品关键质量属性的指标如，内毒素、HCP、HDNA等较同类产品有明显的优势，同类产品外源杂质DNA为1.6pg/μg，本发明为0.1pg/μg，杂质HCP同类产品为0.5％，而本发明为0.1％，杂质内毒素同类产品为10EU/剂，而本发明为2EU/剂，相比下，在产品安全性方面具有极大的竞争优势。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为根据本发明的实施例1，以Sigma培养基为基础培养基，7a/7b培养基为添加培养基对rh-TPO工程细胞进行摇瓶培养时，三组实验活细胞的细胞密度随培养时间变化的曲线图；

图2为根据本发明的实施例1，以Sigma培养基为基础培养基，7a/7b培养基为添加培养基对rh-TPO工程细胞进行摇瓶培养时，三组实验活细胞的细胞活力随培养时间变化的曲线图；

图3为根据本发明的实施例1，以Sigma培养基为基础培养基，7a/7b培养基为添加培养基对rh-TPO工程细胞进行摇瓶培养时，三组实验活细胞的目标蛋白表达量的柱状图；

图4为根据本发明的实施例2，使用10L反应器实验培养时，三批次实验活细胞的细胞密度随培养时间变化的曲线图；

图5为根据本发明的实施例3，使用100L规模细胞培养时，三批次实验活细胞的细胞密度随培养时间变化的曲线图；

图6为根据本发明的实施例3，使用100L规模细胞培养时，三批次实验活细胞的细胞活力随培养时间变化的曲线图；

图7为根据本发明的实施例4，使用MMC Diamond层析后的HPLC图；

图8为根据本发明的实施例4，使用Butyl HP层析用不同盐浓度洗脱的HPLC图；

图9为根据本发明的实施例4，使用Mix AMustang层析，不同pH样品的HPLC图；

图10为根据本发明的实施例4，使用Mix A Mustang层析，不同pH样品的SDS PAGE图；

图11为根据本发明的实施例4，使用Mix AMustang层析，不同洗脱液洗脱样品的SDS PAGE图。

具体实施方式

本发明的具体实施例中采用的细胞株为江苏康禾生物制药有限公司专利号201310491722.7中所构建好的细胞株。

实施例1培养工程细胞-选择培养基

本实施例的目的是选择合适的培养基。

本申请的申请人发现，针对rh-TPO工程细胞，使用Merck(Sigma)作为基础培养基，其培养效果要优于Hyclone、Gibco以及BD国际知名品牌的化学成分固定，无动物源性血清的基础培养基，发明人通过细胞生长活率、密度、倍增时间等各方面进行比较，发现Merck(Sigma)培养基培养rh-TPO工程细胞的表达量高，成分明确，且供货周期短，批次间稳定。

进一步地，申请人在选择Merck(Sigma)作为基础培养基的基础上，确定流加培养基为HyClone^TM Cell Boost^TM 7a，HyClone^TM Cell Boost^TM 7b，与Sigma基础培养基EX-CELLAdvanced^TM CHO Fed-batch Medium共同使用，对细胞的生长具有高效表达的作用。

HyClone^TM Cell Boost^TM 7a，HyClone^TM Cell Boost^TM 7b与Merck(Sigma)，Hyclone、Gibco以及BD中各种培养基相比，能确保基础培养基搭配合理，延长细胞生长周期、更加提升细胞表达量，预期平均在90mg/mL以上，且批次间稳定。

如下表1所示，为最终选定的基础和流加培养基

表1基础培养基和流加培养基

1.1实验目的

验证Sigma培养基和7a/7b培养基是否适合rh-TPO工程细胞的生长和表达；同时验证7a/7b培养基的补加方式是否合理。

实验要求用Sigma培养基培养rh-TPO工程细胞时，从细胞复苏至细胞悬液体积达到1.2L、活细胞密度不低于3.64×10⁶个/mL、细胞活力不低于95％，培养时间不超过16天；进行摇瓶培养时，收获时目的蛋白表达量不低于80mg/L。

1.2实验设计

表2培养箱参数设置

CO<sub>2</sub>浓度	转速	温度
			5.0％	120rpm	37℃

1.3复苏生长传代实验

取一支工作代细胞，用Sigma培养基进行复苏，培养至4个300mL/L，活细胞密度不低于3.64×10⁶个/mL，细胞活力不低于95％，计为第一组。每天取样检测总/活细胞密度，计算活力，以时间为横坐标，每天的总细胞数为纵坐标作图，观察总细胞数变化；以时间为横坐标，每天的细胞活力为纵坐标作图，观察每日活力变化。

本实验做三个平行实验。

1.4摇瓶培养实验

在1.1.3实验的基础上，培养至4个300mL/L、活细胞密度不低于3.64×10⁶个/m、细胞活力不低于95％时，取部分细胞传代至40mL/125mL，即在125mL摇瓶中取40mL细胞培养，活细胞密度为1.0×10⁶个/mL，计为第1天开始摇瓶培养，培养至细胞活力低于70％结束培养。每天取样检测总/活细胞密度，计算活力，以时间为横坐标，每天的活细胞密度为纵坐标作图，观察活细胞密度变化；以时间为横坐标，每天的细胞活力为纵坐标作图，观察每日活力变化。第3、5、7、9天各补加7a/7b培养基1.6/0.16mL(7a/7b培养基的补加比例为培养体积的4％/0.4％)。第4、7、9、11天送检目的蛋白表达量，培养结束当天送检一次，对比各摇瓶目的蛋白表达量。

1.5实验结果及分析

1.5.1细胞密度分析

以Sigma培养基为基础培养基，7a/7b培养基为添加培养基对rh-TPO工程细胞进行摇瓶培养时，三组实验活细胞密度随培养时间变化的曲线图如图1所示。由图1可以看出，三组实验活细胞密度变化趋势一致，说明培养过程相对比较稳定，活细胞密度在最高时可维持在4.3*10⁶个/ml，随着培养时间的延后，活细胞数逐渐呈一致的降低趋势。

1.5.2细胞活力分析

以Sigma培养基为基础培养基，7a/7b培养基为添加培养基对rh-TPO工程细胞进行摇瓶培养时，三组实验细胞活力随培养时间变化的曲线图如图2所示。由图2可以看出，三组实验活力变化趋势一致，说明培养过程相对比较稳定，细胞活力维持在95％以上的时间均可达到7天。

1.5.3目的蛋白表达量对比

以Sigma培养基为基础培养基，7a/7b培养基为添加培养基对rh-TPO工程细胞进行摇瓶培养时，三组实验细胞目的蛋白表达量随培养时间变化的图如图3所示。由图3可知，三组实验在收获时，目的蛋白表达量均可以达到90mg/L以上，符合实验要求。

1.6结论

综上，用Sigma培养基对rh-TPO工程细胞进行复苏传代培养时，16天之内培养体积可达到1200mL，且活细胞密度不低于4.0*10⁶个/mL，细胞活力不低于95％，符合实验要求；以Sigma培养基为基础培养基，7a/7b培养基为添加培养基对rh-TPO工程细胞进行摇瓶培养，收获时目的蛋白表达量可达到90mg/L以上，符合实验要求。

因此，以Sigma培养基为基础培养基，7a/7b培养基为添加培养基可以用来对rh-TPO工程细胞进行传代培养和目的蛋白的表达；第3、5、7、9天分别补加培养体积的4％～6％/0.4％～0.6％、4％～6％/0.4％～0.6％、4％～6％/0.4％～0.6％、4％～6％/0.4％～0.6％的7a/7b培养基的添加方式满足rh-TPO工程细胞的培养和目的蛋白表达。

实施例2培养工程细胞-10L反应器实验

实施例2和实施例3的目的是使工程细胞的培养由原来的10L灌流培养模式优化为100L批次模式，并进而解决10L灌流培养模式中灌流复杂、易污染、收率低、操作性不大等问题。进一步地，解决了现有技术中使用国产培养基(含血清)批次间稳定性差，且培养过程中产生杂质较多，难纯化，纯度低等问题。

基于实施例1-3，通过改变工程细胞的培养模式和选择合适的培养基，目的蛋白表达量从30mg/mL提升至大于90mg/mL以上。

2.1实验目的

设计连续3批10L生物反应器的培养实验，进一步验证Sigma培养基和添加培养基的可行性，确认并优化培养工艺。

2.2实验设计

2.2.1第一批10L反应器实验

复苏工作代细胞一支，用Sigma培养基摇瓶培养扩增至2.4L，活细胞密度不低于3.0×10⁶个/mL，活力不低于90％，接种至10L反应器中进行分批补料(Feed-Batch)模式培养，培养初始体积为9L，培养12天或活力低于75％，培养期间每天取样检测细胞密度、活力、葡萄糖浓度，并及时补糖至4g/L。第4、6、8、10、12取样测目的蛋白表达量。

培养参数如表3所示，平行培养三批次细胞，记为F20160304、F20160405和F20160406：

表3 10L反应器实验的培养参数

控制项	参数要求	调节方式
			温度	37±0.2℃	加热夹套自动控制
pH	6.9±0.2	关联CO<sub>2</sub>和2mol/L碳酸钠溶液，自动调节
			溶氧	40％	关联O2和深层通气调节，要求波动范围10％
转速	100-220rpm	根据细胞密度，逐步调节
			表层通气	5％	通入洁净的压缩空气
深层通气	0.03lpm	通入洁净的压缩空气
			深层氧气	15-35ccm	根据生长情况，逐步调节
深层二氧化碳	25-30ccm	根据生长情况，逐步调节
			泡沫	不覆盖表面	添加10％的消泡剂进行消泡
葡萄糖浓度	≥4g/L	补加30％的葡萄糖溶液进行调节

表4流加培养基的补加

培养天数	7a的补加体积	7b的补加体积
			3	540mL	54mL
5	360mL	36mL
			7	360mL	36mL
9	360mL	36mL

2.2.2三批次活细胞的密度如图4所示，最高可达6.0×10⁶个/mL，目的蛋白表达量如表5所示

表5目的蛋白表达量

目的蛋白表达量明显高于使用10L灌流培养的30mg/L。

实施例3培养工程细胞-100L规模细胞培养三批次工艺验证

3.1验证目的

根据10L生物反应器细胞培养的培养基种类、补料方式、培养方式等各参数进行放大培养，连续进行三批次100L规模细胞培养，最终能达到收获时目的蛋白表达量不低于90mg/L，即可判定上游细胞培养工艺是否能够达到预期开发目的。

3.2验证设计

用100L生物反应器进行CHO-K1细胞培养进行三批次(记为F20161118、F20161119和20161220)放大验证时，以Sigma培养基作为基础培养基，第3、5、7、9天补加6％/0.6％、4％/0.4％、4％/0.4％、4％/0.4％的7a/7b。培养参数设置如下表6所示：

表6反应器实验的培养参数

3.3实验结果及分析

3.3.1细胞密度分析

活细胞密度如图5所示，从图5可以很明显的看出，三批活细胞密度最高时均在3×10⁶细胞/mL，低于10L细胞培养时的密度。

3.3.2细胞活力对比

细胞活力如图6所示，三批次细胞培养过程中的细胞活力均在80％以上，符合验证要求。

3.3.3目的蛋白表达量对比

表6目的蛋白表达量

可以看出，三组为平行试验，的目的蛋白表达量均在100μg/mL以上，达到了本专利原定的≥90μg/mL且远高于上述30mg/L的开发目的。

3.4实验总结

经过三批次100L的生产工艺验证，TPO上游培养工艺无论从参数控制、活细胞密度、细胞活力和目的蛋白均达到了预定目的。顺利的由原来的10L灌流培养模式，变更为100L批次培养模式，达到了本申请预期的开发目的。

实施例4S/D病毒灭活蛋白纯化

4.1 MMC层析

本实施例依据TPO的蛋白特性及细胞培养完毕后培养液成分分析，考虑到培养液体积大，高盐浓度的情况下，不适合再做稀释或者浓缩换液，加入大量的硫酸铵等常规的纯化手段，经过大量的层析填料的对比分析，最终选择MMC Diamond作为第一步阳离子层析的层析介质。

因为，TPO发酵液pH 7.0±0.5，电导在16±2ms，TPO的等电点为3.5±1.0，且TPO具有比较强的疏水性。基于发酵液电导比较高，如果用常规型离子交换介质，需要对样品进行稀释或者缓冲液置换，如对样品做稀释，在样品体积比较大的情况下进一步增大了样品体积；如置换缓冲液，增加了工艺步骤，所以常规的离子交换介质不适合在此条件下纯化；基于TPO具有比较强的疏水性，本发明采用复合型弱阳离子介质MMC Diamond和Mix ADiamond介质来纯化，复合型离子交换介质可以在一定的盐浓度下，结合目的蛋白，由于MixA系列介质会大量的吸附色素，对介质后期的再生不是很容易，所以本发明侧重用MMCDiamond作为第一步层析介质。MMC在前期工艺摸索中，发现其TPO在pH 7.0，0.1M NaCl，20mM PB结合条件下能够结合，此纯化条件下虽然TPO带负电，但是TPO具有比较强的疏水性，MMC可以很好捕获目的蛋白，不结合色素且可以流穿大部分的杂蛋白，纯化效果也很好，所以对MMC层析条件进一步进行以下优化。

4.1.1实验安排：

柱子：BXK 50/30h:17.5cm体积：350mL

缓冲液A：20mM PB pH 6.5 0.1M NaCl cond12.48

缓冲液B：20mM PB pH 6.5 1M NaCl cond87.91

缓冲液C:50mM Tris pH 8.0 1M NH4Cl 2M Urea

S/D试剂：11％Triton X 100，3.3％磷酸三丁酯

样品：发酵液，边搅拌边缓慢加入80mL的S/D试剂(pH7.18)，用HCl调节pH6.5，测定Cond：14.72ms/cm，室温(25℃±2)灭活1h后上样。

过程：1M NaOH 2M NaCl处理柱子1CV→B液平衡(促使目的蛋白和偶联集团结合紧密)→A液平衡→上样25mL/min 20CV每个CV收集样品0.2CV→A液清洗3CV→B液清洗3CV→C液洗脱，UV＞20mAu开始收集→A液清洗1CV→1M NaOH 2M NaCl再生1.5CV

结果如图7所示；

4.1.2分析与结论：

MMC Diamond条件：上样条件20mM PB 0.1M NaCl，pH 6.5±0.2，Cond：11～15ms/cm，清洗条件：1M NaCl pH 6.5，洗脱条件：50mM Tris pH 8.0 1M NH₄Cl 2M Urea。本发明第一步MMC层析具有很好的捕获目的蛋白的效果。

4.2 Butyl HP层析

MMC Diamond洗脱液盐浓度比较高，Cond达到97ms/cm，基于TPO的疏水性比较强，所以本发明第二步侧重选择疏水填料，前期Butyl HP和Phenl HP捕获TPO的情况下，发现Butyl HP的分辨率比较高，且对TPO除杂效果比较好，Butyl HP的疏水基团比Phenyl HP弱，目的蛋白容易洗脱下来，所以选择Butyl HP作为第二步介质作为中度纯化步骤，去除大部分的杂质，并对Butyl HP的纯化条件进行以下优化。

4.2.1 Butyl HP上样盐浓度确定

目的：对比0.6M、0.7M、0.8M(NH₄)₂SO₄(以下简称AS)，上样条件，确认Butyl HP的上样条件

4.2.1.1实验：

柱子：EzFast 1mL*2Butyl HP

缓冲液A1:20mM PB 0.8M AS pH 7.0Cond:115ms/cm

缓冲液B:10mM PB pH 7.0

缓冲液A2:12.5％B

缓冲液A3:25％B

样品：1)MMC下样10mL加入AS 0.2M，调节pH 7.0，Cond：116ms/cm

2)MMC下样10mL加入AS 0.1M，调节pH 7.0，Cond：105ms/cm

3)MMC下样10mL，调节pH 7.0，Cond：96ms/cm

4.2.1.2 HPLC检测结果：

TPO Butyl HP 0.6M/0.7M/0.8M AS洗脱结果如下表7所示：

表7盐浓度不同上样盐浓度的洗脱结果

样品信息	峰面积(mAu)	纯度(％)
			0.6M AS 3-19～21洗脱	1132	61.71
0.7M AS 2-20～22洗脱	1635	61.90
			0.8M AS 1-25～27洗脱	1557	59.32

4.2.1.3 HPLC分析：

显示0.7M AS洗脱的纯度和峰面积稍微比较高，0.7M AS在8CV时稍微有一些流穿，0.8M AS 8CV无流穿，结合能力最好，所以0.7M AS和0.8M AS都可以作为其上样条件，0.6MAS在可见明显流穿，故不宜使用0.6M AS作为洗脱液。

4.2.2 Butyl HP优化洗脱条件

4.2.2.1目的：

选用不同盐浓度洗脱优化洗脱条件，选用Cond：25ms/cm，20ms/cm，10ms/cm电导来优化。

4.2.2.2实验过程：

柱子：EzFast 1mL*2Butyl HP

缓冲液A1:20mM PB 0.8M AS pH 7.0Cond:115ms/cm

缓冲液B:10mM PB pH 7.0

缓冲液B1:85％B(25ms/cm)

缓冲液B2:90％B(20ms/cm)

缓冲液B3:95％B(10ms/cm)

样品：MMC下样30mL加入AS 0.1M，调节pH 7.0，Cond：105ms/cm

过程：缓冲液A平衡10CV→上样5CV 10mL 0.5mL/min→A液清洗8CV→B液洗脱15CV→100％B洗脱10CV

4.2.2.3 HPLC结果：

结果如图8所示和下表8所示：

表8不同洗脱液浓度的结果比较

样品信息	峰面积(mAu)	纯度(％)
			85％1-6、7、8管合并洗脱	736	63.69
90％1-5、6、7管合并洗脱	831	60.63
			95％1-6、7、8管合并洗脱	898	61.66
10mM PB(100％)对照	1635	61.90

4.2.2.4结果分析

85％、90％、95％的洗脱从HPLC、电泳纯度无明显区别，同时与100％无区别，所以我们考虑洗脱的回收率，10mM PB(100％)对照峰面积是最大的，我们用10mM PB一步洗脱。

4.2.1 Butyl HP最终的条件：

上样条件20mM PB 0.7～0.8M(NH₄)₂SO₄ pH 7.0，样品MMC下样用3M(NH₄)₂SO₄调节Cond与A液相差±2ms/cm即可，上样量≤6.4mg/mL介质，清洗用20mM PB 0.7M(NH₄)₂SO₄ pH7.0，洗脱采用10mM PB一步洗脱。

4.3 Mix A Mustang(上海博格隆生物技术有限公司生产)层析

基于TPO的等电点和疏水性，控制纯化条件pH大于其等电点，本发明着重筛选阴离子介质，且阴离子介质对去除内毒素的效果明显。本发明的发明人发现，常规的DEAE 6HP和Q Bestarose Fast Flow纯化效果不明显，不能去除大部分的杂质；本发明选择复合离子介质MMC和Mix A比较，比较结果为复合型的介质Mix A Diamond对TPO的纯化效果明显，能够去除大分子杂质和小分子的杂质。为了增加Mix A的分辨率，我们选择颗粒更小的基质Mustang，平均颗粒为34μm，所以本发明后期重点优化Mix A Mustang的纯化条件。

4.3.1上样pH值筛选

目的：筛选结合条件pH 6.0、7.0、8.0，Cond：0.1M NaCl

实验过程：

柱子：EzFast 1mL*2Mix A Mustang(同一根柱子)

缓冲液A1:20mM PB 0.1M NaCl pH 6.0Cond:12.70ms/cm

缓冲液A2:20mM PB 0.1M NaCl pH 7.0Cond:12.92ms/cm

缓冲液A3:20mM Tris 0.1M NaCl pH 8.0Cond:12.45ms/cm

缓冲液B1:20mM PB 1M NaCl pH 6.0Cond:88.24ms/cm

缓冲液B2:20mM PB 1M NaCl pH 7.0Cond:90.14ms/cm

缓冲液B3:20mM Tris 1M NaCl pH 8.0Cond:87.57ms/cm

样品：1)Butyl HP 10mL，用乙酸调节pH 6.0

2)Butyl HP 10mL，调节pH 7.0

3)Butyl HP 10mL，用Tris调节pH 8.0

过程：缓冲液A平衡10CV→上样5CV 10mL 0.5mL/min→A液清洗8CV→B液洗脱15CV→100％B洗脱10CV

检测结果的HPLC如图9所示，得到的蛋白的SDS PAGE电泳图如图10所示。

4.3.2分析与结果：

1)pH 6.0，SDS PAGE，HPLC显示洗脱中明显有杂质，pH不适合。

2)pH 7.0和8.0，SDS PAGE、非氨银染显示洗脱的纯度都是比较高，未见明显杂质条带，HPLC纯度合格。

3)pH 8.0与pH7.0比较，pH 8.0TPO更容易结合在Mix A Mustang上，且梯度洗脱与杂质的分辨率会更高些，所以选择pH 8.0为结合条件。

4.3.3 pH 8.0上样阶段洗脱

柱子：EzFast 1mL*2Mix A Mustang

缓冲液A:20mM Tris 0.1M NaCl pH 8.0Cond:12.45ms/cm

缓冲液B:20mM Tris 1M NaCl pH 8.0Cond:87.57ms/cm

样品：20160602制备Butyl HP下样，用1M Tris调节pH 8.0；

过程：A液平衡→上样0.5mL/min，10mL→A液清洗→13％B清洗→20％B洗脱→100％B洗脱→0.5M NaOH洗脱

4.3.4检测结果：

SDS PAGE如图11所示。

分析与结果：

1)实验清洗13％B未见目的蛋白，可以看到一些杂蛋白，清洗条件可行。

2)洗脱条件未控制好，可增加B液浓度用0.6M NaCl洗脱即50％B洗脱，这样既可以避免100％B洗脱下来的大分子杂质，也可以把目的蛋白洗完全

3)最终确认的洗脱条件为A液平衡→上样0.5mL/min，10mL→A液清洗→50％B洗脱→100％B洗脱→0.5M NaOH洗脱。

本发明经过一系列全新的纯化工艺摸索，最终确认的蛋白纯化条件为：

S/D灭活→MMC Diamond→Butyl HP→Mix A Mustang→纳滤→除菌过滤→原液制备完成。

实施例5质量标准及质检结果

本发明经过上游一系列市场知名度及认可度较高的无动植物源性的基础培养基，流加培养基的摸索研究，通过细胞培养摇瓶，10L反应器，100L反应器进行大量工艺参数摸索，如，流加比例、O₂、CO₂、空气、溶氧、搅拌、pH、葡萄糖浓度、等，最终确定了合适的细胞培养工艺，通过蛋白特性及结合目前行业法规，产业化放大需求，摸索了一套全新的包括病毒灭活及去除的高收率，高纯度，低杂质的蛋白纯化工艺。

以下表9为本发明100L培养所的蛋白的质检结果：

表9

对比例1

按照发明号为CN 103555760 A的10L灌流工艺重复试验，每天灌流10L。申请人发现，其平均表达量在20mg/L，收率为15～20％，培养100L发酵液获得纯度大于98％的蛋白为300-400mg。也就是说，在对比文件1的实验条件下，不能得到其声称的如下结果：

5天获得的50L培养液共分离得rh-TPO约为1020mg，蛋白纯度为98.5％，活性为3.6x10⁵U/mg。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。