嵌合抗原受体细胞疗法中细胞因子释放综合征的抑制
阅读说明：本技术 嵌合抗原受体细胞疗法中细胞因子释放综合征的抑制 (Inhibition of cytokine release syndrome in chimeric antigen receptor cell therapy ) 是由 M·库珀 J·F·迪珀西奥 A·卡特 于 2019-05-31 设计创作，主要内容包括：本文公开了对由携带嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞诸如CAR-T细胞分泌的细胞因子/趋化因子/转录因子进行基因编辑或内源性抑制以用于减轻细胞因子释放综合征和/或CAR-T相关神经病的方法。这些方法包括将所述CAR插入细胞因子基因的基因座中,从而阻断其表达。本文还公开了具有插入细胞因子的基因座中的CAR的携带(CAR)的免疫效应细胞,以及使用免疫疗法以降低的细胞因子释放综合征和/或CAR-T相关神经病发病率治疗疾病的方法。(Disclosed herein are methods of gene editing or endogenous inhibition of cytokines/chemokines/transcription factors secreted by Chimeric Antigen Receptor (CAR) -bearing immune effector cells, such as CAR-T cells, for use in alleviating cytokine release syndrome and/or CAR-T related neuropathies. These methods comprise inserting the CAR into the cytokine gene locus, thereby blocking its expression. Also disclosed herein are CAR-bearing immune effector cells having a CAR inserted into a cytokine locus, and methods of treating diseases with reduced cytokine release syndrome and/or CAR-T related neuropathy incidence using immunotherapy.)
具体实施方式
因此，本文作为实施方案1公开的是一种携带嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞，其缺乏涉及细胞因子释放综合征的细胞因子或趋化因子或转录因子。
以下公开内容将详细描述缺乏细胞因子的细胞的实施方案、替代方案和用途，以及此类细胞在例如免疫疗法和过继性细胞转移中治疗疾病的用途。因此，本文提供了以下另外的实施方案。
实施方案2-如实施方案1所述的细胞，其中所述细胞因子或趋化因子或转录因子缺乏是通过编码所述细胞因子或趋化因子或转录因子的基因的缺失或抑制来实现的。
实施方案3-如实施方案1或2中任一项所述的细胞，其中所述缺失或抑制是通过将所述CAR插入所述细胞因子或趋化因子或转录因子基因的基因座中来实现的。
实施方案4-如实施方案1至3中任一项所述的细胞，其中所述CAR是还包括选择性标志物的构建体的一部分。
实施方案5-如实施方案1至4中任一项所述的细胞，其中所述选择性标志物包括绿色荧光(GFP)基因、黄色荧光(YFP)基因、截短的CD34(tCD34)基因，或截短的EGFR(tEGFR)基因。
实施方案6-如实施方案1至5中任一项所述的细胞，其中所述细胞因子或趋化因子或转录因子缺乏是通过用转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)或成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)编辑使所述细胞因子或趋化因子基因缺失或受抑制来实现的。
实施方案7-如实施方案1至6中任一项所述的细胞，其中缺失或抑制是使用CRISPR实现的。
实施方案8-如实施方案1至7中任一项所述的细胞，其中缺失或抑制是使用Cas9-CRISPR实现的。
实施方案9-如实施方案1至8中任一项所述的细胞，其中所述Cas9作为mRNA或蛋白质递送到所述细胞中。
实施方案10-如实施方案1至9中任一项所述的细胞，其中所述Cas9作为mRNA递送到所述细胞中。
实施方案11-如实施方案1至10中任一项所述的细胞，其中所述Cas9作为蛋白质递送到所述细胞中。
实施方案12-如实施方案1至11中任一项所述的细胞，其中靶向待缺失或抑制的所述基因的指导RNA(gRNA)与所述Cas9同时递送。
实施方案13-如实施方案1至12中任一项所述的细胞，其中所述递送是通过电穿孔进行的。
实施方案14-如实施方案1至13中任一项所述的细胞，其中所述细胞因子或趋化因子或转录因子缺乏是通过转染一种或多种类型的小干扰RNA(siRNA)抑制所述细胞因子或趋化因子或转录因子基因转录物来实现的。
实施方案15-如实施方案1至14中任一项所述的细胞，其中所述细胞因子或趋化因子或转录因子缺乏是通过转导一种或多种类型的短发夹RNA(shRNA)抑制所述细胞因子或趋化因子或转录因子基因转录物来实现的。
实施方案16-一种表达至少一种嵌合抗原受体(CAR)的携带CAR的免疫效应细胞，其中：
所述至少一种CAR插入细胞因子或趋化因子或转录因子基因或转录因子基因的基因座中；
通过选自转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)编辑的方法使所述细胞因子或趋化因子或转录因子基因缺失或受抑制；
通过表达具有内质网(ER)结合系链的scFv，以结合ER中的所述细胞因子或趋化因子并阻止分泌来抑制所述细胞因子或趋化因子或转录因子；
通过小干扰RNA(siRNA)的转染抑制所述细胞因子或趋化因子或转录因子基因转录物；或
通过短发夹RNA(shRNA)的转导抑制所述细胞因子或趋化因子或转录因子基因转录物。
实施方案17-如实施方案1至16中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)、携带CAR的iNKT细胞(iNKT-CAR)以及携带CAR的自然杀伤(NK)细胞(NK-CAR)，或携带CAR的巨噬细胞。
实施方案18-如实施方案1至17中任一项所述的细胞，其中所述细胞是CAR-T。
实施方案19-如实施方案1至18中任一项所述的细胞，其中所述细胞是双或串联CAR-T。
实施方案20-如实施方案1至17中任一项所述的细胞，其中所述细胞是iNKT-CAR。
实施方案21-如实施方案1至20中任一项所述的细胞，其中所述细胞是双或串联iNKT-CAR。
实施方案22-如实施方案1至17中任一项所述的细胞，其中所述细胞是CAR-巨噬细胞。
实施方案23-如实施方案1至22中任一项所述的细胞，其中所述细胞是双或串联CAR-巨噬细胞。
实施方案24-如实施方案1至23中任一项所述的细胞，其中所述细胞因子或趋化因子或转录因子促进细胞因子释放综合征的发展。
实施方案25-如实施方案1至24中任一项所述的细胞，其中所述细胞因子或趋化因子或转录因子选自表10中所述的那些。
实施方案26-如实施方案1至25中任一项所述的细胞，其中所述细胞因子或趋化因子或转录因子由激活或定位髓样细胞的T细胞产生。
实施方案27-如实施方案1至26中任一项所述的细胞，其中所述细胞因子或趋化因子或转录因子是激活髓样细胞或CAR-T细胞的T细胞表面受体基因。
实施方案28-如实施方案1至27中任一项所述的细胞，其中缺失或抑制的所述基因是整合到CAR-T细胞信号传导中的T细胞表面受体。
实施方案29-如实施方案1至28中任一项所述的细胞，其中所述细胞因子或趋化因子或转录因子驱动T细胞/CAR-T细胞分化。
实施方案30-如实施方案1至29中任一项所述的细胞，其中所述细胞因子或趋化因子是驱动T细胞/CAR-T细胞分化的转录因子。
实施方案31-如实施方案1至30中任一项所述的细胞，其中所述细胞因子或趋化因子或转录因子选自MCP1(CCL2)、MCP-2、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、Il-4和IFNγ。
实施方案32-如实施方案1至31中任一项所述的细胞，其中所述细胞因子或趋化因子或转录因子是GM-CSF。
实施方案33-如实施方案1至32中任一项所述的细胞，其中所述细胞是缺乏GM-CSF的CAR-T细胞。
实施方案34-如实施方案1至33中任一项所述的细胞，其中所述细胞是缺乏GM-CSF的iNKT-CAR细胞。
实施方案35-如实施方案1至34中任一项所述的细胞，其中待使用的所述免疫效应细胞是从健康供体中收获的。
实施方案36-如实施方案1至35中任一项所述的细胞，其中所述供体是人。
实施方案37-如实施方案1至36中任一项所述的细胞，其中所述嵌合抗原受体特异性结合在恶性细胞上表达的至少一种抗原。
实施方案38-如实施方案1至37中任一项所述的细胞，其中在恶性细胞上表达的所述一种或多种抗原选自BCMA、CS1、CD38、CD138、CD19、CD33、CD123、CD371、CD117、CD135、Tim-3、CD5、CD7、CD2、CD4、CD3、CD79A、CD79B、APRIL、CD56和CD1a。
实施方案39-如实施方案1至38中任一项所述的细胞，其中所述嵌合抗原受体特异性结合在恶性T细胞上表达的至少一种抗原。
实施方案40-如实施方案1至39中任一项所述的细胞，其中所述抗原选自CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、TCRA和TCRβ。
实施方案41-如实施方案1至38中任一项所述的细胞，其中所述嵌合抗原受体特异性结合在恶性B细胞上表达的至少一种抗原。
实施方案42-如实施方案1至41中任一项所述的细胞，其中所述抗原选自CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD38和CD45。
实施方案43-如实施方案1至42中任一项所述的细胞，其中所述抗原选自CD19和CD20。
实施方案44-如实施方案1至38中任一项所述的细胞，其中所述嵌合抗原受体特异性结合在恶性间皮细胞上表达的至少一种抗原。
实施方案45-如实施方案1至44中任一项所述的细胞，其中所述抗原是间皮素。
实施方案46-如实施方案1至38中任一项所述的细胞，其中所述嵌合抗原受体特异性结合在恶性浆细胞上表达的至少一种抗原。
实施方案47-如实施方案1至46中任一项所述的细胞，其中所述抗原选自BCMA、CS1、CD38和CD19。
实施方案48-如实施方案1至47中任一项所述的细胞，其中所述嵌合抗原受体表达APRIL蛋白的细胞外部分，其为有效共靶向BCMA和TACI的BCMA和TACI的配体。
实施方案49-如实施方案1至48中任一项所述的细胞，其中所述CAR-T细胞还包含自杀基因。
实施方案50-如实施方案1至49中任一项所述的细胞，其中内源性T细胞受体介导的信号传导在所述细胞中可忽略不计。
实施方案51-如实施方案1至50中任一项所述的细胞，其中所述细胞不诱发同种异体反应性或移植物抗宿主疾病。
实施方案52-如实施方案1至51中任一项所述的细胞，其中所述细胞不引起自相残杀(fratricide)。
实施方案53-一种具有降低的细胞因子释放综合征和/或CAR-T相关神经病发病率的治疗患者癌症的方法，其包括施用如实施方案1至52中任一项所述的细胞。
实施方案54-如实施方案53所述的方法，其中所述癌症是血液系统恶性肿瘤。
实施方案55-如实施方案53至54中任一项所述的方法，其中所述血液系统恶性肿瘤是T细胞恶性肿瘤。
实施方案56-如实施方案53至55中任一项所述的方法，其中所述T细胞恶性肿瘤是T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)。
实施方案57-如实施方案53至56中任一项所述的方法，其中所述T细胞恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤。
实施方案58-如实施方案53至57中任一项所述的方法，其中所述血液系统恶性肿瘤是多发性骨髓瘤。
实施方案59-如实施方案53至58中任一项所述的方法，其中所述血液系统恶性肿瘤是AML。
实施方案60-如实施方案53至59中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体肿瘤。
实施方案61-如实施方案53至60中任一项所述的方法，其中所述癌症是宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤和肺癌。
实施方案62-一种在接受嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)、携带CAR的iNKT细胞(iNKT-CAR)、携带CAR的自然杀伤(NK)细胞(NK-CAR)或携带CAR的巨噬细胞(CAR-巨噬细胞)免疫疗法的患者中预防或减少细胞因子释放综合征或CAR-T相关神经病的方法，其包括作为免疫疗法施用如实施方案53至61中任一项所述的细胞。
实施方案63-如实施方案53至62中任一项所述的方法，其中所述患者正在治疗癌症。
实施方案64-如实施方案53至63中任一项所述的方法，其中所述癌症是血液系统恶性肿瘤。
实施方案65-如实施方案53至64中任一项所述的方法，其中所述血液系统恶性肿瘤是T细胞恶性肿瘤。
实施方案66-如实施方案53至65中任一项所述的方法，其中所述T细胞恶性肿瘤是T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)。
实施方案67-如实施方案53至66中任一项所述的方法，其中所述T细胞恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤。
实施方案68-如实施方案53至67中任一项所述的方法，其中所述血液系统恶性肿瘤是多发性骨髓瘤。
实施方案69-如实施方案53至68中任一项所述的方法，其中所述血液系统恶性肿瘤是AML。
实施方案70-如实施方案53至69中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体肿瘤。
实施方案71-如实施方案53至70中任一项所述的方法，其中所述癌症是宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤和肺癌。
实施方案72-一种阻断细胞因子基因或趋化因子基因或转录因子基因在嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)、携带CAR的iNKT细胞(iNKT-CAR)、携带CAR的自然杀伤(NK)细胞(NK-CAR)或携带CAR的巨噬细胞(CAR-巨噬细胞)中的表达的方法，其包括将CAR插入所述细胞因子基因或趋化因子基因或转录因子基因的基因座中。
实施方案73-如实施方案53至72中任一项所述的方法，其中阻断所述细胞因子基因或趋化因子基因或转录因子基因的表达不减少CAR-T细胞介导的杀伤。
实施方案74-一种制备不引起或不促进CRS或CAR-T相关神经病(CAN)的CAR-T(免疫效应)细胞的方法，其包括使细胞因子或趋化因子或转录因子基因缺失或受抑制。
实施方案75-如实施方案53至74中任一项所述的方法，其中使所述细胞因子或趋化因子或转录因子基因缺失或受抑制不减少CAR-T细胞介导的杀伤。
实施方案76-如实施方案53至75中任一项所述的方法，其中所述缺失或抑制是通过将所述CAR插入所述细胞因子或趋化因子或转录因子基因的基因座中来实现的。
实施方案77-如实施方案53至76中任一项所述的方法，其中所述CAR是还包括选择性标志物的构建体的一部分。
实施方案78-如实施方案53至77中任一项所述的方法，其中所述选择性标志物包括绿色荧光(GFP)基因、YFP基因、tCD34基因或tEGFR基因。
实施方案79-如实施方案53至78中任一项所述的方法，其中将具有选择性标志物的CAR插入所述细胞因子或趋化因子或转录因子基因中允许TCR阴性细胞的一步纯化。
实施方案80-如实施方案53至79中任一项所述的方法，其中将具有选择性标志物的CAR插入所述细胞因子或趋化因子或转录因子基因中允许CAR+细胞因子阴性细胞的一步纯化。
实施方案81-如实施方案53至80中任一项所述的方法，其中所述缺失或抑制是使用转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)或成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)编辑来实现的。
实施方案82-如实施方案53至81中任一项所述的方法，其中所述缺失或抑制是使用CRISPR实现的。
实施方案83-如实施方案53至82中任一项所述的方法，其中所述缺失或抑制是使用Cas9-CRISPR实现的。
实施方案84-如实施方案53至83中任一项所述的方法，其中所述Cas9作为mRNA或蛋白质递送到所述细胞中。
实施方案85-如实施方案53至84中任一项所述的方法，其中所述Cas9作为mRNA递送到所述细胞中。
实施方案86-如实施方案53至85中任一项所述的方法，其中所述Cas9作为蛋白质递送到所述细胞中。
实施方案87-如实施方案53至86中任一项所述的方法，其中靶向待缺失或抑制的所述基因的指导RNA(gRNA)与所述Cas9同时递送。
实施方案88-如实施方案53至87中任一项所述的方法，其中所述递送是通过电穿孔进行的。
实施方案89-如实施方案53至88中任一项所述的方法，其中所述缺失或抑制是通过转导一种或多种类型的短发夹RNA(shRNA)抑制所述细胞因子或趋化因子或转录因子基因转录物来实现的。
实施方案90-如实施方案531至89中任一项所述的方法，其中所述缺失或抑制是通过转导编码蛋白表达阻断剂(PEBL)的构建体来实现的。
实施方案91-如实施方案53至90中任一项所述的方法，其中所述构建体编码对所述细胞因子、趋化因子或TF基因具有特异性的抗体衍生的单链可变片段。
实施方案92-如实施方案53至91中任一项所述的方法，其中所述细胞因子、趋化因子或转录因子基因的缺失不减少CAR-T介导的杀伤。
实施方案93-如实施方案53至92中任一项所述的方法，其中待插入的所述CAR包含供体模板。
实施方案94-如实施方案53至93中任一项所述的方法，其中供体模板包括腺相关病毒(AAV)、单链DNA或双链DNA。
本文公开了一种缺乏细胞因子的携带嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞。
在某些实施方案中，细胞因子缺乏是通过细胞因子基因或趋化因子基因或转录因子基因的消融来实现的。
在某些实施方案中，消融是通过将CAR插入细胞因子/趋化因子/转录因子基因的基因座中来实现的。
在某些实施方案中，CAR是还包括选择性标志物的构建体的一部分。
在某些实施方案中，细胞因子缺乏是通过用转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)或成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)编辑使细胞因子/趋化因子/转录因子基因缺失或受抑制来实现的。
在某些实施方案中，细胞因子缺乏是通过转染小干扰RNA(siRNA)抑制细胞因子/趋化因子/转录因子基因转录物来实现的。
本文还公开了一种表达至少一种嵌合抗原受体(CAR)的携带CAR的免疫效应细胞，其中：
·至少一种CAR插入细胞因子/趋化因子/转录因子基因的基因座中；
·通过选自转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)编辑的方法使细胞因子/趋化因子/转录因子基因缺失或受抑制；
·通过表达具有内质网(ER)结合系链的scFv，以结合ER中的细胞因子并阻止分泌来抑制细胞因子；或
·通过小干扰RNA(siRNA)转染抑制细胞因子/趋化因子/转录因子基因转录物。
在某些实施方案中，细胞选自嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)、携带CAR的iNKT细胞(iNKT-CAR)和携带CAR的自然杀伤(NK)细胞(NK-CAR)。
在某些实施方案中，细胞是CAR-T。
在某些实施方案中，细胞是双或串联CAR-T。
在某些实施方案中，细胞是iNKT-CAR。
在某些实施方案中，细胞是双或串联iNKT-CAR。
在某些实施方案中，细胞因子促进细胞因子释放综合征的发展。
在某些实施方案中，细胞因子选自MCP1(CCL2)、MCP-2、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IL-4和IFNγ。
在某些实施方案中，细胞因子是GM-CSF。
在某些实施方案中，细胞是缺乏GM-CSF的CAR-T细胞。
在某些实施方案中，细胞是缺乏GM-CSF的iNKT-CAR细胞。
在某些实施方案中，嵌合抗原受体特异性结合在恶性T细胞上表达的至少一种抗原。
在某些实施方案中，抗原选自CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、TCRA和TCRβ。
在某些实施方案中，嵌合抗原受体特异性结合在恶性B细胞上表达的至少一种抗原。
在某些实施方案中，抗原选自CD19和CD20。
在某些实施方案中，嵌合抗原受体特异性结合在恶性间皮细胞上表达的至少一种抗原。
在某些实施方案中，抗原是间皮素。
在某些实施方案中，嵌合抗原受体特异性结合在恶性浆细胞上表达的至少一种抗原。
在某些实施方案中，抗原选自BCMA、CS1、CD38和CD19。
在某些实施方案中，嵌合抗原受体表达APRIL蛋白的细胞外部分，其为有效共靶向BCMA和TACI的BCMA和TACI的配体。
在某些实施方案中，CAR-T细胞还包含自杀基因。
在某些实施方案中，内源性T细胞受体介导的信号传导在细胞中可忽略不计。
在某些实施方案中，细胞不诱发同种异体反应性或移植物抗宿主疾病。
在某些实施方案中，细胞不引起自相残杀。
本文还公开了一种具有降低的细胞因子释放综合征和/或CAR-T相关神经病发病率的治疗患者癌症的方法，其包括施用如本文所公开的携带嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞。
在某些实施方案中，癌症是血液系统恶性肿瘤。
在某些实施方案中，血液系统恶性肿瘤是T细胞恶性肿瘤。
在某些实施方案中，T细胞恶性肿瘤是T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)。
在某些实施方案中，T细胞恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤。
在某些实施方案中，血液系统恶性肿瘤是多发性骨髓瘤。
在某些实施方案中，癌症是实体肿瘤。
在某些实施方案中，癌症是宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤和肺癌。
本文还公开了一种在接受嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)、携带CAR的iNKT细胞(iNKT-CAR)或携带CAR的自然杀伤(NK)细胞(NK-CAR)免疫疗法的患者中预防或减少细胞因子释放综合征、CAR-T相关神经病的方法，其包括作为免疫疗法施用如本文公开的携带嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞。
本文还公开了一种阻断细胞因子/趋化因子/转录因子基因在嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)、携带CAR的iNKT细胞(iNKT-CAR)或携带CAR的自然杀伤(NK)细胞(NK-CAR)中的表达的方法，其包括将CAR插入细胞因子/趋化因子/转录因子基因的基因座中。
携带CAR的免疫效应细胞
嵌合抗原受体(CAR)是一种重组融合蛋白，其包含：1)细胞外配体结合结构域，即抗原识别结构域，2)跨膜结构域，以及3)信号转导结构域。
用于CAR设计、递送和表达以及制造临床级CAR-T细胞群的方法是本领域已知的。参见，例如Lee等,Clin.Cancer Res.,2012,18(10):2780-90。编码CAR的工程改造的嵌合抗原受体多核苷酸包含：信号肽、抗原识别结构域、至少一个共刺激结构域以及信号传导结构域。
嵌合抗原受体的抗原特异性细胞外结构域识别并特异性结合抗原，通常是恶性肿瘤的表面表达抗原。当例如“抗原特异性细胞外结构域”(或等效地，“抗原结合结构域”)以约0.1pM至约10μM，优选地约0.1pM至约1μM，更优选地约0.1pM至约100nM之间的亲和常数或相互作用亲和力(KD)结合抗原时，其特异性地结合抗原。用于确定相互作用亲和力的方法是本领域已知的。适用于本公开的CAR的抗原特异性细胞外结构域可以是任何抗原结合多肽，广泛多种所述多肽在本领域中是已知的。在一些情况下，抗原结合结构域是单链Fv(scFv)。其他基于抗体的识别结构域(cAb VHH(骆驼抗体可变结构域)及其人源化型式、IgNAR VH(鲨鱼抗体可变结构域)及其人源化型式、sdAb VH(单结构域抗体可变结构域)和“骆驼源化”抗体可变结构域是适用的。在一些情况下，基于T细胞受体(TCR)的识别结构域诸如单链TCR(scTv，包含VαVβ的单链双结构域TCR)也是适用的。
本公开的嵌合抗原受体还包含“细胞内结构域”，其在抗原与抗原特异性细胞外结构域结合时向携带CAR的免疫效应细胞提供细胞内信号。本公开的嵌合抗原受体的细胞内信号传导结构域负责激活在其中表达嵌合受体的T细胞的至少一种效应子功能。术语“效应子功能”是指分化细胞诸如iNKT细胞的特化功能。iNKT细胞的效应子功能，例如，可以是NK反式激活、T细胞激活和分化、B细胞激活、树突状细胞激活和交叉呈递活性，以及巨噬细胞激活。因此，术语“细胞内结构域”是指CAR的在抗原与细胞外结构域结合时转导效应子功能信号并指导iNKT细胞执行特化功能的部分。合适的细胞内结构域的非限制性实例包括T细胞受体的ζ链或任何其同源物(例如，η、δ、γ或ε)、MB 1链、829、Fe Rill、Fe R1，以及信号传导分子的组合诸如CD3ζ和CD28、CD27、4-1BB、DAP-1 0、OX40及其组合，以及其他类似的分子和片段。可使用活化蛋白家族的其他成员的细胞内信号传导部分，诸如FcγRIII和FcεRI。虽然通常将采用整个细胞内结构域，但是在许多情况下，将不需要使用整个细胞内多肽。在细胞内信号传导结构域的截短部分可用的程度上，可使用所述截短部分代替完整链，只要其仍转导效应子功能信号即可。因此，术语细胞内结构域旨在包括细胞内结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。
通常，抗原特异性细胞外结构域通过“跨膜结构域”与嵌合抗原受体的细胞内结构域连接。跨膜结构域横穿细胞膜，将CAR锚定至T细胞表面，并将细胞外结构域与细胞内信号传导结构域连接，从而影响CAR在T细胞表面的表达。嵌合抗原受体还可进一步包含一个或多个共刺激结构域和/或一个或多个间隔子。“共刺激结构域”衍生自共刺激蛋白的细胞内信号传导结构域，其在体内增强细胞因子产生、增殖、细胞毒性和/或持久性。“肽铰链”将抗原特异性细胞外结构域与跨膜结构域连接。跨膜结构域与共刺激结构域融合，任选地，共刺激结构域与第二共刺激结构域融合，并且共刺激结构域与不限于CD3ζ的信号传导结构域融合。例如，在抗原特异性细胞外结构域与跨膜结构域之间以及在串联CAR的情况下在多个scFv之间包含间隔子结构域可影响抗原结合结构域的柔性，并从而影响CAR功能。合适的跨膜结构域、共刺激结构域和间隔子是本领域已知的。
可使用逆转录病毒将工程改造的CAR引入携带CAR的免疫效应细胞中，所述逆转录病毒将编码嵌合抗原受体的核酸序列有效且稳定地整合到靶细胞基因组中。本领域已知的其他方法包括但不限于慢病毒转导、基于转座子的系统、直接RNA转染和CRISPR/Cas系统(例如，I型、II型或III型系统，其使用合适的Cas蛋白，诸如Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、CaslOd、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966等)。也可使用锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。参见，例如，Shearer RF和Saunders DN,“Experimental design for stable geneticmanipulation in mammalian cell lines:lentivirus and alternatives,”Genes Cells2015年1月；20(1):1-10。
PI3K信号传导的操纵可以用于防止由组成型CAR自身信号传导引起的CAR-T细胞分化的改变，并促进长寿记忆T细胞的发育。在CAR-T制造和离体扩增期间PI3K的药理阻滞可以消除优先效应T细胞的发育，并使CAR-T效应/记忆比恢复至在空载体转导的T细胞中观察到的比率，这可以改善体内T细胞持久性和治疗活性。p110δPI3K的抑制可以增强肿瘤特异性治疗性CD8 T细胞的功效和记忆，而p110αPI3K的抑制则可以增加细胞因子的产生和抗肿瘤反应。
提出这一点是因为即使在不存在配体的情况下，T细胞表面上CAR的存在也可以改变其激活和分化。与scFv框架和信号传导结构域相关的通过CAR的组成型自身信号传导可以导致异常T细胞行为，包括分化改变和存活率降低。这很重要，因为CAR-T细胞在患者中的有效性与其体内寿命直接相关。CD28共刺激结构域的存在增加由持久性CAR自身信号传导引起的CAR-T细胞耗竭；4-1BB共刺激结构域的影响较小。此外，CD3-ζ显著增强PI3K、AKT、mTOR和糖酵解途径的组成型激活，并且相对于中央/干记忆细胞促进短时效应细胞的形成。参见，例如，Zhang W.等,“Modulation of PI3K signaling to improve CAR T cellfunction,”Oncotarget,2018年11月9日；9(88):35807–35808。
CAR抗原。待在本文公开的iNKT细胞中进行基因组编辑并由本文公开的iNKT-CAR的CAR识别的合适抗原包括对血液系统恶性肿瘤具有特异性的抗原。这些可以包括T细胞特异性抗原和/或对T细胞没有特异性的抗原。该抗原可被iNKT-CAR细胞的嵌合抗原受体特异性结合，并且iNKT-CAR细胞所缺乏的抗原是在恶性T细胞上表达的抗原，优选地，与非恶性T细胞相比，在恶性T细胞(即，来源于T细胞恶性肿瘤的T细胞)上过表达的抗原。此类抗原的实例包括CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、TRAC和TCRβ。
T细胞恶性肿瘤包括衍生自T细胞前体、成熟T细胞或自然杀伤细胞的恶性肿瘤。T细胞恶性肿瘤的实例包括T细胞急性成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(T-ALL)、T细胞大颗粒淋巴细胞(LGL)白血病、人T细胞白血病病毒1型阳性(HTLV-1+)成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)以及各种外周T细胞淋巴瘤(PTCL)，包括但不限于血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、ALK阳性间变性大细胞淋巴瘤和ALK阴性间变性大细胞淋巴瘤。
合适的CAR抗原还可以包括存在于多发性骨髓瘤细胞，即恶性浆细胞表面的抗原，诸如BCMA、CS1、CD38和CD19。可替代地，CAR可被设计成表达APRIL蛋白的细胞外部分，即BCMA和TACI的配体，其有效共靶向BCMA和TACI以治疗多发性骨髓瘤。
以下表1-10中给出适于在本文公开的iNKT细胞中进行基因组编辑并由本文公开的iNKT-CAR的CAR识别的抗原的另外实例。这些包括CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、TRAC、TCRβ、BCMA、CS1和CD38。
自相残杀抗性。本公开涵盖的CAR-T、iNKT、NK和其他携带CAR的免疫效应细胞任选地缺乏嵌合抗原受体所特异性结合的一种或多种抗原并且因此是具有自相残杀抗性的。在一些实施方案中，细胞的一种或多种抗原经过修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合一种或多种经修饰抗原。例如，嵌合抗原受体识别的一种或多种抗原的表位可通过一种或多种氨基酸变化(例如，取代或缺失)进行修饰，或表位可从抗原中缺失。在其他实施方案中，一种或多种抗原的表达在细胞中降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多。用于降低蛋白质表达的方法是本领域已知的，并且包括但不限于修饰或替换与编码该蛋白质的核酸序列可操作地连接的启动子。在其他实施方案中，对细胞进行修饰，使得不表达一种或多种抗原，例如通过使编码一种或多种抗原的基因缺失或受破坏。在以上实施方案中的每一个中，携带CAR的免疫效应细胞可缺乏嵌合抗原受体所特异性地结合的一种或优选所有抗原。用于对细胞进行基因修饰以使其缺乏一种或多种抗原的方法是本领域众所周知的，并且上文提供了非限制性实例。在一个示例性实施方案中，CRISPR/cas9基因编辑可以用于对细胞进行修饰以使其缺乏一种或多种抗原。也可使用锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。参见，例如，Shearer RF和Saunders DN,“Experimental design for stable genetic manipulation in mammalian cell lines:lentivirus and alternatives,”Genes Cells 2015年1月；20(1):1-10。
同种异体性(Allogenicity)的避免。本公开涵盖的CAR-T、iNKT、NK和其他携带CAR的免疫效应细胞可由于缺失T细胞受体(TCR)-CD3复合物的一部分而进一步缺乏内源性T细胞受体(TCR)信号传导。在各种实施方案中，可期望消除或抑制本文公开的携带CAR的免疫效应细胞中的内源性TCR信号传导。例如，当使用同种异体T细胞产生CAR-T细胞时，减少或消除CAR-T细胞中的内源性TCR信号传导可预防或减少移植物抗宿主疾病(GvHD)。用于消除或抑制内源性TCR信号传导的方法是本领域已知的，并且包括但不限于缺失TCR-CD3受体复合物的一部分，例如，TCR受体α链(TRAC)、TCR受体β链(TRBC)、CD3εCD3γCD3δ和/或CD3ζ。缺失TCR受体复合物的一部分可阻断TCR介导的信号传导，并且因此可允许安全地使用同种异体T细胞作为CAR-T细胞的来源，而不引起威及生命的GvHD。
自杀基因。可替代地，或另外，本公开涵盖的携带CAR的免疫效应细胞还可包含一种或多种自杀基因。如本文所用，“自杀基因”是指通过本领域已知的标准方法引入细胞的核酸序列，其在被激活时导致细胞的死亡。如果需要，自杀基因可有助于在体内有效追踪和消除携带CAR的免疫效应细胞。通过激活自杀基因促进杀伤可通过本领域已知的方法进行。本领域已知的合适的自杀基因治疗系统包括但不限于各种单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)/更昔洛韦(GCV)自杀基因治疗系统或诱导型半胱天冬酶9蛋白。在一个示例性实施方案中，自杀基因是CD34/胸苷激酶嵌合自杀基因。
下文在表1和2中提供了如本文所述的CAR中可包括的组分。
表1.不同CAR组分的氨基酸序列。
表2.scFv的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的氨基酸序列。
单CAR-T细胞
在某些实施方案中，本公开提供一种包含单个CAR的工程改造的T细胞，其特异性地结合抗原或细胞表面蛋白，其中T细胞任选地缺乏所述抗原或细胞表面蛋白(例如，CD7CARTΔCD7细胞)。在非限制性实例中，抗原或细胞表面蛋白的缺乏是由以下造成的：(a)T细胞表达的抗原或细胞表面蛋白的修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性地结合经修饰的抗原或细胞表面蛋白(例如，可通过一种或多种氨基酸变化(例如，取代或缺失)修饰嵌合抗原受体所识别的一种或多种抗原的表位，或该表位可从抗原中缺失)，(b)T细胞的修饰，使得抗原或细胞表面蛋白的表达在T细胞中降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)T细胞的修饰，使得不表达抗原或细胞表面蛋白(例如，通过使编码抗原或细胞表面蛋白的基因缺失或受破坏)。在以上实施方案中的每一个中，CAR-T细胞可缺乏嵌合抗原受体所特异性地结合的一种或优选所有抗原或细胞表面蛋白。对T细胞进行基因修饰以使其缺乏一种或多种抗原或细胞表面蛋白的方法是本领域众所周知的，并且本文提供了非限制性实例。在下述实施方案中，使用CRISPR-Cas9系统修饰T细胞，以使其缺乏一种或多种抗原。这些中的任一个都可通过本文公开的方法实现。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。
例如，可通过将商业合成的抗CD7单链可变片段(scFv)克隆到具有CD28和/或4-1BB内部信号传导结构域的第三代CAR骨架中来生成CD7特异性CAR-T细胞的CAR。可在P2A肽后添加细胞外hCD34结构域，以使得能够在病毒转导后检测CAR并使用抗hCD34磁珠进行纯化。可按照类似的方法使CAR对其他恶性T细胞抗原具有特异性。
本公开涵盖的CAR-T细胞可由于缺失T细胞受体(TCR)-CD3复合物的一部分而进一步缺乏内源性T细胞受体(TCR)信号传导。在各种实施方案中，可期望消除或抑制本文公开的CAR-T细胞中的内源性TCR信号传导。例如，当使用同种异体T细胞产生CAR-T细胞时，减少或消除CAR-T细胞中的内源性TCR信号传导可预防或减少移植物抗宿主疾病(GvHD)。用于消除或抑制内源性TCR信号传导的方法是本领域已知的，并且包括但不限于缺失TCR-CD3受体复合物的一部分，例如，TCR受体α链(TRAC)、TCR受体β链(TCR)或其亚型、TCR、TCR、CD3、CD3和/或CD3。缺失TCR受体复合物的一部分可阻断TCR介导的信号传导，并且因此可允许安全地使用同种异体T细胞作为CAR-T细胞的来源，而不引起威及生命的GvHD。
另外，本公开涵盖的CAR-T细胞还可包含一种或多种如本文所述的自杀基因。
以类似的方式，可构建其他单CAR-T细胞并在下表3中给出。
表3：单CAR和CAR-T
公开了可以在衍生自细胞毒性T细胞、记忆T细胞或gamma delta(γδ)T细胞的基因组编辑的CAR-T细胞的表面上表达的CAR氨基酸序列的实施方案。
表4.单嵌合抗原受体(CAR)的氨基酸序列。
串联CAR-T细胞
串联CAR-T细胞(tCAR-T)是具有单个嵌合抗原多肽的T细胞，所述多肽包含能够与两种不同的细胞表面分子(例如，抗原/蛋白质)相互作用的两个不同的细胞外配体结合(抗原/蛋白质识别)结构域，其中细胞外配体结合结构域通过一个或多个柔性接头连接在一起并共享一个或多个共刺激结构域，其中第一或第二细胞外配体结合结构域的结合将通过一个或多个共刺激结构域和信号转导结构域进行信号传导。
在某些实施方案中，T细胞缺乏一种或多种抗原或细胞表面蛋白(例如，对于CD7*CD2-tCAR CD7 CD2细胞为CD7和CD2，或对于CD3*CD2-tCAR CD3 CD2细胞为CD2)。在非限制性实例中，抗原或细胞表面蛋白的缺乏是由以下造成的：(a)T细胞表达的抗原或细胞表面蛋白的修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性地结合经修饰的抗原或细胞表面蛋白(例如，可通过一种或多种氨基酸变化(例如，取代或缺失)修饰嵌合抗原受体所识别的一种或多种抗原的表位，或该表位可从抗原中缺失)，(b)T细胞的修饰，使得抗原或细胞表面蛋白的表达在T细胞中降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)T细胞的修饰，使得不表达抗原或细胞表面蛋白(例如，通过使编码抗原或细胞表面蛋白的基因缺失或受破坏)。在以上实施方案中的每一个中，CAR-T细胞可缺乏嵌合抗原受体所特异性地结合的一种或优选所有抗原或细胞表面蛋白。对T细胞进行基因修饰以使其缺乏一种或多种抗原或细胞表面蛋白的方法是本领域众所周知的，并且本文提供了非限制性实例。在下述实施方案中，使用CRISPR-Cas9系统修饰T细胞，以使其缺乏一种或多种抗原或细胞表面蛋白。这些中的任一个都可通过本文公开的方法实现。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。
用于基因组编辑的串联CAR-T细胞，即CD2*CD3-tCARTΔCD2ΔCD3ε的tCAR可通过将通过肽接头分开的商业合成的抗CD2单链可变片段(scFv)和抗CD3单链可变片段(scFv)克隆到包含具有CD28和/或4-1BB内部信号传导结构域的例如第2代或第3代CAR骨架的慢病毒载体中来生成。可在P2A肽后添加细胞外hCD34结构域，以使得能够在病毒转导后检测CAR并使用抗hCD34磁珠进行纯化。可按照类似的方法使tCAR对其他恶性T细胞抗原具有特异性。
串联CAR可具有不同的接头结构，即，是线性或发夹状，并且发夹接头可任选地包含(Cys＝Cys)双链键(DSB)。
线性串联CAR-T细胞包含嵌合抗原受体(CAR)多肽，所述多肽包含第一信号肽、第一细胞外配体结合结构域、第二细胞外配体结合结构域、铰链区、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域，以及信号转导结构域，其中第一细胞外配体结合抗原识别结构域和第二细胞外配体结合抗原识别结构域对不同的细胞表面分子，即癌细胞(例如，恶性T细胞、B细胞或浆细胞)上的抗原具有亲和力；并且其中线性串联CAR-T细胞具有一种或多种基因修饰、缺失或破坏，从而导致线性串联CAR-T细胞中细胞表面分子的表达降低。
在另一个实施方案中，信号肽是来自人CD8的信号肽。
在第三实施方案中，第一细胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包含轻(VL)和重(VH)可变片段，命名为VH1和VL1并通过接头(例如，GGGGS)连接。在一些实施方案中，此接头肽重复2、3、4、5或6次。在一些实施方案中，第一抗原识别结构域可以选自：1)VH1-(GGGGS)3-4-VL1或2)VL1-(GGGGS)3-4-VH1。
在一些实施方案中，第二细胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包含轻(VL)和重(VH)可变片段，命名为VH2和VL2并通过接头(例如，GGGGS)连接。在一些实施方案中，此接头肽重复2、3、4、5或6次。在一些实施方案中，第一抗原识别结构域可以选自：1)VH2-(GGGGS)3-4–VL2或2)VL2-(GGGGS)3-4-VH2。
在另外的实施方案中，第一抗原识别结构域和第二抗原识别结构域通过5个氨基酸的短接头肽(GGGGS)连接。在一些实施方案中，此接头肽重复2、3、4、5或6次。
串联CAR构建体
在一个实施方案中，第一细胞外配体结合结构域抗原识别包含单链抗体片段(scFv)，其包含重(VH)和轻(VL)可变片段，命名为VH1和VL1并通过接头(例如，GGGGS)连接，靶向细胞表面分子，即在恶性细胞上表达的抗原。
在某些实施方案中，靶向在恶性T细胞上表达的抗原的重(VH)和轻(VL)可变片段，命名为VH1和VL1，选自BCMA、CS1、CD38、CD138、CD19、CD33、CD123、CD371、CD117、CD135、Tim-3、CD5、CD7、CD2、CD4、CD3、CD79A、CD79B、APRIL、CD56和CD1a。
在某些实施方案中，第二细胞外配体结合结构域抗原识别包含单链抗体片段(scFv)，其包含重(VH)和轻(VL)可变片段，命名为VH2和VL2并通过接头(例如，GGGGS)连接，并且靶向细胞表面分子，即在恶性细胞上表达的抗原。
在某些实施方案中，靶向在恶性T细胞上表达的抗原的重(VH)和轻(VL)可变片段，命名为VH2和VL2，选自BCMA、CS1、CD38、CD138、CD19、CD33、CD123、CD371、CD117、CD135、Tim-3、CD5、CD7、CD2、CD4、CD3、CD79A、CD79B、APRIL、CD56和CD1a，并且不同于CAR分子的第一细胞外配体结合结构域的可变重(VH1)和轻序列(VL1)。
下文在表5中给出串联CAR的另外实例。
表5：串联CAR和CAR-T
在一些实施方案中，本文可提供发夹串联CAR构建体，诸如包括但不限于掺入CD2和CD3 scFv的VH和VL结构域的构建体(表6)。
表6.靶向CD2和CD3的发夹串联CAR构建体。
双CAR-T细胞
在某些实施方案中，本公开提供了一种工程改造的T细胞，其具有对在同一效应细胞内表达的不同抗原或细胞表面蛋白具有亲和力的两种不同的嵌合抗原受体多肽，其中各CAR独立发挥作用。CAR可由特异性结合不同的抗原或细胞表面蛋白的单个或多个多核苷酸序列表达，其中T细胞缺乏CAR所结合的抗原或细胞表面蛋白(例如，CD7*CD2-dCARΔCD7ΔCD2细胞)。在非限制性实例中，抗原或细胞表面蛋白的缺乏是由以下造成的：(a)T细胞表达的抗原或细胞表面蛋白的修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性地结合经修饰的抗原或细胞表面蛋白(例如，可通过一种或多种氨基酸变化(例如，取代或缺失)修饰嵌合抗原受体所识别的一种或多种抗原的表位，或该表位可从抗原中缺失)，(b)T细胞的修饰，使得抗原或细胞表面蛋白的表达在T细胞中降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)T细胞的修饰，使得不表达抗原或细胞表面蛋白(例如，通过使编码抗原或细胞表面蛋白的基因缺失或受破坏)。在以上实施方案中的每一个中，CAR-T细胞可缺乏嵌合抗原受体所特异性地结合的一种或优选所有抗原或细胞表面蛋白。对T细胞进行基因修饰以使其缺乏一种或多种抗原或细胞表面蛋白的方法是本领域众所周知的，并且本文提供了非限制性实例。在下述实施方案中，使用CRISPR-Cas9系统修饰T细胞，以使其缺乏一种或多种抗原或细胞表面蛋白。这些中的任一个都可通过本文公开的方法实现。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。
用于基因组编辑的双CAR-T细胞，即CD2*CD3ε-dCARTΔCD2ΔCD3ε的dCAR可通过以下方式生成：将商业合成的抗CD2单链可变片段克隆到包含具有CD28和/或4-1BB内部信号传导结构域的例如第2代或第3代CAR骨架的慢病毒载体中并且将商业合成的抗CD3ε单链可变克隆到包含具有CD28和/或4-1BB内部信号传导结构域的另外的第2代或第3代CAR骨架的相同慢病毒载体中，从而产生质粒，其中由相同载体表达两个CAR构建体。可在P2A肽后添加细胞外hCD34结构域，以使得能够在病毒转导后检测CAR并使用抗hCD34磁珠进行纯化。可按照类似的方法使tCAR对其他恶性T细胞抗原具有特异性。
以类似的方式，可构建其他双CAR并在下表5-7中给出。
在一个实施方案中，双CAR-T细胞包含(i)第一嵌合抗原受体(CAR)多肽，其包含第一信号肽、第一抗原识别结构域、第一铰链区、第一跨膜结构域、第一共刺激性结构域，以及第一信号传导结构域；以及(ii)第二嵌合抗原受体多肽，其包含第二信号肽、第二抗原识别结构域、第二铰链区、第二跨膜结构域、第二共刺激结构域以及第二信号传导结构域；其中第一抗原识别结构域和第二抗原识别结构域对不同的靶抗原具有亲和力；并且其中双CAR-T细胞具有一种或多种基因破坏，导致靶抗原在双CAR-T细胞中的表达降低。
在第二实施方案中，第一信号肽是CD8a信号序列。
在第三实施方案中，第一抗原识别结构域是免疫球蛋白重链和轻链的可变区(命名为VH1和VL1)的融合蛋白，对于第一抗原识别结构域，通过5个氨基酸的短接头肽(GGGGS)连接。在一些实施方案中，此接头肽重复3或4次。在一些实施方案中，第一抗原识别结构域可以选自VH1-(GGGGS)3-4-VL1或VL1-(GGGGS)3-4-VH1。
在一些实施方案中，第一铰链区包含CD8a。
在一些实施方案中，第一跨膜结构域是CD8或CD28。
在一些实施方案中，第一共刺激结构域以任一顺序包含4-1BB、CD28，或两者的组合，即4-1BB-CD28或CD28-4-1BB。
在一些实施方案中，第一信号传导结构域是CD3ζ或CD3ζ二肽，即CD3ζ-CD3ζ。
在一些实施方案中，第二信号肽是SEQ NO:1的CD8a信号序列。
在一些实施方案中，第二抗原识别结构域是免疫球蛋白重链和轻链的可变区(命名为VH2和VL2)的融合蛋白，对于第二抗原识别结构域，通过5个氨基酸的短接头肽(GGGGS)连接。在一些实施方案中，此接头肽重复3或4次。在一些实施方案中，第二抗原识别结构域可以选自VH2-(GGGGS)3-4-VL2或VL2-(GGGGS)3-4-VH2。
在一些实施方案中，第二铰链区包含CD8a。
在一些实施方案中，第二跨膜结构域是CD8或CD28。
在一些实施方案中，第二共刺激结构域以任一顺序包含4-1BB、CD28，或两者的组合，即4-1BB-CD28或CD28-4-1BB。
在一些实施方案中，第二信号传导结构域是CD3ζ或CD3ζ二肽，即CD3ζ-CD3ζ。
在一些实施方案中，CAR多肽包含第一抗原识别结构域融合蛋白VVH1-(GGGGS)3-4-VL1和第二抗原识别结构域融合蛋白VH2-(GGGGS)3-4-VL2。
在一些实施方案中，CAR多肽包含第一抗原识别结构域融合蛋白VL1-(GGGGS)3-4–VH1和第二抗原识别结构域融合蛋白VL2-(GGGGS)3-4–VH2。
在一些实施方案中，CAR多肽包含第一抗原识别结构域融合蛋白VVH2-(GGGGS)3-4-VL2和第二抗原识别结构域融合蛋白VH1-(GGGGS)3-4-VL1。
在一些实施方案中，CAR多肽包含第一抗原识别结构域融合蛋白VL2-(GGGGS)3-4–VH2和第二抗原识别结构域融合蛋白VL1-(GGGGS)3-4–VH1。
在一些实施方案中，CAR多肽包含第一抗原识别结构域融合蛋白VH1-(GGGGS)3-4-VL1和第二抗原识别结构域融合蛋白VL2-(GGGGS)3-4–VH2。
在一些实施方案中，CAR多肽包含第一抗原识别结构域融合蛋白VL1-(GGGGS)3-4–VH1和第二抗原识别结构域融合蛋白VH2-(GGGGS)3-4-VL2。
在一些实施方案中，CAR多肽包含第一抗原识别结构域融合蛋白VH2-(GGGGS)3-4-VL2和第二抗原识别结构域融合蛋白VL1-(GGGGS)3-4–VH1。
在一些实施方案中，CAR多肽包含第一抗原识别结构域融合蛋白VL2-(GGGGS)3-4–VH2和第二抗原识别结构域融合蛋白VH1-(GGGGS)3-4-VL1。
在一些实施方案中，CAR多肽包含至少一个高效切割位点，其中高效切割位点选自P2A、T2A、E2A和F2A。
在一些实施方案中，CAR多肽包含自杀基因。
在一些实施方案中，CAR多肽包含突变的细胞因子受体。
在一些实施方案中，双CAR-T细胞靶向选自CD5、CD7、CD2、CD4、CD3、CD33、CD123(IL3RA)、CD371(CLL-1；CLEC12A)、CD117(c-kit)、CD135(FLT3)、BCMA、CS1、CD38、CD79A、CD79B、CD138和CD19、APRIL以及TACI的两种抗原。
下文在表7中给出双CAR的另外实例。
表7：双CAR和dCAR-T
细胞因子/趋化因子/转录因子基因的缺失或抑制
细胞因子释放综合征(CRS)是由免疫细胞响应于免疫疗法(或其他免疫刺激)而大量、快速地释放细胞因子引起的。因此，降低所释放的细胞因子的水平将预防或减少CRS的发展和/或维持。如本文所公开，这可以通过一种或多种细胞因子/趋化因子/转录因子基因的修饰、破坏或缺失来实现。实现此目的的一种方法是基因消融(基因沉默)，其中通过基因序列信息的改变或缺失来消除基因表达。这可以使用本领域已知的基因工程工具来实现，所述工具诸如转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、CRISPR，以及小干扰RNA(siRNA)的转染。
另一技术是表达具有内质网(ER)结合系链的scFv，以结合ER中的细胞因子并阻止分泌。被称为蛋白表达阻断剂(PEBL)的特定构建体防止靶蛋白转运至细胞膜。PEBL构建体可以容易地与其他基因修饰系统组合，以用于免疫细胞的离体细胞加工。短发夹RNA或小发夹RNA(shRNA/发夹载体)是具有紧密发夹弯的人工RNA分子，其可以用于通过RNA干扰(RNAi)使靶基因(即抗原)的表达沉默。shRNA在细胞中的表达通常通过质粒的递送或通过病毒或细菌载体实现。
可以例如通过将CAR靶向转导到细胞因子的基因序列中而从如本文公开的免疫效应细胞中缺失的细胞因子或趋化因子包括但不限于以下：XCL1、XCL2、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CX3CL1、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-18、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-15、IL-3、IL-5、GM-CSF、IL-6、IL-11、G-CSF、IL-12、LIF、OSM、IL-10、IL-20、IL-14、IL-16、IL-17、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、CD154、LT-β、TNF-α、TNF-β、4-1BBL、APRIL、CD70、CD153、CD178、GITRL、LIGHT、OX40L、TALL-1、TRAIL、TWEAK、TRANCE、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、Epo、Tpo、Flt-3L、SCF、M-CSF、MSP、A2M、ACKR1、ACKR2、ACKR3、ACVR1、ACVR2B、ACVRL1、ADIPOQ、AGER、AGRN、AIMP1、AREG、BMP1、BMP10、BMP15、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、BMP8B、BMPR2、C10orf99、C1QTNF4、C5、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR5、CCR6、CCR7、CD109、CD36、CD4、CD40LG、CD74、CER1、CHRD、CKLF、CLCF1、CMTM1、CMTM2、CMTM3、CMTM4、CMTM5、CMTM6、CMTM7、CMTM8、CNTF、CNTFR、COPS5、CRLF1、CSF1、CSF1R、CSF2、CSF3、CSF3R、CTF1、CX3CR1、CXCL16、CXCL17、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、EBI3、EDN1、ELANE、ENG、FAM3B、FAM3C、FAM3D、FAS、FASLG、FGF2、FLT3LG、FZD4、GBP1、GDF1、GDF10、GDF11、GDF15、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF9、GPI、GREM1、GREM2、GRN、HAX1、HFE2、HMGB1、HYAL2、IFNA10、IFNA14、IFNA16、IFNA2、IFNA5、IFNA6、IFNA8、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNGR1、IFNK、IFNL1、IFNL3、IFNW1、IL10RA、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL17A、IL17B、IL17C、IL17D、IL17F、IL18BP、IL-19、IL1F10、IL1R1、IL1R2、IL1RAPL1、IL1RL1、IL1RN、IL20RA、IL20RB、IL21、IL22、IL22RA1、IL22RA2、IL23A、IL23R、IL24、IL25、IL26、IL27、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL31、IL31RA、IL32、IL33、IL34、IL36A、IL36B、IL36G、IL36RN、IL37、IL6R、IL6ST、INHA、INHBA、INHBB、INHBC、INHBE、ITGA4、ITGAV、ITGB1、ITGB3、KIT、KITLG、KLHL20、LEFTY1、LEFTY2、LIFR、LTA、LTB、LTBP1、LTBP3、LTBP4、MIF、MINOS1-、MSTN、NAMPT、NBL1、NDP、NLRP7、NODAL、NOG、NRG1、NRP1、NRP2、OSMR、PARK7、PDPN、PF4、PF4V1、PGLYRP1、PLP2、PPBP、PXDN、SCG2、SCGB3A1、SECTM1、SLURP1、SOSTDC1、SP100、SPP1、TCAP、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、THBS1、THNSL2、THPO、TIMP1、TNF、TNFRSF11、TNFRSF1A、TNFRSF9、TNFRSF10、TNFSF11、TNFSF12、TNFSF12-、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18、TNFSF4、TNFSF8、TNFSF9、TRIM16、TSLP、TWSG1、TXLNA、VASN、VEGFA、VSTM1、WFIKKN1、WFIKKN2、WNT1、WNT2、WNT5A、WNT7A和ZFP36。
在一些实施方案中，细胞因子选自MCP1(CCL2)、MCP-2、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、Il-4和IFNγ。
在某些实施方案中，可以从如本文公开的免疫效应细胞中缺失的转录因子包括AHR、BCL6、FOXP3、GATA3、MAF、RORC、SPI1和TBX21。
这些基因的序列是本领域已知且可获得的，并且可以包括例如表10中提供的那些。
优先级(priority)靶基因的选择
为减轻CRS而在CAR-T细胞中缺失或抑制(例如，消融、敲除，KO)的特别感兴趣的细胞因子/趋化因子基因靶标已基于生物学功能分成几组。CRS的发展取决于CAR-T细胞激活以及随后的细胞因子释放，这在CAR-T细胞疗法的受体中引发免疫系统失调。几项研究已表明，受体髓样激活对于CRS的发展是必要的。
CAR-T中待KO的第一组潜在基因是表面受体，其在正常免疫反应中与髓样细胞衔接时激活髓样细胞(例如，CD40L)。第二组是从激活髓样细胞的CAR-T细胞中释放的细胞因子(例如，GM-CSF)。在这两个类别中，目标都是防止CAR-T细胞信号传导，所述信号传导将激活受体髓样细胞并引发CRS。
第三类靶标是整合到CAR-T受体中的增加T细胞活化(可能在不存在肿瘤靶标的情况下)的内源性T细胞受体(例如，内源性CD28)。目的是减少由非肿瘤相互作用(诸如可能与活化T细胞上的CD28接合的活化髓样细胞)造成的CAR-T的活化，从而扩大T细胞的细胞因子产生和随后的髓样活化。
第四和第五类基因KO靶标是驱动CAR-T细胞分化和随后的功能特征的转录因子和细胞因子。在表型上与正常细胞毒性T细胞(CTL，通常通过CD8表达鉴定)相似的CAR-T细胞能够通过T细胞介导的效应子功能直接杀伤肿瘤。通过T辅助细胞(表达CD4)支持和维持CTL。重要的是，T辅助细胞的子集可以支持(即，Th1细胞)或抑制(即，Th2细胞)CTL。其他T细胞(诸如Treg)也可以抑制CTL的发育和功能。目的是靶向CAR-T群中的细胞因子或转录因子，其将导致CAR-T分化为非细胞毒性T细胞群体。另外，Th2细胞产生细胞因子(诸如GM-CSF和IL-4)，它们是CRS的指示性标志物。不能最佳杀伤肿瘤细胞的CAR-T表型可能将通过CAR-T受体被激活，产生在宿主中驱动CRS的信号，增加肿瘤杀伤所需的时间，并需要比优化的“杀伤”产品更高的CAR-T细胞剂量。因此，敲除或消融(或抑制)转录因子(诸如GATA3)或细胞因子(诸如IL-4)将防止(或减少)Th2偏好(bias)并减少CRS。
关于髓样激活细胞因子和优化的CAR-T细胞分化的另一个感兴趣的问题是减轻CAR-T神经毒性的潜力。神经毒性发生在少数患有CRS的CAR-T受体群体中。研究已表明，进展为具有神经毒性的CRS患者的IL-5和铁蛋白水平升高(Santomasso等,2017和Philip等,2019)。这两种生物标志物表明，肥大细胞激活可能与CNS并发症有关。IL-5是由Th2细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞产生的关键细胞因子。在肥大细胞增多症和若干与肥大细胞失调有关的疾病中观察到铁蛋白的水平过高。另外，许多肥大细胞疾病包括神经系统失调。鉴于一些患者中升高的IL-5、铁蛋白水平和神经毒性，通过诸如IL-5的细胞因子减少肥大细胞激活，或阻止驱动IL-5依赖性肥大细胞激活的Th2细胞发育也可减轻在CRS受体中观察到的神经系统并发症。关于CNS并发症，由于先前在CNS中表现出高T细胞负担，还重点指出CX3CR1和OX40。CX3CR1是T细胞趋化因子受体，其主要将T细胞和潜在的CAR-T细胞引导到CNS中。OX40是T细胞受体，其通过与嗜酸粒细胞和肥大细胞上的OX40L进行细胞-细胞相互作用来促进活化。
因此，在某些实施方案中，细胞因子选自CCL2(MCP1)、MCP-2、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、Il-4和IFNγ。
CAR-T疗法的适应症和护理标准
在一些实施方案中，本文公开和/或使用本文公开的方法产生的基因组编辑的免疫效应细胞表达一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，并且可以用作药物，即用于治疗疾病。在许多实施方案中，细胞是CAR-T细胞。
本文公开和/或使用本文公开的方法产生的细胞可用于免疫疗法和过继性细胞转移，以用于治疗或制造药物以用于治疗癌症、自身免疫疾病、传染病和其他病状。
癌症可以是血液系统恶性肿瘤或实体肿瘤。血液系统恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤以及其亚型。淋巴瘤可以多种方式归类，通常基于恶性细胞的基础类型，包括霍奇金淋巴瘤(通常是Reed-Sternberg细胞的癌症，但有时也起源于B细胞；所有其他淋巴瘤都是非霍奇金淋巴瘤)、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤以及如本文定义和本领域已知的其他淋巴瘤。
B细胞淋巴瘤包括但不限于弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，以及如本文定义和本领域已知的其他淋巴瘤。
T细胞淋巴瘤包括T细胞急性成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、T细胞慢性淋巴细胞性白血病(T-CLL)塞萨里(Sezary)综合征，以及如本文定义和本领域已知的其他淋巴瘤。
白血病包括急性髓性(或骨髓性)白血病(AML)、慢性髓性(或骨髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞性(或成淋巴细胞性)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)毛细胞白血病(有时归类为淋巴瘤)，以及如本文定义和本领域已知的其他白血病。
浆细胞恶性肿瘤包括淋巴浆细胞性淋巴瘤、浆细胞瘤和多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，所述药物可以用于治疗患者的癌症，特别是用于治疗实体肿瘤，诸如黑素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤或癌瘤，诸如脑部肿瘤、头颈肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤(例如，非小细胞肺癌，NSCLC)、生殖道(例如，卵巢)肿瘤、上消化道肿瘤、胰腺肿瘤、肝脏肿瘤、肾脏系统(例如，肾)肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺肿瘤和结肠直肠肿瘤。
在另一个实施方案中，所述药物可以用于治疗患者的癌症，特别是用于治疗选自多发性骨髓瘤和急性髓性白血病(AML)的血液系统恶性肿瘤以及选自T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)、非霍奇金淋巴瘤和T细胞慢性淋巴细胞性白血病(T-CLL)的T细胞恶性肿瘤。
在一些实施方案中，所述细胞可用于治疗自身免疫疾病，诸如狼疮、自身免疫性(类风湿性)关节炎、多发性硬化症、移植排斥、克罗恩病、溃疡性结肠炎、皮炎等。在一些实施方案中，细胞是嵌合自身抗体受体T细胞，或展示抗原或其片段而非抗体片段的CAAR-T；在过继性细胞转移的这一型式中，引起自身免疫疾病的B细胞将试图攻击工程改造的T细胞，后者将把其杀伤以做出反应。
在一些实施方案中，细胞可用于治疗传染病，诸如HIV和结核病。
在另一个实施方案中，本公开的CAR-T细胞可以经历稳健的体内T细胞扩增并且可以持续延长量的时间。
在一些实施方案中，用本公开的CAR-T细胞治疗患者可以是改善、治愈或预防性的。它可以是自体免疫疗法的一部分，也可以是同种异体免疫疗法治疗的一部分。自体是指用于治疗患者的细胞、细胞系或细胞群均来源于所述患者或来源于人白细胞抗原(HLA)相容的供体。同种异体是指用于治疗患者的细胞或细胞群不来源于患者，而是来源于供体。
用本公开的CAR-T细胞治疗癌症可与选自以下的一种或多种疗法组合：抗体疗法、化学疗法、细胞因子疗法、树突状细胞疗法、基因疗法、激素疗法、放射疗法、激光疗法以及放射疗法。
本公开的CAR-T细胞或CAR-T细胞群的施用通过气雾剂吸入、注射、摄取、输液、植入或移植进行。本文所述的CAR-T细胞组合物，即单CAR、双CAR、串联CAR，可皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内或淋巴管内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本公开的细胞组合物优选通过静脉内注射施用。
CAR-T细胞或CAR-T细胞群的施用可以由以下组成：施用104-109个细胞/kg体重，优选地105至106个细胞/kg体重，包括那些范围内的细胞数量的所有整数值。CAR-T细胞或CAR-T细胞群可以一次或多次剂量施用。在另一个实施方案中，有效量的CAR-T细胞或CAR-T细胞群作为单剂量施用。在另一个实施方案中，有效量的细胞在一段时间内作为多于一次剂量施用。施用定时在医疗护理提供者的判断范围内，并取决于患者的临床状况。CAR-T细胞或CAR-T细胞群可获自任何来源，诸如血库或供体。虽然患者的需求变化，但是针对特定疾病或病状的给定CAR-T细胞群的有效量的最佳范围的确定在本领域技术范围内。有效量是指提供治疗或预防有益效果的量。施用的剂量将取决于患者受体的年龄、健康状况和体重、同时治疗的类型(如果有的话)、治疗的频率以及期望效果的性质。
在另一个实施方案中，肠胃外施用有效量的CAR-T细胞或CAR-T细胞群或包含那些CAR-T细胞的组合物。施用可以是静脉内施用。可以通过在肿瘤内注射直接进行CAR-T细胞或CAR-T细胞群或包含那些CAR-T细胞的组合物的施用。
在本公开的一个实施方案中，将CAR-T细胞或CAR-T细胞群与任何数量的相关治疗方式结合(例如，在其之前、与其同时或在其之后)施用给患者，所述相关治疗方式包括但不限于使用细胞因子进行治疗，或从CAR-T内表达细胞因子，所述细胞因子增强T细胞增殖和持久性并且包括但不限于IL-2、IL-7和IL-15。
在第二实施方案中，本公开的CAR-T细胞或CAR-T细胞群可与抑制免疫抑制途径的剂组合使用，所述剂包括但不限于TGF-β的抑制剂、白介素10(IL-10)、腺苷、VEGF、吲哚胺2,3双加氧酶1(IDO1)、吲哚胺2,3-双加氧酶2(IDO2)、色氨酸2-3-双加氧酶(TDO)、乳酸盐、低氧、精氨酸酶以及前列腺素E2。
在另一个实施方案中，本公开的CAR-T细胞或CAR-T细胞群可与T细胞检查点抑制剂组合使用，所述T细胞检查点抑制剂包括但不限于抗CTLA4(依匹木单抗(Ipilimumab))、抗PD1(派姆单抗(Pembrolizumab)、纳武单抗(Nivolumab)、塞普利单抗(Cemiplimab))、抗PDL1(阿特朱单抗(Atezolizumab)、阿维单抗(Avelumab)、德瓦鲁单抗(Durvalumab))、抗PDL2、抗BTLA、抗LAG3、抗TIM3、抗VISTA、抗TIGIT和抗KIR。
在另一个实施方案中，本公开的CAR-T细胞或CAR-T细胞群可与T细胞激动剂组合使用，所述T细胞激动剂包括但不限于刺激CD28、ICOS、OX-40、CD27、4-1BB、CD137、GITR和HVEM的抗体。
在另一个实施方案中，本公开的CAR-T细胞或CAR-T细胞群可与治疗性溶瘤病毒组合使用，所述溶瘤病毒包括但不限于逆转录病毒、小核糖核酸病毒、弹状病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒、细小病毒、腺病毒、疱疹病毒和痘病毒。
在另一个实施方案中，本公开的CAR-T细胞或CAR-T细胞群可与免疫刺激疗法组合使用，所述免疫刺激疗法诸如toll样受体激动剂，包括但不限于TLR3、TLR4、TLR7和TLR9激动剂。
在另一个实施方案中，本公开的CAR-T细胞或CAR-T细胞群可与干扰素基因(STING)激动剂的刺激物，诸如环GMP-AMP合酶(cGAS)组合使用。
在过继性细胞转移疗法后，免疫效应细胞发育不全，特别是T细胞发育不全也是一个问题。当所治疗的恶性肿瘤是T细胞恶性肿瘤，并且CAR-T细胞靶向T细胞抗原时，正常T细胞及其表达抗原的前体将耗尽，并且免疫系统将受损。因此，用于管理这些副作用的方法是伴随着疗法的。此类方法包括选择并保留非恶性T细胞或前体，无论是自体的还是同种异体的(任选地被工程改造成不引起排斥或不被排斥)，以便随后在CAR-T细胞耗竭或失活后进行扩增并重新输注到患者体内。可替代地，识别并杀伤携带TCR的细胞的子集，诸如正常和恶性TRBC1+而非TRBC2+细胞，或可替代地，TRBC2+而非TRBC1+细胞的CAR-T细胞可用于根除T细胞恶性肿瘤，同时保存足够的正常T细胞以维持正常的免疫系统功能。
定义
如本文所用，以下术语具有所指定的含义。其他定义可出现在整个说明书中。
当公开值的范围并使用“从n1…至n2”或“n1…与n2之间”(其中n1和n2是数字)的表示法时，除非另外指明，否则此表示法旨在包括数字本身和它们之间的范围。此范围可以是端值之间的整数或连续范围，并且包括端值。例如，范围“从2至6个碳”旨在包括二、三、四、五和六个碳，因为碳为整数单位。对比，例如，范围“从1至3μM(微摩尔)，”其旨在包括1μM、3μM和在其间的所有数字至任何位数的有效数字(例如，1.255μM、2.1μM、2.9999μM等)。
如本文所用，术语“约”旨在限定其修饰的数值，表明所述值是误差幅度内的变量。当没有详述特别的误差幅度，诸如在数据图或表中给定的平均值的标准偏差时，术语“约”应理解为表示将涵盖所述值的范围，和考虑到有效数字，可以被所述数字的上下舍入(rounding up or down)所包括的范围。
关于细胞的术语“激活”(及其其他词形变化)通常被理解为与“刺激”同义，并且如本文所用，是指导致细胞群扩增的细胞处理。在T细胞中，激活通常通过暴露于CD2和CD28(有时还包括CD2)激动剂来实现的，所述激动剂通常是抗体，任选地包被在磁珠上或与胶体聚合物基质缀合。
如本文所用，术语“抗原”是由T细胞受体或嵌合抗原受体识别(即，是其靶标)的细胞表面蛋白。在传统意义上，抗原是由抗体识别的物质，通常是蛋白质，但就CAR包含抗体衍生的结构域，诸如识别一个或多个抗原的轻链(VL)和重链(VH)而言，定义是重叠的。
术语“癌症”是指细胞在体内的恶性或异常生长。许多不同的癌症可以通过特定的细胞表面蛋白或分子进行表征或鉴定。因此，总体来说，根据本公开的癌症可指可用免疫效应细胞诸如如本文所述的CAR-T细胞治疗的任何恶性肿瘤，其中免疫效应细胞识别并结合癌细胞上的细胞表面蛋白。如本文所用，癌症可指血液系统恶性肿瘤，诸如多发性骨髓瘤、T细胞恶性肿瘤或B细胞恶性肿瘤。T细胞恶性肿瘤可包括但不限于T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)或非霍奇金淋巴瘤。癌症也可指实体肿瘤，诸如包括但不限于宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤和肺癌。
如本文所用，“细胞表面蛋白”是由细胞至少部分地在细胞表面上表达的蛋白质(或蛋白质复合物)。细胞表面蛋白的实例包括TCR(及其亚基)和CD7。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂，以治疗在本公开描述的治疗性病状或病症。此类施用涵盖以基本同时的方式共同施用这些治疗剂，诸如以具有固定比例的活性成分的单个胶囊，或以每种活性成分的多个、分离的胶囊。此外，此类施用也涵盖以顺序的方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将在治疗本文所述病状或病症方面提供药物组合的有益作用。
如本文所用，术语“组合物”是指与一种或多种治疗上可接受的载剂组合的免疫治疗性细胞群。
如本文所用，术语“疾病”意思通常与术语“病症”、“综合征”和“病状”(如在医学病状中)同义，并且与其可互换使用，因为其均反应人或动物身体或身体的一个部分的异常情况，所述异常情况损害正常的功能，通常通过有区别的病征和症状表现出来，并引起人或动物的寿命期缩短或生活质量降低。
术语“供体模板”是指细胞用作模板以通过同源定向修复(HDR)DNA修复途径修复双链断裂的参考基因组材料。供体模板包含待插入基因组的DNA片段(包含待表达的基因、CAR或标志物)，其两个同源臂处于双链断裂位点的两侧。在一些实施方案中，供体模板可以是腺相关病毒、单链DNA或双链DNA。
如本文所用，术语“自相残杀”是指在CAR-T细胞(或其他携带CAR的免疫效应细胞)成为包含与CAR-T细胞的靶标相同的嵌合抗原受体的另一CAR-T细胞的靶标并被其杀伤时发生的过程，这是由于靶向细胞表达被在这两个细胞上的嵌合抗原受体特异性识别的抗原。缺乏嵌合抗原受体所特异性结合的抗原的包含嵌合抗原受体的CAR-T将是“具有自相残杀抗性的”。
如本文所用，术语“基因组编辑的”或“基因编辑的”是指对基因或基因组的部分进行添加、缺失或修饰(例如，破坏)以使其无功能。因此，在某些实施方案中，“基因组编辑的T细胞”是这样的T细胞：其添加了识别至少一种抗原的基因，诸如CAR；和/或缺失了诸如由CAR识别的抗原基因的基因，和/或TCR或其亚基的基因被破坏。
如本文所用，“健康供体”是不具有恶性肿瘤(特别是血液系统恶性肿瘤，例如T细胞恶性肿瘤)的供体。
如本文所用，“未成熟的树突状细胞”或“iDC”是指未成熟的树突状细胞。
术语“治疗可接受的”是指适于被用于接触患者组织且不产生不当的毒性、刺激和过敏反应，与合理的益处/风险比相当且对它们的预期用途而言有效的物质。
术语“治疗有效的”旨在限定用于治疗疾病或病症或实现临床终点的活性成分的量。
术语“患者”通常与术语“受试者”同义，并且包括了包括人在内的所有哺乳动物。
“恶性B细胞”是源自B细胞恶性肿瘤的B细胞。B细胞恶性肿瘤包括但不限于(DLBCL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，以及B细胞前体急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。
在使物质组合物(诸如抗体)与其他物质组合物(诸如细胞)紧密接触的上下文中，如本文所用，术语“暴露于”旨在和“与...一起孵育”同义，并且使用一个术语代替另一个术语并不意味着需要更长的接触时间段。
“恶性T细胞”是源自T细胞恶性肿瘤的T细胞。术语“T细胞恶性肿瘤”是指源自T细胞前体、成熟T细胞或自然杀伤细胞的恶性肿瘤的广泛、高度异质性的分组。T细胞恶性肿瘤的非限制性实例包括T细胞急性成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(T-ALL)、人T细胞白血病病毒1型阳性(HTLV-1+)成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、成人T细胞淋巴瘤/白血病(HTLV-1相关)、侵袭性NK细胞白血病、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、ALK阳性、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、ALK阴性、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(AITL)、乳房植入物相关的间变性大细胞淋巴瘤、NK细胞的慢性淋巴增生性病症、鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、滤泡性T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、胃肠道惰性T细胞淋巴增生性病症、单形性亲上皮性肠道T细胞淋巴瘤(Monomorphic epitheliotrophicintestinal T-cell lymphoma)、蕈样肉芽肿、具有TFH表型的结内外周T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、NOS、原发性皮肤α/βT细胞淋巴瘤、原发性皮肤CD8+侵袭性亲表皮细胞毒性T细胞淋巴瘤、原发性皮肤肢端CD8+T细胞淋巴瘤(Primary cutaneous acral CD8+T-cell lymphoma)、原发性皮肤CD4+小/中T细胞淋巴增生性病症[原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(C-ALCL)、淋巴样丘疹(lymphoid papulosis)]、塞扎里综合征(Sezary syndrome)，皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、儿童系统性EBV+T细胞淋巴瘤，以及T细胞大颗粒淋巴细胞性白血病(LGL)。
“恶性浆细胞”是源自浆细胞恶性肿瘤的浆细胞。术语“浆细胞恶性肿瘤”是指其中异常浆细胞过度产生的恶性肿瘤。浆细胞恶性肿瘤的非限制性实例包括淋巴浆细胞性淋巴瘤、浆细胞瘤和多发性骨髓瘤。
如本文所用，“自杀基因”是指通过本领域已知的标准方法引入CAR-T细胞的核酸序列，其在被激活时导致CAR-T细胞的死亡。如果需要，自杀基因可有助于在体内追踪和消除(即，杀伤)CAR-T细胞。通过激活自杀基因促进CAR-T细胞杀伤可以通过本领域已知的标准方法实现。本领域已知的自杀基因系统包括但不限于若干单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)/更昔洛韦(GCV)自杀基因治疗系统和诱导型半胱天冬酶9蛋白。在一个实施方案中，自杀基因是嵌合CD34/胸苷激酶。
如本文所用，“免疫效应细胞”是可以调节免疫应答的白细胞。免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、iNKT细胞(恒定T细胞受体α自然杀伤T细胞)和巨噬细胞。携带T细胞受体(TCR)的免疫效应细胞当然包括T细胞，还包括已经被工程改造以表达T细胞受体的细胞。免疫效应细胞可从任何适当的来源获得或衍生/产生，诸如包括但不限于健康供体、外周血单核细胞、脐带血和诱导性多能干细胞(iPSC)。
如本文所用，“携带CAR的免疫效应细胞”是已经用至少一种CAR转导的免疫效应细胞。“CAR-T细胞”是已经用至少一种CAR转导的T细胞；CAR-T细胞可以是单、双或串联CAR-T细胞。CAR-T细胞可以是自体的，这意味着它们是从受试者自身的细胞工程改造而来的，或是同种异体的，这意味着所述细胞都来源于健康供体，并且在许多情况下，经过工程改造以免引起宿主抗移植物或移植物抗宿主反应。
如本文所用且通常在本领域中使用的“嵌合抗原受体”或“CAR”是指具有细胞外配体结合结构域、跨膜结构域以及在细胞外配体结合结构域与靶细胞上存在的组分结合时指导细胞执行特化功能的信号转导结构域的重组融合蛋白。例如，CAR可以对具有激活T细胞受体的细胞内结构域的期望抗原(例如，肿瘤抗原)具有基于抗体的特异性，以产生表现出特异性抗靶标细胞免疫活性的嵌合蛋白。第一代CAR包括细胞外配体结合结构域和信号转导结构域，通常为CD3ζ或FcεRIγ。通过包括细胞内共刺激结构域(通常为4-1BB或CD28)，在第一代CAR构建体的基础上构建第二代CAR。与第一代CAR相比，这些共刺激结构域有助于增强CAR-T细胞的细胞毒性和增殖。第三代CAR包括多个共刺激结构域，主要用以增加CAR-T细胞的增殖和持久性。嵌合抗原受体与其他抗原结合剂的区别在于它们结合MHC非依赖性抗原并通过其细胞内结构域转导激活信号的能力。
术语“CAR-iNKT细胞”(等效地，iNKT-CAR)是指表达嵌合抗原受体的iNKT细胞。双iNKT-CAR细胞(等效地，iNKT-dCAR)是这样的iNKT-CAR细胞，其表达对在同一效应细胞内表达的不同靶抗原具有亲和力的两种不同的嵌合抗原受体多肽，其中各CAR独立发挥作用。CAR可从单个或多个多核苷酸序列表达。串联iNKT-CAR细胞(等效地，iNKT-tCAR)是具有单个嵌合抗原多肽的iNKT-CAR细胞，所述多肽包含对不同靶标具有亲和力的两个不同的抗原识别结构域，其中抗原识别结构域通过肽接头连接并共享共同的共刺激结构域，并且其中任一抗原识别结构域的结合将通过共同的共刺激结构域和信号传导结构域进行信号传导。
术语“嵌合抗原受体T细胞”(等效地，CAR-T)是指表达嵌合抗原受体的T细胞。
术语双CAR-T(dCAR-T)是指表达对在同一效应细胞内表达的不同靶抗原具有亲和力的两种不同的嵌合抗原受体多肽的CAR-T细胞，其中各CAR独立发挥作用。CAR可从单个或多个多核苷酸序列表达。
术语串联CAR-T(tCAR-T)是指包含对不同靶标具有亲和力的两个不同的抗原识别结构域的单个嵌合抗原多肽，其中抗原识别结构域通过肽接头连接并共享共同的共刺激结构域，其中任一抗原识别结构域的结合将通过共同的共刺激结构域和信号传导结构域进行信号传导。
如本文所用，嵌合抗原受体自然杀伤(NK)细胞(等效地，NK-CAR)将具有与CAR-T和iNKT-CAR的定义类似的含义。
如本文所用，嵌合抗原受体巨噬细胞(等效地，CAR-巨噬细胞)将具有与CAR-T、iNKT-CAR和NK-CAR的定义类似的含义。
如本文所用，术语“细胞因子释放综合征”是指在用一些类型的免疫疗法诸如单克隆抗体和CAR-T或其他携带CAR的免疫效应细胞治疗后可能发生的病状。细胞因子释放综合征是由细胞因子从受免疫疗法影响的免疫细胞大量快速地释放到血液中引起的。CRS的症状包括发烧、疲劳、食欲不振、肌肉和关节疼痛、恶心、呕吐、腹泻、皮疹、呼吸急促、心跳加快、低血压、癫痫、头痛、意识模糊、精神错乱、幻觉、震颤和失去协调性。CRS可以表现为轻度至致命的范围，并且可以按严重程度排序如下：
·1级：轻度反应，不指示中断输注；不指示干预
·2级：指示疗法或输注中断，但对于对症治疗(例如，抗组胺药、NSAIDS、麻醉剂、静脉输液)迅速做出反应；指示持续<＝24h的预防性药物
·3级：延长(例如，对于对症用药不迅速做出反应和/或短暂中断输注)；初步改善后症状复发；因临床后遗症(例如，肾功能受损、肺浸润)而指示住院
·4级：威及生命的后果；指示升压或通气支持
·5级：死亡
参见，例如，“不良事件常用术语标准(Common Terminology Criteria forAdverse Events，CTCAE)v4.03版,”美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)和美国国立癌症研究所(National Cancer Institute),2010年6月14日；Lee DW等,“Current concepts in the diagnosis and management of cytokine releasesyndrome,”Blood 2014 124(2):188–95。
如本文所用，术语“CAR-T相关神经病”是指对患者施用CAR-T疗法后出现的神经病，通常在所介入的细胞因子释放综合征已经发生并消退之后。该术语相对较新，主要是因为CAR-T疗法相对较新；参见，例如，Vasthie P和Breitbart WS,“Chimeric antigenreceptor T-cell neuropsychiatric toxicity in acute lymphoblastic leukemia,”Palliat Support Care.2017年8月；15(4):499–503。因此，此时应将CAR-T相关神经病理解为等同于术语“携带CAR的免疫效应细胞相关的神经病”，因为类似的神经病可能由使用例如iNKT-CAR或NK-CAR的疗法引起。
如本文所用，“细胞因子”是一类小的(～5-20kDa)可溶性信号传导蛋白中的一种，其由免疫系统的某些细胞以可变的且偶尔局部高的浓度合成并分泌，并且通过与其他细胞上的受体结合而向那些细胞发送信号并对其产生影响。“趋化因子”是趋化性细胞因子，即能够在附近的反应细胞中诱导趋化性的细胞因子的亚种。
如本文所用，“缺乏”细胞因子或蛋白质是指缺少足够量的细胞因子或蛋白质以使细胞因子或蛋白质引起其正常作用。例如，“缺乏”GM-CSF的细胞(“缺乏GM-CSF的”细胞)可能完全缺少GM-CSF，但它也可以表达量可忽略不计的GM-CSF，使得存在的GM-CSF不可以任何有意义的方式促进细胞因子释放综合征的发展或维持。
如本文在提及对基因或其蛋白质产物进行编辑的作用时所用的术语“缺失”是指编码蛋白质的DNA的序列的一部分发生改变或丧失，以减少或阻止蛋白质产物的表达。在相同的上下文中，术语“抑制”是指减少蛋白质产物的表达；并且在相同的上下文中，术语“消融”是指敲除(KO)或阻止蛋白质产物的表达。缺失涵盖抑制和消融。
如本文所用，“可分泌蛋白”是由细胞分泌的对其他细胞有影响的蛋白质。例如，可分泌蛋白包括细胞因子、趋化因子和转录因子。
如本文所用，“选择性标志物”是指允许在不同的细胞类型之间进行区分的标志物，所述细胞诸如已成功插入CAR的细胞(即，经基因编辑或修饰的细胞)。选择性标志物在本领域是众所周知的，并且其使用材料和方法是容易获得的。在一些实施方案中，根据本公开适当的选择性标志物可以是荧光蛋白基因，诸如包括但不限于绿色荧光(GFP)基因或黄色荧光蛋白(YFP)基因。在一些实施方案中，选择性标志物可以是CD34基因的剪接变体，诸如截短的CD34(tCD34)基因或截短的EGFR(tEGFR)基因。在一些实施方案中，本文所述的选择性标志物，诸如GFP或本领域已知且可获得的其他选择性标志物，可单独插入如本文所述的基因中(即，没有CAR)，或可作为包含选择性标志物和CAR的构建体的组分插入。
如本文所用，“短发夹RNA”或“小发夹RNA”(shRNA)是人工RNA分子，通常长约80个碱基对并且具有紧密发夹弯，可以用于通过在细胞内加工成siRNA(其进而敲低基因表达)而使靶基因表达沉默。ShRNA可以整合到基因组DNA中，并提供稳定且持久的表达。
如本文所用，“转导”是通过病毒或病毒载体诸如质粒，例如通过短发夹RNA(shRNA)将外源DNA引入细胞的过程；其通常提供基因的持久或永久沉默。这可通过本领域已知的方法，包括电穿孔来实现。
转染是将纯化的核酸有意引入真核细胞(例如小干扰RNA(siRNA))的过程；其通过对mRNA转录物的RNA干扰而使基因瞬时沉默。“转导”是通过病毒或病毒载体诸如质粒，例如通过短发夹RNA(shRNA)将外源DNA引入细胞的过程；其通常提供基因的持久或永久沉默。两者均可通过本领域已知的方法，包括电穿孔来实现。
实施例
将通过以下实施例进一步说明本发明。
实施例1-通过CAR插入阻断基因翻译的方法。
图1示出通过使用Cas9/CRISPR靶向细胞因子基因中的基因座，然后使用同源定向修复插入CAS构建体来使细胞因子基因缺失。任选地，CAS构建体将包含标志物，诸如如本文所述的选择性标志物。这个概念的一个挑战是难以从仍然表达细胞因子/趋化因子的那些细胞中选择并分选出已编辑的细胞。解决此问题的一种方式是将包含标志物的CAR构建体插入已缺失的基因中。先前已经证明将CAR19插入TRAC基因允许选择TRAC阴性、CAR阳性的细胞。这将允许分选既表达car又缺失细胞因子的细胞。另一替代方案将是由CAR构建体表达shRNA，所述shRNA将降解编码细胞因子的RNA而不改变基因组。CAR构建体上的标志物(诸如截短的CD34标志物)可以用于选择下调细胞因子并表达CAR的细胞，即CAR+＝细胞因子阴性。
如图2所示，将持续两天激活携带CAR的免疫效应细胞(例如，CAR-T)，之后进行基因编辑以使靶细胞因子基因缺失并转导CAR。
实施例2-制备基因组编辑的携带CAR的免疫效应细胞的一般方法
关于制备携带CAR的免疫效应细胞的方式的另外细节在本领域是已知的，例如，如WO2018027036A1中所公开的。
可采取以下一般步骤来提供携带CAR的免疫效应细胞。如本领域技术人员将认识到的，尽管可能导致不同的效率，但是某些步骤可顺序进行或不按下面列出的顺序进行。
步骤1.将细胞收获、分离并纯化，例如使用与细胞特异性蛋白结合的标记抗体包被的磁珠(可购自，例如，Miltenyi Biotec)进行磁性选择。对于T细胞，可以使用抗CD3/CD28珠粒。其他纯化技术是本领域已知的并且可以使用。
步骤3.之后将细胞激活。存在几种激活免疫效应细胞的方式。例如，可使用抗CD3/CD28珠粒持续两天激活T细胞，之后除去珠粒。可替代地，可以使用抗体。
步骤4.可使作为CAR靶标的抗原从细胞表面缺失或使其表达被抑制，以防止随后自相残杀。可使用Cas9 mRNA和针对靶标的gRNA，通过电穿孔实现靶标缺失。然而，可以使用其他技术抑制靶标的表达。这些包括其他基因组编辑技术，诸如TALEN、ZFN、RNA干扰，以及引发抗原的内部结合以防止细胞表面表达。可能并非在每种情况下都需要靶标的缺失。可使用的gRNA的实例包括表8-10中示出的那些，以及本领域已知的其他实例。
表8：用于除去免疫效应细胞上的表面抗原的指导RNA序列
RNA；(ps)指示硫代磷酸酯。加下划线的碱基表示靶序列。
步骤5.然后可用靶向(即，识别)一种或多种抗原或蛋白质靶标的CAR，例如用包含CAR构建体的慢病毒，对细胞进行转导。可使用任何其他合适的转导/转染方法，例如使用包含可转座元件的DNA整合的病毒或非病毒载体进行转染，或瞬时表达非DNA整合的多核苷酸，诸如mRNA，或使用同源或非同源重组将CAR多核苷酸插入核酸酶活性位点。
步骤6.然后对携带CAR的免疫效应细胞进行培养，以扩增其群体。
实施例3-制备基因组编辑的携带串联CAR的免疫效应细胞的方法
在以上实施例中的方案的变型中，可以制备识别两种抗原的tCAR细胞。在步骤4中，可以如上所述使两种抗原从细胞表面缺失或受抑制，但是用针对两个靶标中的每一个的gRNA和Cas9 mRNA进行电穿孔。然后在步骤5中，用识别两个靶标的CAR转导细胞。
实施例4-制备基因组编辑的携带双CAR的免疫效应细胞的方法
在以上实施例中的方案的变型中，可以制备靶向两种抗原的dCAR细胞。此变型将包含两个单独的CAR，其各自识别不同的抗原。
实施例5-制备和测试细胞因子或趋化因子的表达被抑制的基因组编辑的CAR-T细胞的方法
可采取以下步骤，以提供特定细胞因子或趋化因子的表达和/或分泌被抑制的基因组编辑的CAR-T细胞。本实施例描述缺乏GM-CSF的表达的靶向CD19的CAR-T的制备。如本领域技术人员将认识到的，尽管可能导致不同的效率，但是某些步骤可顺序进行或不按下面列出的顺序进行。
如果执行体内CRS实验，则将肿瘤注射到SCID-Beige小鼠(包含荧光素酶的3e6Raji)中。这应在将CAR-T输注到小鼠中之前3周完成。
T细胞激活(第0天)。
使用Miltenyi人泛T分离试剂盒(Miltenyi human PanT isolation kit)通过白细胞分离术腔室纯化T细胞，然后重悬于培养基中。对细胞计数并确定获得3:1的珠粒:细胞比所需的人T细胞活化CD3/CD28珠粒的数目。将珠粒用T细胞培养基洗涤2x，然后将细胞以1.256个细胞/mL稀释于hXcyte培养基中。添加人T细胞活化CD3/CD28珠粒。向6孔板的每个孔中等分4 mL/孔的1.256个细胞/mL溶液。将细胞在37℃下孵育。
CRISPR(第2天)。
可使用Cas9 mRNA和针对靶标的gRNA，通过电穿孔实现靶标缺失。然而，可以使用其他技术抑制靶标的表达。这些包括其他基因组编辑技术，诸如TALEN、RNA干扰，以及引发抗原的内部结合以防止细胞表面表达。可使用的gRNA的实例包括表8-10中示出的那些，以及本领域已知的其他实例。
样品ID
gRNA#1
Cas9
核转染缓冲液P3
20μg gGM-CSF
15μg Cas9 mRNA
100μl
表9：用于减少CRS的指导RNA序列
RNA；(ps)指示硫代磷酸酯。加下划线的碱基表示靶序列。
表10：用于降低CRS发病率的另外的指导RNA序列
*表示由激活或定位髓样细胞的T细胞产生的细胞因子/趋化因子
**表示激活髓样细胞或CAR-T细胞的T细胞表面受体基因
***表示整合到CAR-T细胞信号传导中的T细胞表面受体，因此内源性受体是冗余的
^表示驱动T细胞/CAR-T细胞分化的细胞因子
粗体行表示驱动T细胞/CAR-T细胞分化的转录因子
实施例6-方案-使用核转染仪4D(nucleofector 4D)进行核转染
每个反应使用4x106个细胞。程序设定了EO-115-100μl转染体积，并将全部补充剂添加到NucleofectorTM Solution P3中。通过用期望体积的推荐培养基(在6孔板中2ml)填充适当数量的孔并在加湿的37℃/5％CO2培养箱中预孵育/平衡板来制备细胞培养板。以磁性方式除去珠粒(两次，以确保完全除去)，然后对细胞计数并确定细胞密度。将所需数量的细胞在室温下以90xg离心10分钟，完全除去上清液。然后将细胞重悬于PBS(1ml)中，并转移至微量离心管中，并将所需数量的细胞在室温下以90xg离心10分钟。完全除去上清液，并且将细胞沉淀物小心地重悬于完全室温的4D NucleofectorTM Solution P3中，每100μl4x106)。将20μg gRNA(gGM-CSF)添加到每个管的15μg Cas9 mRNA中。然后，将100μl细胞添加到每个管的Cas9/gRNA中，轻轻混合并将所有物质转移到NucleocuvetteTM中。轻敲比色杯以除去气泡。使用程序(Human T cell stim EO-115)进行电穿孔。运行完成后，使用专用工具将NucleocuvetteTM从固定器的容器中小心地取出。细胞用预热的培养基重悬。然后从目标孔中取出培养基，添加到比色杯中，然后轻轻地上下吸移两至三次。然后将其转移到孔中。用来自同一孔的培养基重复该过程，并在37℃下孵育。
CAR转导(第2天)。
然后可用靶向(即，识别)一个或多个靶标的一种或多种CAR，例如用包含CAR构建体的慢病毒，转导基因组编辑的CAR-T细胞。可使用任何其他合适的转导方法。
方案-用慢病毒转导T细胞：每毫升培养基(8mg/ml储备液)中添加一微升聚凝胺。然后添加所需量的病毒以得到所需的M.O.I.。将细胞和病毒混合并放回37℃培养箱中。
评估转导效率(第10天)。
然后可通过从每个样品中取出5x105个细胞并通过流式细胞术进行分析来评估细胞样品的转导效率。用RB洗涤样品，并添加3μl抗CD34 PE抗体(用以检测CAR，因为构建体包含人截短的CD34)。然后，添加5ul的CD3 APC，洗涤细胞，并执行流式细胞术。CAR-T细胞应是CD3ε阳性、CD34阳性的。
基因缺失的评估。
为了评估基因缺失，从每个样品中收获5x105个细胞，并提取其DNA。通过使用TIDE分析或深度测序对靶基因座进行靶测序来评估基因编辑效率。
肿瘤负荷和细胞因子水平的评估。
收获T细胞(第11天)。肿瘤负荷可使用生物发光成像在小鼠中成像。每只小鼠I.P.注射3x107个CAR-T。
使用例如Luminex多重细胞因子特征谱测定(Luminex multiplex cytokineprofiling assay)测量血清细胞因子水平(第12天)，以检查CRS相关细胞因子的升高。可执行针对靶细胞(Raji)的4h铬释放测定，以评估体外活性(第11天)。
实施例7-携带CAR的免疫效应细胞的另外实例
可使用上述方法制备缺乏细胞因子的几种类型的携带嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞。下表11-13给出实例。
表11.
表12.
表13.
实施例8-生物学测定
以下测定或其变型可用于评估本文公开的缺乏细胞因子的携带嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞的功效。
T-ALL。在T-ALL的异种模型中测试细胞的功效：1x105个Click Beetle Red荧光素酶(CBR)标记的CCRF-CEM T-ALL(99％CD7+，通过FACS获得)细胞将被I.V.注射到NSG受体中，之后在第+4天i.v.输注2x106至1x107个携带CAR7的免疫效应细胞或非靶向的携带CAR19的免疫效应细胞对照细胞。与接受携带CART19的免疫效应细胞的小鼠或仅注射肿瘤的小鼠相比，接受携带CAR7的免疫效应细胞的小鼠将表现出显著延长的生存期以及如通过生物发光成像确定的降低的肿瘤负荷。
多发性骨髓瘤。在多发性骨髓瘤的异种模型中测试iNKT-CAR-CS1的功效：5x105个Click Beetle Red荧光素酶(CBR)标记的MM.1S(99％CS1+，通过FACS获得)细胞将被I.V.注射到NSG受体中，之后在第+4或+14或+28天i.v.输注2x106至1x107个iNKT-CAR-CS1或非靶向的iNKT-CAR19对照细胞。与接受iNKT-CAR19的小鼠或仅注射肿瘤的小鼠相比，接受iNKT-CAR-CS1的小鼠将表现出显著延长的生存期以及如通过生物发光成像确定的降低的肿瘤负荷。
细胞因子释放综合征和神经毒性的体内模型。
CRS的体内小鼠模型公开于Giavridis等,“CAR T cell-induced cytokinerelease syndrome is mediated by macrophages and abated by IL-1blockade,”NatMed 2018年5月28日中。例如，为了起始CRS作为模型系统，将肿瘤细胞腹膜内注射到免疫缺陷小鼠中，并使其发展成肿瘤。然后向小鼠给予靶向癌细胞的CAR-T细胞并监测几天以诱导CRS的发作，然后处死小鼠并获得细胞和组织用于分析。还可对小鼠进行CRS治疗，并监测治疗的成功或失败(即，施用针对由于CAR-T细胞的施用产生的细胞因子的抗体)。
在这一模型中适于监测CRS的分析可包括监测施用CAR-T细胞后小鼠的体重变化、小鼠的存活百分比、炎性因子(即，鼠SAA3(相当于人C反应蛋白))的血清水平、CAR-T细胞施用前后的细胞因子水平、促炎性细胞因子的来源物种(即，人相对于鼠细胞因子)；和/或接受针对特定细胞因子的抗体的用CAR-T细胞治疗的小鼠的存活百分比。
最终死于CRS症状或并发症的小鼠可归类为患有严重CRS，而存活但体重减轻大于10％的小鼠可归类为患有不严重的CRS。使用此模型，发现单核细胞和巨噬细胞是CRS中IL-6的主要来源。
可用于评估CRS和CAR-T相关神经病的另一模型公开于Norelli,“Monocyte-derived IL-1 and IL-6 are differentially required for cytokine-releasesyndrome and neurotoxicity due to CAR T cells,”Nat Med 2018年5月28日中。在此模型中，将人干细胞(诸如造血干和祖细胞(HSPC))注射到人源化NSG小鼠中，所述小鼠是表达人干细胞因子、GM-CSF和IL-3以支持和增强所注射的人干细胞的造血作用的免疫失能的转基因小鼠。对小鼠给予肿瘤细胞，作为随后施用的CAR-T细胞的靶标，然后监测CRS症状。注射CAR-T细胞后，这些小鼠表现出典型的CRS症状，包括高烧和与CRS有关的某些细胞因子(诸如IL-1和/或IL-6)的水平升高。这些小鼠中CRS的控制可通过使用例如抗体阻断细胞因子的受体、使表达细胞因子的细胞类型耗尽或施用细胞因子的拮抗剂来实现。如上所述，已确定单核细胞是促CRS(pro-CRS)细胞因子IL-6的主要来源，并且单核细胞的耗尽消除CRS并保护小鼠免于因CRS而死亡。
其他CRS动物模型是本领域已知的，并且也可在认为适当时使用。
出于控制目的诱发和测试细胞因子释放综合征的方法
在一个模型中，如本文所述，可出于控制目的将IL-7直接注射到小鼠或其他动物模型中，以诱发或引起CRS。在另一个实例中，重组或转基因IL-7可在细胞中表达，以导致增加的IL-7信号传导。
在另一个实例中，可将组成型信号传导的细胞因子受体(诸如IL-7受体)工程改造到免疫效应细胞中，以使免疫效应细胞自身触发IL-7信号传导，但对细胞外IL-7无反应，并且避免引起周围淋巴细胞的IL-7信号传导。另外，与识别特定疾病或肿瘤抗原的CAR共表达组成型信号传导的IL-7受体导致T细胞增殖、存活和抗肿瘤活性的增加。组成型表达IL-7受体能够传递IL-7信号传导，而无需IL-7配体或共同的gammaγc链(天然IL-7受体的组分)以及IL-7Rα。这可以通过将半胱氨酸和/或脯氨酸工程改造到IL-7Rα链的跨膜结构域中来实现，这导致IL-7Rα的同二聚化以及随后的JAK1/JAK1磷酸化，其接着激活IL-7的下游信号传导。
下文提供了通过将选择性标志物插入基因编辑的基因座中来制备和测试不能诱发CRS的基因组编辑的CAR-T细胞的方法的实例。
实施例9-将CAR插入T细胞受体基因中
可将CAR或任何目标蛋白插入T细胞受体的基因中。MacLeod等(“Integration ofa CD19 CAR into the TCR Alpha Chain Locus Streamlines Production ofAllogeneic Gene-Edited CAR T Cells,”Molec Therapy 25(4):第949-961页,2017)报道了通过使用工程改造的归巢核酸内切酶和AAV供体模板将CAR转基因直接插入天然TCR基因座中来产生同种异体的CAR T细胞。以此方式产生的抗CD19 CAR T细胞不表达内源性细胞表面TCR，在体外表现出有效的效应子功能，并且在体内小鼠模型中介导CD19+肿瘤的清除。在临床前模型中，所得的基因编辑的CAR T细胞在体外和体内均表现出有效的抗肿瘤活性，这表明这些细胞具有在患有CD19+血液系统恶性肿瘤的无关患者中安全有效地用作过继性细胞疗法的潜力。
实施例10-用以减少CRS的抗细胞因子/趋化因子抗体
由于免疫效应细胞产生和分泌细胞因子和/或趋化因子，将免疫效应细胞引入患者或受试者以治疗癌症通常导致CRS。预防CRS的一种方式是向患者或受试者施用识别特定的诱发CRS的细胞因子或趋化因子的抗体，使得减少循环细胞因子/趋化因子的量。例如，如Sachdeva等,(J Biol Chem 294(14):5430-5437,2019)所报道，施用抗GMCSF抗体减少GMCSF分泌，从而有效减少CRS。因此，施用识别特定细胞因子和/或趋化因子的抗体可以预防或减少CRS在患者或受试者中的发生。
实施例11-将CAR插入GMCSF基因中
预防CRS的一种示例性方式是将CAR插入与CRS的引发或延长有关的细胞因子或趋化因子的基因中。CAR-T或其他免疫效应细胞中细胞因子或趋化因子基因的破坏或消融防止所述特定细胞因子或趋化因子引起CRS。这一基因的一个实例是GMCSF，但是也可以如本文所述的这种或类似的方式破坏参与引起或延长CRS的其他基因。GMCSF基因的破坏至少描述于Sachdeva等(J Biol Chem 294(14):5430-5437,2019)中并且制备和测试插入GM-CSF基因的CAR-T细胞的描述在下文提供。简单来说，可对TALEN或其他基因编辑酶进行设计或工程改造，以靶向CAR-T细胞中的选定细胞因子或趋化因子基因，并通过本领域已知的方法监测基因的表达。据报道，CAR-T细胞的细胞因子或趋化因子基因的表达和分泌显著减少，这意味着CRS的发生将减少。另外，发现该方法同时维持CAR-T细胞的增殖能力和抗肿瘤活性，如通过transwell测定和连续杀伤测定所评估的。
除了使用基因编辑使诸如GM-CSF的基因缺失之外，还可使用导致或促进CRS的细胞因子或趋化因子的抗体。例如，可向接受CAR-T疗法的患者或受试者施用识别GM-CSF蛋白的抗体。这种实践在本领域中是已知的，具体地是使用IL-6R拮抗剂托珠单抗(tocilizumab)减少由IL-6信号传导导致的CRS，但是在临床医生认为适当时，可使用识别细胞因子或趋化因子的其他抗体或拮抗剂，或其受体的拮抗剂。适当的抗体将与循环细胞因子或趋化因子结合，并且拮抗剂将与细胞因子或趋化因子的天然受体结合，从而在受试者中阻止下游促CRS活性。在一些情况下，这两种方法都可在受试者中使用，即，将CAR插入细胞因子或趋化因子的基因中以使该基因失活，并且还向受试者施用针对相同细胞因子或趋化因子的抗体。已显示这种方法是有效的，同时不对体内或体外CAR-T细胞活性产生不利影响(Sterner等,“GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome andneuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts,”Blood 133:697-709,2019)。
实施例12-通过将选择性标志物插入基因编辑的基因座中来制备和测试不能诱发CRS的基因组编辑的CAR-T细胞的方法
如果执行体内CRS实验，则在SCID-Beige小鼠(包含荧光素酶的3e6 Raji)中注射肿瘤。这应在将CAR-T输注到小鼠中之前3周完成。
可采取以下步骤来提供基因组编辑的CRS抗性CAR-T细胞，其中CAR由本文公开的具有选择性标志物的基因编辑的基因座表达。基于编码内部或分泌蛋白的基因的缺失来选择和纯化经编辑的细胞是不可能的，因此需要选择性标志物，以富集这一基因修饰。此实施例描述了CD19CARTΔGMCSFΔCD3ε细胞的制备，其中GM-CSF的缺失减轻CRS的风险并且CD3ε的缺失防止TCR信号传导和移植物抗宿主疾病(GVHD)。如本领域技术人员将认识到的，尽管可能导致不同的效率，但是某些步骤可顺序进行或不按下面列出的顺序进行。
步骤1：T细胞激活(第0天)
使用Miltenyi人泛T分离试剂盒从白细胞分离术腔室中纯化T细胞。重悬在培养基中。对细胞计数。确定获得3:1的珠粒:细胞比所需的人T细胞活化CD3/CD28珠粒的数目。用T细胞培养基洗涤珠粒2x。将细胞以1.256个细胞/mL稀释于hXcyte培养基中。添加人T细胞活化CD3/CD28珠粒。将4mL/孔的1.256个细胞/mL溶液等分到6孔板中。在37℃下孵育细胞。
步骤2：CRISPR(第2天)
通常使靶基因缺失并且将CAR插入基因编辑的基因座中。可以使用供体模板，使用同源定向修复来修复DNA双链断裂，以修复断裂并将期望序列插入编辑的基因座中。可使用Cas9 mRNA和针对靶标的gRNA，通过电穿孔实现靶标缺失。供体模板可以是DNA质粒，或双链线性DNA，或与用Cas9/gRNA电穿孔的双链断裂周围的DNA具有同源性的单链线性DNA。在此实施例中，同源臂与由gRNA GM-CSF诱导的双链断裂的任一侧对齐。另外，诸如AAV的病毒载体可用作供体模板的来源。然而，可以使用其他技术来诱导DNA双链断裂。这些包括其他基因组编辑技术，诸如TALEN和大范围核酸酶。
GM-CSF和CD3ε的gRNA的序列如下：
hGMCSF gRNA：5’_2′OMe(U(ps)A(ps)C(ps))UCAGGUUCAGGAGACGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC2′OMe(U(ps)U(ps)U(ps)U_3’(SEQ ID NO:50)
CD3εgRNA：5’_2′OMe(A(ps)G(ps)G(ps))GCAUGUCAAUAUUACUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC2′OMe(U(ps)U(ps)U(ps)U 3’(SEQ ID NO:47)
使用核转染仪4D进行核转染：
对于每管15μg cas9 mRNA，使用20μg的各gRNA(GGM-CSF和gCD3ε)，如上(实施例6)所述执行核转染方案。
步骤3：用包含HDR修复构建体的AAV载体转导T细胞，以将CAR和选择性标志物引入GM-CSF基因座中
在序列表中提供了本文所述的载体组分的序列，诸如包括但不限于SEQ ID NO:3048-3064。例如，在用1x104与1x106之间的MOI进行电穿孔后2-4h，将重组AAV6供体载体(图3，包含ITR-右同源臂(SEQ ID NO:51)、EF1a启动子(SEQ ID NO:52)、CAR19 p2a trCD34(SEQ ID NO:53)、左同源臂(SEQ ID NO:54)、ITR(SEQ ID NO:55))添加到细胞培养物中。
步骤4：评估CRISPR活性和Td效率(第10天)
从每个样品中取出5x105个细胞，并通过流式细胞术进行分析。用RB洗涤样品。添加3μl抗CD34 PE抗体(这检测TrCD34标签在GM-CSF基因座中的插入)。添加5μl CD3 APC和2μl抗FAB BV421(检测CAR转导)。洗涤。执行流式细胞术。细胞应是CD3ε阴性、CD34阳性和FAB+的。收获T细胞(第11天)。
CAR-T细胞的纯化。可以使用TCRa/b阴性选择除去TCR阳性细胞来纯化TCR阴性细胞。可以在Miltenyi Automacs上使用CD34阳性选择来富集GM-CSF缺失的细胞。这富集GM-SCF-细胞并除去TCR+细胞。
步骤5：评估体内CAR-T活性
每只小鼠I.P.注射3x107个CAR-T。评估血清细胞因子水平。(第12天、第13天、第14天)使用Luminex多重细胞因子特征谱测定测量血清细胞因子水平，以检查CRS相关细胞因子的升高。执行针对靶细胞(Raji)的4h铬释放测定，以评估体外活性(第11天)。
实施例13-在EGFP整合到受CD3e启动子控制的Jurkats的CD3e基因座中时，确认GFP表达
可使用以下方法细节将GFP直接插入Jurkat细胞系的CD3e基因座中。
几天前：用PST1消化质粒(图4)。消化后产生两个片段(3.5kb和2.6kb)。使用凝胶提取试剂盒(gel extraction kit)纯化，并乙醇沉淀。以500ng/μl重悬。这产生下表中的供体模板‘DNA’
制备并滴定AAV。AAV的序列在图5中示出并提供于SEQ ID NO:__-__中。这产生下表中的供体模板‘AAV’。
供体模板‘质粒’在下表中示出。
第0天：
收获jurkats并计数。将细胞以100g自旋离心10分钟。将细胞转移至1.5m微量离心管中并在PBS中洗涤。将细胞以100xg自旋离心10分钟。重悬在预热的缓冲液SE中。向包含gRNA/Cas9的管中添加100μl。使用Jurkat程序在4D上转移到核比色杯(nucleocuvette)中并电击(zap)。转移到6孔板中2ml相应培养基中的预热培养基中。送回培养箱并扩增4天。
表14.
第4天：针对GFP和CD3 APC对细胞进行FACS。通过GFP荧光评估丧失CD3并整合AAV-GFP供体的编辑效率。
实施例14-通过将CAR插入CD3e基因座中来制备和测试基因组编辑的CAR-T细胞的方法
可采取以下步骤来提供基因组编辑的CAR-T细胞，其中car由本文公开的基因编辑的基因座(CAR-T)表达。此实施例描述了CD7CARTΔCD7ΔCD3ε细胞的制备。如本领域技术人员将认识到的，尽管可能导致不同的效率，但是某些步骤可顺序进行或不按下面列出的顺序进行。
步骤1：T细胞激活(第0天)
使用Miltenyi人泛T分离试剂盒从白细胞分离术腔室中纯化T细胞。重悬在培养基中。对细胞计数。确定获得3:1的珠粒:细胞比所需的人T细胞活化CD3/CD28珠粒的数目。用T细胞培养基洗涤珠粒2x。将细胞以1.256个细胞/mL稀释于hXcyte培养基中。添加人T细胞活化CD3/CD28珠粒。将4mL/孔的1.256个细胞/mL溶液等分到6孔板中。在37℃下孵育细胞。
步骤2：CRISPR(第2天)
通常使靶基因缺失并且将CAR插入基因编辑的基因座中。可以使用供体模板，使用同源定向修复来修复DNA双链断裂，以修复断裂并将期望序列插入编辑的基因座中。可使用Cas9 mRNA和针对靶标的gRNA，通过电穿孔实现靶标缺失。供体模板可以是DNA质粒，或双链线性DNA，或与用Cas9/gRNA电穿孔的双链断裂周围的DNA具有同源性的单链线性DNA。另外，诸如AAV的病毒载体可用作供体模板的来源。然而，可以使用其他技术诱导DNA双链断裂。这些包括其他基因组编辑技术，诸如TALEN和大范围核酸酶。
使用核转染仪4D进行核转染：
对于每管15μg Cas9，使用20μg的各gRNA(gCD7和gCD3)，如上(实施例6)所述执行核转染方案。
步骤3：用包含HDR修复构建体的AAV载体转导T细胞
在以1x104与1x106之间的MOI进行电穿孔后2-4h，将重组AAV6(或其他AAV血清型)供体载体添加到细胞培养物中。
步骤4：评估CRISPR活性和Td效率(第10天)
从每个样品中取出5x105个细胞，并通过流式细胞术进行分析。用RB洗涤样品。添加3μl的抗CD34 PE抗体(这检测CAR，因为该构建体包含人截短的CD34)。添加5μl的CD3 APC和2μl的CD7 BV421。洗涤。执行流式细胞术。细胞应是CD3ε阴性、CD7阴性和CD34阳性的。收获T细胞(第11天)。
CAR-T细胞的纯化。在Miltenyi Automacs上使用CD34+细胞的阳性选择，可以在单个步骤中纯化CD34+(CAR+)和TCR阴性的细胞。这富集CAR+细胞，并除去TCR+细胞(因为CAR插入破坏TCR信号传导)。
步骤5：评估体内CAR-T活性
如果执行体内成像实验(第7天)，则在NSG小鼠中注射肿瘤(5x105MOLT3或HH：包含荧光素酶)。
使用生物发光成像对小鼠的肿瘤负荷进行成像。通过尾静脉向每只小鼠I.V.注射2x106个CD34+CAR-T细胞，或执行针对靶细胞(MOLT3或HH)的4h铬释放测定(第11天)。本领域技术人员应理解，在指定的时间框架内可能存在一定的灵活性。
实施例15-使用shRNA实现的细胞因子/趋化因子基因沉默
与siRNA相似，短发夹RNA可以用于敲低或消除免疫效应细胞中细胞因子/趋化因子/转录因子基因的表达。
Cherkassky等(“Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpointblockade resist tumor-mediated inhibition,”J Clin Investig 2016；126:3130–3144)报道了使用shRNA敲低CD28间皮素特异性CAR-T细胞中免疫检查点PD-1的表达，其在抗原刺激时表现出增强的增殖功能、加强的细胞毒性和增强的细胞因子分泌。另外，已经针对在CD19阳性B细胞淋巴瘤中的使用测试了具有PD-1shRNA慢病毒盒的CD19特异性CAR。表15和表16提供了有用的shRNA及其序列的列表。
表15.用于使细胞因子/趋化因子基因沉默以降低CRS发病率的5’至3’(正向)shRNA序列
表16.用于使细胞因子/趋化因子基因沉默以降低CRS发病率的3’至5’(反向)shRNA序列
实施例16-使用蛋白表达阻断剂(PEBL)制备和测试缺乏特定细胞因子表达的细胞的方法-CAR19-GM-CSF PEBL
如果执行体内CRS实验，则在SCID-Beige小鼠(包含荧光素酶的3e6 Raji)中注射肿瘤。这应在将CAR-T输注到小鼠中之前3周完成。
可采取以下步骤提供CRS抗性。由于细胞因子是分泌蛋白，因此需要选择性标志物来富集此基因修饰。本实施例描述了细胞CAR19-GM-CSF PEBL的制备，其中GM-CSF分泌的阻滞减轻CRS的风险。如本领域技术人员将认识到的，尽管可能导致不同的效率，但是某些步骤可顺序进行或不按下面列出的顺序进行。
步骤1：T细胞激活(第0天)
使用Miltenyi人泛T分离试剂盒从白细胞分离术腔室中纯化T细胞。重悬在培养基中。对细胞计数。确定获得3:1的珠粒:细胞比所需的人T细胞活化CD3/CD28珠粒的数目。用T细胞培养基洗涤珠粒2x。将细胞以1.256个细胞/mL稀释于hXcyte培养基中。添加人T细胞活化CD3/CD28珠粒。将4mL/孔的1.256个细胞/mL溶液等分到6孔板中。在37℃下孵育。
步骤2：用PEBL CAR转导T细胞(第1天)
用与抗GM-CSF PEBL组合的靶向(即，识别)一种或多种抗原或蛋白质靶标的CAR，例如包含靶向CD19的CAR构建体的慢病毒转导T细胞。来自多顺反子载体的表达是优选的，从而允许CD34表达以标记CAR和PEBL表达。但是，可以使用单独表达CAR和PEBL的相同病毒载体，或通过包含CAR和PEBL的单独载体的独立转导来实现表达。可使用任何其他合适的转导方法，例如，AAV、逆转录病毒等，或通过使用同源定向修复和包含构建体的供体载体将CAR PEBL复合物直接插入基因组的靶向位置。
步骤3：评估Td效率(第10天)
从每个样品中取出5x105个细胞，并通过流式细胞术进行分析。用RB洗涤样品。添加3μL抗CD34 PE抗体。添加5μL CD3 APC和2μL抗FAB BV421(检测CAR转导)。洗涤。执行流式细胞术。细胞应为CD34阳性的，表明了来自多顺反子载体的CAR和PEBL表达。收获T细胞(第11天)。
CAR-T细胞的纯化。可以在Miltenyi Automacs上使用CD34阳性选择来富集CAR+(CD34+)和缺乏GC-CSF(PEBL+)的细胞。这富集了GC-CSF受抑制的细胞，并富集了CAR+细胞。
步骤4：评估CAR-T活性
每只小鼠I.P.注射3x107个CAR-T细胞。评估血清细胞因子水平。(第12天、第13天、第14天)使用Luminex多重特征谱测定测量血清细胞因子水平，以检查CRS相关细胞因子的升高。执行针对靶细胞(Raji)的4小时铬释放测定，以评估体外活性(第11天)。
靶向GM-CSF的PEBL构建体提供于图6以及表17和18中。
实施例17-用于测试CART19中缺失GM-CSF后诱发CRS的功效的体外CRS测定
细胞系：使用CD19阳性B-ALL细胞系RAMOS在体外测定中评估CRS。在测定之前，使用慢病毒转导，用GFP稳定转染RAMOS细胞，并在RPMI+10％FBS+青霉素/链霉素(Pen/Strep)中培养。
正常供体单核细胞和T细胞的分离：从正常健康人供体中分离出原代人T细胞和单核细胞。使用CD4+CD8+选择(Miltenyi Biotec)从PBMC中分离T细胞，并根据制造商方案使用Miltenyi biotec经典单核细胞分离珠粒(Miltenyi biotec classical MonocyteIsolation bead)分离单核细胞。
T细胞培养和CAR-T基因编辑：随后将T细胞以1x106个细胞/mL的浓度重悬于补充有50U/mL IL-2和10ng/ml IL-15的Xcyte培养基中，并存在抗CD3/CD28珠粒(珠粒与细胞的比例为3:1)。起始刺激后二十四小时，在聚凝胺存在下(终浓度6μg/ml)，用编码CD19CAR构建体的慢病毒载体转染T细胞。在第2天除去刺激珠粒。将CART19细胞以4×106个T细胞悬浮，使用核转染仪4D、程序EO-115，在具有15μg spCas9 mRNA(Trilink CA.)和20μg GM-CSFgRNA(Trilink)的100μl缓冲液P3中电穿孔。对照CAR19 T细胞在不存在GM-CSF gRNA的情况下电穿孔。随后使用流式细胞术在第6天评估T细胞的CD34(CAR-T的双顺反子标志物)和细胞内GM-CSF表达，之后进行共培养测定。
单核细胞谱系细胞的产生：为了产生iDC，将单核细胞(1×106)铺板在6mL补充有0.1mmol/L MEM非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素(Life Technologies)和10％胎牛血清(cR10)的RPMI 1640中。随后在cR10中补充0.2μg/mL人IL-4(Peptotec)和0.2μg/mL GM-CSF(Peptotec)。
对于巨噬细胞和活化巨噬细胞的产生，在cR10中补充10％人A/B血清代替胎牛血清(hR10)。对于活化巨噬细胞，在hR10培养基中补充30ng/ml的LPS。在第4天，补加细胞因子和LPS。在分离后第6天，使用2mmol/L EDTA收获巨噬细胞、活化巨噬细胞和iDC(未成熟的树突状细胞)。二十四小时后，用2mmol/L EDTA收获细胞，并用CD45、CD80和CD86染色，以确认未成熟DC和成熟DC分化。
共培养测定：将CAR-T细胞按以下比例在200ul/96孔中合并：12.5K UCART-19(存在或不存在GM-CSF KO)、靶标、50K Ramos细胞(CD19+)和单核细胞衍生细胞、1K iDC或5K巨噬细胞或5K活化巨噬细胞。
随后在37℃下孵育共培养物，并在24h和48h时收集100ul测定上清液用于细胞因子分析。
细胞因子水平的测量
使用IL-6ELISA板(R&D systems)由培养上清液确定细胞因子浓度。在分析之前，将上清液在4℃下以300g离心10分钟，并随后以1:10稀释于测定校准稀释液中。使用标准产品方案进行测量。
缺乏GM-CSF的CART19在不同的单核细胞谱系中诱导显著较低的il-6表达。图8和10
实施例18-用于测试T细胞中缺失GM-CSF后诱发CRS的功效的体外CRS测定
正常供体单核细胞和T细胞的分离：从正常健康人供体中分离出原代人T细胞和单核细胞。使用CD4+CD8+选择(Miltenyi Biotec)从PBMC中分离T细胞，并根据制造商方案使用Miltenyi Biotec经典单核细胞分离珠粒分离单核细胞。
T细胞培养和基因编辑：随后将T细胞以106个细胞/mL的浓度重悬于补充有50U/mLIL-2和10ng/ml IL-15的Xcyte培养基中，并存在抗CD3/CD28珠粒(珠粒与细胞的比例为3:1)(Life Technologies，目录号111.32D)。起始刺激后二十四小时。在第2天除去刺激珠粒。将4×106个T细胞使用核转染仪4D、程序EO-115，在具有15μg spCas9 mRNA(Trilink CA.)和20μg TRAC gRNA(Trilink)的100μl缓冲液P3中电穿孔。对照CAR19 T细胞在不存在GM-CSF gRNA的情况下电穿孔。随后在第6天使用流式细胞术评估共培养测定之前T细胞的GM-CSF表达。
单核细胞谱系细胞的产生：为了产生iDC，将单核细胞(1×106)铺板在6mL补充有0.1mmol/L MEM非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素(Life Technologies)和10％胎牛血清(cR10)的RPMI 1640中。随后在cR10中补充0.2μg/mL人IL-4(Peptotec)和0.2μg/mL GM-CSF(Peptotec)。在第4天，补加细胞因子和LPS。在分离后第6天，使用2mmol/L EDTA收获iDC(未成熟的树突状细胞)。
共培养测定：将T细胞按以下比例在200ul/96孔中合并：12.5K T细胞(存在或不存在GM-CSF KO)、50K抗CD3/CD28珠粒和1K iDC共培养物，随后在37℃孵育，并在24h和48h时收集100ul测定上清液用于细胞因子分析。
细胞因子水平的测量：使用IL-6ELISA板(R&D systems)由培养上清液确定细胞因子浓度。在分析之前，将上清液在4℃下以300xg离心10分钟，并随后以1:10稀释于测定校准稀释液中。使用标准产品方案进行测量。
相对于未编辑的T细胞，GM-CSF的缺失使IL-6的产生在24h时减少>3倍(图7和8)并且在48h时减少>4倍(图9和10)。
缺乏GM-CSF的T细胞在不同的单核细胞谱系中诱导显著较低的IL-6表达。
实施例19-通过将选择性标志物插入基因编辑的基因座中来制备和测试不能诱发CRS的基因组编辑的CAR-T细胞的方法
如果执行体内CRS实验，则在NSG小鼠中注射原代B-ALL(2x106)。这应在将CAR-T输注到小鼠中之前3周完成。
可采取以下步骤提供基因组编辑的CRS抗性CAR-T细胞。本实施例描述了CD19CARTΔGMCSFΔCD3ε突变IL-7R T细胞的制备，其中GM-CSF的缺失减轻CRS的风险，CD3e的缺失防止TCR信号传导和GvHD并且突变IL-7R增强CAR-T的增殖，使其足以在此模型中诱发CRS。编码突变的组成型活性IL-7R序列的序列可见于表19或在本领域中可存在。如本领域技术人员将认识到的，尽管可能导致不同的效率，但是某些步骤可顺序进行或不按下面列出的顺序进行。
步骤1：T细胞激活(第0天)
使用Miltenyi人泛T分离试剂盒从白细胞分离术腔室中纯化T细胞。重悬在培养基中。对细胞计数。确定获得3:1的珠粒:细胞比所需的人T细胞活化CD3/CD28珠粒的数目。用T细胞培养基洗涤珠粒2x。将细胞以1.256个细胞/mL稀释于hXcyte培养基中。添加人T细胞活化CD3/CD28珠粒。将4mL/孔的1.256个细胞/mL溶液等分到6孔板中。在37℃下孵育细胞。
步骤2：T细胞转导(第1天)
然后可用靶向(即，识别)一个或多个靶标的一种或多种CAR，例如用包含CAR构建体的慢病毒，转导CAR-T细胞。可使用任何其他合适的转导方法。
步骤3：CRISPR(第2天)
在CRS抗性CAR-T细胞中，可使细胞因子/趋化因子/转录因子基因或转录因子缺失，以防止分泌诱导髓样细胞分泌细胞因子的因子。可使用Cas9 mRNA和针对靶标的gRNA，通过电穿孔实现缺失。然而，可以使用其他技术抑制靶标的表达。这些包括其他基因组编辑技术，诸如TALEN、RNA干扰，以及引发抗原的内部结合以防止细胞表面表达。可使用的gRNA的实例包括表8-10中示出的那些，以及本领域已知的其他实例。
将细胞收获、分离并纯化，例如使用与细胞特异性蛋白结合的标记抗体包被的磁珠(可购自，例如，Miltenyi Biotec)进行磁性选择。对于T细胞，可以使用抗CD3/CD28珠粒。其他纯化技术是本领域已知的并且可以使用。
方案-使用核转染仪4D进行核转染：
对于每管15μg Cas9 mRNA，使用20μg的各gRNA(GGM-CSF和gCD3ε)，如上(实施例6)所述执行核转染方案。
步骤4：评估CRISPR活性和Td效率(第10天)
从每个样品中取出5x105个细胞，并通过流式细胞术进行分析。用RB洗涤样品。添加5μl CD3 APC和2μl抗FAB BV421(检测CAR转导)。洗涤。执行流式细胞术。细胞应是CD3ε阴性、CD34阳性和FAB+的。收获T细胞(第11天)。
CAR-T细胞的纯化。可以使用TCRa/b阴性选择除去TCR阳性细胞来纯化TCR阴性细胞。
步骤5：评估体内CAR-T活性
每只小鼠I.V.注射5x106个CAR-T。评估血清细胞因子水平(第+1、+2、+3、+4、+5、+10、+15天)。使用Luminex多重细胞因子特征谱测定测量血清细胞因子水平，以检查CRS相关细胞因子的升高。执行针对靶细胞(Raji)的4h铬释放测定，以评估体外活性(第11天)。使用血液的流式细胞术检测hCD45、CD19+细胞来监测肿瘤清除的功效。
下文提供了用于UCART19的T细胞CRISPR和CAR-T转导的改进的gRNA方案。
第0天-T细胞激活。
使用Miltenyi人泛T分离试剂盒从白细胞分离术腔室中纯化T细胞。重悬在培养基中。对细胞计数。确定获得3:1的珠粒:细胞比所需的人T细胞活化CD3/CD28珠粒的数目。用T细胞培养基洗涤珠粒2x。将细胞以1.256个细胞/mL稀释于hXcyte培养基中。添加人T细胞活化CD3/CD28珠粒。
然后可用靶向(即，识别)一个或多个靶标的一种或多种CAR，例如用包含CAR构建体的慢病毒，转导T细胞。可使用任何其他合适的转导方法。
第2天：每个反应使用4x106个细胞。程序设定了EO-115-100μl转染体积，并将全部补充剂添加到NucleofectorTM Solution P3中。通过用期望体积的推荐培养基(在6孔板中2ml)填充适当数量的孔并在加湿的37℃/5％CO2培养箱中预孵育/平衡板来制备细胞培养板。以磁性方式除去珠粒(两次，以确保完全除去)，然后对细胞计数并确定细胞密度。将所需数量的细胞在室温下以90xg离心10分钟，完全除去上清液。然后将细胞重悬于PBS(1ml)中，并转移至微量离心管中，并将所需数量的细胞在室温下以90xg离心10分钟。完全除去上清液，并且将细胞沉淀物小心地重悬于完全室温的4D NucleofectorTM Solution P3中，每100μl 4x106)。将20μg gRNA(gGM-CSF和gTRAC)添加到每个管的15μg Cas9 mRNA中。然后，将100μl细胞添加到每个管的Cas9/gRNA中，轻轻混合并将所有物质转移到NucleocuvetteTM中。轻敲比色杯以除去气泡。使用程序(Human T cell stim EO-115)进行电穿孔。运行完成后，使用专用工具将NucleocuvetteTM从固定器的容器中小心地取出。细胞用预热的培养基重悬。然后从目标孔中取出培养基，添加到比色杯中，然后轻轻地上下吸移两至三次。然后将其转移到孔中。用来自同一孔的培养基重复该过程，并在37℃下孵育。
第5天：评估CRISPR活性和Td效率。然后可通过从每个样品中取出5x105个细胞并通过流式细胞术进行分析来评估细胞样品的转导效率。对样品进行固定透化并通过FACS分析CD3、CD34和细胞内GM-CSF。
基因缺失的评估。
为了评估GM-CSF和TRAC的基因缺失，从每个样品中收获5x105个细胞，并提取其DNA。通过使用TIDE分析或深度测序对靶基因座进行靶测序来评估基因编辑效率。
第11天
对小鼠放血并测量肿瘤负荷。
CD3耗尽T细胞并注射到小鼠中。
向小鼠注射5x106个CAR+T细胞/小鼠。
小鼠组在下表20中提供：
表20.
然后在第0、1、2、3、5、7、14和21天对小鼠放血以进行FACS和血浆测量，称重并确定体温。
用于检测CAR-T细胞的特异性标志物的小组(panel)如下：
细胞因子分析和CRS评估使用Millipore luminex多重细胞因子分析进行评估。
用于制备如本文所述的载体的序列包括但不限于以下：
SEQ ID NO:3048-用于将CD34插入GM-CSF基因座的载体的左ITR
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
SEQ ID NO:3049-用于将CD34插入GM-CSF基因座的载体的左同源臂
cctgagatggatgcagccacagccctggagccagcctgaagctcctggtgtcttctgggggctacatataggagtgtagtccgaacctcagaggggcaaacctgctctgcagagggaatcaaggttcacataaccagagaggggagtcactcaggaaggtggctccagagccaagagtcagactctgggtcccgacttgacccagccacaccccctctgaagcttgctgagagtggctgcagtctcgctgctggatgtgcacatggtggtcattccctctgctcacaggggcaggggtccccccttactggactgaggttgccccctgctccaggtcctgggtgggagcccatgtgaactgtcagtggggcaggtctgtgagagctcccctcacactcaagtctctcacagtggccagagaagaggaaggctggagtcagaatgaggcaccagggcgggcatagcctgcccaaaggcccctgggattacaggcaggatggggagccctatctaagtgtctcccacgccccaccccagccattccaggccaggaagtccaaactgtgcccctcagagggagggggcagcctcaggcccattcagactgcccagggagggctggagagccctcaggaaggcgggtgggtgggctgtcggttcttggaaaggttcattaatgaaaacccccaagcctgaccacctagggaaaaggctcaccgttcccatgtgtggctgataagggccaggagattccacagttcaggtagttcccccgcctccctggcattttgtggtcaccattaatcatttcctctgtgtatttaagagctcttttgccagtgagcccaGTACACAGAGAGAAAGGCTAAAGTTCTCTGGAGGATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCC
SEQ ID NO:3050-用于将CD34插入GM-CSF基因座的载体的EFS启动子
GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGATCCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGG
SEQ ID NO:3051-用于将CD34插入GM-CSF基因座的载体的trCD34
atgccgcggggctggaccgcgctttgcttgctgagtttgctgccttctgggttcatgagtcttgacaacaacggtactgctaccccagagttacctacccagggaacattttcaaatgtttctacaaatgtatcctaccaagaaactacaacacctagtacccttggaagtaccagcctgcaccctgtgtctcaacatggcaatgaggccacaacaaacatcacagaaacgacagtcaaattcacatctacctctgtgataacctcagtttatggaaacacaaactcttctgtccagtcacagacctctgtaatcagcacagtgttcaccaccccagccaacgtttcaactccagagacaaccttgaagcctagcctgtcacctggaaatgtttcagacctttcaaccactagcactagccttgcaacatctcccactaaaccctatacatcatcttctcctatcctaagtgacatcaaggcagaaatcaaatgttcaggcatcagagaagtgaaattgactcagggcatctgcctggagcaaaataagacctccagctgtgcggagtttaagaaggacaggggagagggcctggcccgagtgctgtgtggggaggagcaggctgatgctgatgctggggcccaggtatgctccctgctccttgcccagtctgaggtgaggcctcagtgtctactgctggtcttggccaacagaacagaaatttccagcaaactccaacttatgaaaaagcaccaatctgacctgaaaaagctggggatcctagatttcactgagcaagatgttgcaagccaccagagctattcccaaaagaccctgattgcactggtcacctcgggagccctgctggctgtcttgggcatcactggctatttcctgatgaatcgccgcagctggagccccatttaa
SEQ ID NO:3052-用于将CD34插入GM-CSF基因座的载体的hGMB Poly A
ACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGA
SEQ ID NO:3053-用于将CD34插入GM-CSF基因座的载体的RHA
CGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGgtaagtgagagaatgtgggcctgtgcctaggccacccagctggcccctgactggccacgcctgtcagcttgataacatgacattttccttttctacagAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGgtaagatgcttctctctgacatagctttccagaagcccctgccctggggtggaggtggggactccattttagatggcaccacacagggttgtccactttctctccagtcagctggctgcaggaggagggggtagcaactgg
gtgctcaagaggctgctggccgtgcccctatggcagtcacatgagctcctttatcagctgagcggccatgggcagacctagcattcaatggccaggagtcaccaggggacaggtggtaaagtgggggtcacttcatgagacaggagctgtgggtttggggcgctcactgtgccccgagaccaagtcctgttgagacagtgctgactacagagaggcacagaggggtttcaggaacaacccttgcccacccagcaggtccaggtgaggccccacccccctctccctgaatgatggggtgagagtcacctccttccctaaggctgggctcctctccaggtgccgctgagggtggcctgggcggggcagtgagaagggcaggttcgtgcctgccatggacagggcagggtctatgactggacccagcctgtgcccctcccaagccctactcctgggggctgggggcagcagcaaaaaggagtggtggagagttcttgtaccactgtgggcacttggccactgctcaccgacgaacgacattttccacagGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGgtgagtgc
SEQ ID NO:51-用于将CD34插入GM-CSF基因座的载体的右ITR
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO:3054-用于将CD34插入GM-CSF基因座的载体的完整序列
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTcctgagatggatgcagccacagccctggagccagcctgaagctcctggtgtcttctgggggctacatataggagtgtagtccgaacctcagaggggcaaacctgctctgcagagggaatcaaggttcacataaccagagaggggagtcactcaggaaggtggctccagagccaagagtcagactctgggtcccgacttgacccagccacaccccctctgaagcttgctgagagtggctgcagtctcgctgctggatgtgcacatggtggtcattccctctgctcacaggggcaggggtccccccttactggactgaggttgccccctgctccaggtcctgggtgggagcccatgtgaactgtcagtggggcaggtctgtgagagctcccctcacactcaagtctctcacagtggccagagaagaggaaggctggagtcagaatgaggcaccagggcgggcatagcctgcccaaaggcccctgggattacaggcaggatggggagccctat
ctaagtgtctcccacgccccaccccagccattccaggccaggaagtccaaactgtgcccctcagagggagggggcagcctcaggcccattcagactgcccagggagggctggagagccctcaggaaggcgggtgggtgggctgtcggttcttggaaaggttcattaatgaaaacccccaagcctgaccacctagggaaaaggctcaccgttcccatgtgtggctgataagggccaggagattccacagttcaggtagttcccccgcctccctggcattttgtggtcaccattaatcatttcctctgtgtatttaagagctcttttgccagtgagcccaGTACACAGAGAGAAAGGCTAAAGTTCTCTGGAGGATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGATCCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGatgccgcggggctggaccgcgctttgcttgctgagtttgctgccttctgggttcatgagtcttgacaacaacggtactgctaccccagagttacctacccagggaacattttcaaatgtttctacaaatgtatcctaccaagaaactacaacacctagtacccttggaagtaccagcctgcaccctgtgtctcaacatggcaatgaggccacaacaaacatcacagaaacgacagtcaaattcacatctacctctgtgataacctcagtttatggaaacacaaactcttctgtccagtcacagacctctgtaatcagcacagtgttcaccaccccagccaacgtttcaactccagagacaaccttgaagcctagcctgtcacctggaaatgtttcagacctttcaaccactagcactagccttgcaacatctcccactaaaccctatacatcatcttctcctatcctaagtgacatcaaggcagaaatcaaatgttcaggcatcagagaagtgaaattgactcagggcatctgcctggagcaaaataagacctccagctgtgcggagtttaagaaggacaggggagagggcctggcccgagtgctgtgtggggaggagcaggctgatgctgatgctggggcccaggtatgctccctgctccttgcccagtctgaggtgaggcctcagtgtctactgctggtcttggccaacagaacagaaatttccagcaaactccaacttatgaaaaagcaccaatctgacctgaaaaagctggggatcctagatttcactgagcaagatgttgcaagccaccagagctattcccaaaagaccctgattgcactggtcacctcgggagccctgctggctgtcttgggcatcactggctatttcctgatgaatcgccgcagctggagccccatttaaACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGACGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGgtaagtgagagaatgtgggcctgtgcctaggccacccagctggcccctgactggccacgcctgtcagcttgataacatgacattttccttttctacagAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGgtaagatgcttctctctgacatagctttccagaagcccctgccctggggtggaggtggggactccattttagatggcaccacacagggttgtccactttctctccagtcagctggctgcaggaggagggggtagcaactgggtgctcaagaggctgctggccgtgcccctatggcagtcacatgagctcctttatcagctgagcggccatgggcagacctagcattcaatggccaggagtcaccaggggacaggtggtaaagtgggggtcacttcatgagacaggagctgtgggtttggggcgctcactgtgccccgagaccaagtcctgttgagacagtgctgactacagagaggcacagaggggtttcaggaacaacccttgcccacccagcaggtccaggtgaggccccacccccctctccctgaatgatggggtgagagtcacctccttccctaaggctgggctcctctccaggtgccgctgagggtggcctgggcggggcagtgagaagggcaggttcgtgcctgccatggacagggcagggtctatgactggacccagcctgtgcccctcccaagccctactcctgggggctgggggcagcagcaaaaaggagtggtggagagttcttgtaccactgtgggcacttggccactgctcaccgacgaacgacattttccacagGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGgtgagtgcAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO:3048-用于将GFP插入CD3ε基因座的供体构建体的左ITR
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
SEQ ID NO:3055-用于将GFP插入CD3ε基因座的供体构建体的克隆残粒(remnants)
GCGGCCGCATCGATTGaattc
SEQ ID NO:3056-用于将GFP插入CD3ε基因座的供体构建体的CD3左同源臂
AGGTAAGTCCACGAATCAGTGATTCAGTGGTGTGGAGAGCTTTATTTCTGAGAAGGCCAGTAGCGCTCCCTTCTGACAAGCAAATCTAAGACCTGGATGACAGATGACTTCCTGCATTTGGTTGGTTCTTTTGTCATTCATATCTATCTGTAATACAGTTCTGGCTAATTTAAGAGGATAAGCTTGAAGACCTCTGGAATTTTTCGGCTTTAGGACTTTAAGGCTTTCTGAGCTTCAGTAGATCTAGATCTAGGAGCTCATGCTGGTATATTCTGAATCCGATGTATCTGAGTTACATCTATGAGCTACTTAATAAATATATCTATGAGCTAAATCTCATAGGCTAAGCATGAACCTCACCTCCAAGACTCGGGGTTCCTAAATGGATGAGACCCTCTTT
GGGAAGTCTTGTGGGCAGTGTCTAATTCCACTAGAAAAGTTTTACCTACAATTTAAACTTAAACCATGATATTTTCTTACTGCTGTTTCCTTTTTTCATTTTCAGGTGGTATTACACAGACACGTGAGTTTATTGGTCTTTTATTTATGCCCTGTCTGAGGATGCAGATTGGTGGGTAGATGAGAAGGAACTGATTGAGAGAGATTAACCCCAAGAACTGATATCTTCCCAGCATTGCATTCTCAACTCCATTTTAGAAAGGTTCCAAATAGGGACTTCTGTGGGTTTTTCTTTACATCCATCTTACCCTTCCCAAGTCCCCATGTCCCTGCGTAAACCCTAAAGCCACCTCTCAAAAGGTTCTCTAGTTCCCTTCAAGGTTCTCTAGTTCCCTTCATTCCACATATCTCCTCTTCCACACCCTCTAGCCAGTAGAGCTCCCTTCTGACAAGCAAGTCTAAGATCTAGATGACAGATGACTTCCTGCATTTGGGTGGTTCTTTTGTCACTAATTTGCCTTTTCTAAAATTGTCCTGGTTTCTTCTGCCAATTTCCCTTCTTTCTCCCCAGCATATAAAGTCTCCATCTCTGGAACCACA
SEQ ID NO:3057-用于将GFP插入CD3ε基因座的供体构建体的CAR7
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagtgcaagtcagggcattagcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctattacacatcaagtttacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctgggacagattattctctcaccatcagcaacctggaacctgaagatattgccacttattattgtcagcagtatagcaagcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgtggtggtggtggttctggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaggtgcaactggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggggggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggactcactttcagtagctatgccatgtcttgggttcgccagactccagagaagaggctggagtgggtcgcatccattagtagtggtggtttcacctactatccagacagtgtgaagggccgattcaccatctccagagataatgccaggaacatcctgtatctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaagagacgaggtacgggggtacctcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtttcccctaggGCTAGCaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcCGGACCGATggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctgtttctgaagccatgccgcggggctggaccgcgctttgcttgctgagtttgctgccttctgggttcatgagtcttgacaacaacggtactgctaccccagagttacctacccagggaacattttcaaatgtttctacaaatgtatcctaccaagaaactacaacacctagtacccttggaagtaccagcctgcaccctgtgtctcaacatggcaatgaggccacaacaaacatcacagaaacgacagtcaaattcacatctacctctgtgataacctcagtttatggaaacacaaactcttctgtccagtcacagacctctgtaatcagcacagtgttcaccaccccagccaacgtttcaactccagagacaaccttgaagcctagcctgtcacctggaaatgtttcagacctttcaaccactagcactagccttgcaacatctcccactaaaccctatacatcatcttctcctatcctaagtgacatcaaggcagaaatcaaatgttcaggcatcagagaagtgaaattgactcagggcatctgcctggagcaaaataagacctccagctgtgcggagtttaagaaggacaggggagagggcctggcccgagtgctgtgtggggaggagcaggctgatgctgatgctggggcccaggtatgctccctgctccttgcccagtctgaggtgaggcctcagtgtctactgctggtcttggccaacagaacagaaatttccagcaaactccaacttatgaaaaagcaccaatctgacctgaaaaagctggggatcctagatttcactgagcaagatgttgcaagccaccagagctattcccaaaagaccctgattgcactggtcacctcgggagccctgctggctgtcttgggcatcactggctatttcctgatgaatcgccgcagctggagccccatttaa
SEQ ID NO:3058-用于插入CD3ε基因座的供体构建体的GFP
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
SEQ ID NO:3059-用于将GFP插入CD3ε基因座的供体构建体的hGMB poly A
ACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCAC
SEQ ID NO:3060-用于将GFP插入CD3ε基因座的供体构建体的CD3e右同源臂
aGTAtaatattgacatgccctcagtatcctggatctgaaatactatggcaacacaatgataaaaacataggcggtgatgaggatgataaaaacataggcagtgatgaggatcacctgtcactgaaggaattttcagaattggagcaaagtggttattatgtctgctaccccagaggaagcaaaccagaagatgcgaacttttatctctacctgagggcaagagtgtgtgagaactgcatggagatggatgtgatgtcggtggccacaattgtcatagtggacatctgcatcactgggggcttgctgctgctggtttactactggagcaagaatagaaaggccaaggccaagcctgtgacacgaggagcgggtgctggcggcaggcaaaggggacaaaacaaggagaggccaccacctgttcccaacccagactatgagcccatccggaaaggccagcgggacctgtattctggcctgaatcagagacgcatctgaccctctggagaacactgcctcccgctggcccaggtctcctctccagtccccctgcgactccctgtttcctgggctagtcttggaccccacgagagagaatcgttcctcagcctcatggtgaactcgcgccctccagcctgatcccccgctccctcctccctgccttctctgctggtacccagtcctaaaatattgctgcttcctcttcctttgaagcatcatcagtagtcacaccctcacagctggcctgccctcttgccaggatatttatttgtgctattcactcccttccctttggatgtaacttctccgttcagttccctccttttcttgcatgtaagttgtcccccatcccaaagtattccatctacttttctatcgccgtccccttttgcagccctctctggggatggactgggtaaatgttgacagaggccctgccccgttcacagatcctggccctgagccagccctgtgctcctccctcccccaacactccctaccaacc
SEQ ID NO:3061-用于将GFP插入CD3ε基因座的供体构建体的克隆残粒
GCGgacCGAGCGGCCGC
SEQ ID NO:3062-用于将GFP插入CD3ε基因座的供体构建体的右ITR
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO:3063-用于将GFP插入CD3ε基因座的供体构建体的克隆残粒
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCATCGATTGaattcAGGTAAGTCCACGAATCAGTGATTCAGTGGTGTGGAGAGCTTTATTTCTGAGAAGGCCAGTAGCGCTCCCTTCTGACAAGCAAATCTAAGACCTGGATGACAGATGACTTCCTGCATTTGGTTGGTTCTTTTGTCATTCATATCTATCTGTAATACAGTTCTGGCTAATTTAAGAGGATAAGCTTGAAGACCTCTGGAATTTTTCGGCTTTAGGACTTTAAGGCTTTCTGAGCTTCAGTAGATCTAGAT
CTAGGAGCTCATGCTGGTATATTCTGAATCCGATGTATCTGAGTTACATCTATGAGCTACTTAATAAATATATCTATGAGCTAAATCTCATAGGCTAAGCATGAACCTCACCTCCAAGACTCGGGGTTCCTAAATGGATGAGACCCTCTTTGGGAAGTCTTGTGGGCAGTGTCTAATTCCACTAGAAAAGTTTTACCTACAATTTAAACTTAAACCATGATATTTTCTTACTGCTGTTTCCTTTTTTCATTTTCAGGTGGTATTACACAGACACGTGAGTTTATTGGTCTTTTATTTATGCCCTGTCTGAGGATGCAGATTGGTGGGTAGATGAGAAGGAACTGATTGAGAGAGATTAACCCCAAGAACTGATATCTTCCCAGCATTGCATTCTCAACTC
CATTTTAGAAAGGTTCCAAATAGGGACTTCTGTGGGTTTTTCTTTACATCCATCTTACCCTTCCCAAGTCCCCATGTCCCTGCGTAAACCCTAAAGCCACCTCTCAAAAGGTTCTCTAGTTCCCTTCAAGGTTCTCTAGTTCCCTTCATTCCACATATCTCCTCTTCCACACCCTCTAGCCAGTAGAGCTCCCTTCTGACAAGCAAGTCTAAGATCTAGATGACAGATGACTTCCTGCATTTGGGTGGTTCTTTTGTCACTAATTTGCCTTTTCTAAAATTGTCCTGGTTTCTTCTGCCAATTTCCCTTCTTTCTCCCCAGCATATAAAGTCTCCATCTCTGGAACCACAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACaGTAtaatattgacatgccctcagtatcctggatctgaaatactatggcaacacaatgataaaaacataggcggtgatgaggatgataaaaacataggcagtgatgaggatcacctgtcactgaaggaattttcagaattggagcaaagtggttattatgtctgctaccccagaggaagcaaaccagaagatgcgaacttttatctctacctgagggcaagagtgtgtgagaactgcatggagatggatgtgatgtcggtggccacaattgtcatagtggacatctgcatcactgggggcttgctgctgctggtttactactggagcaagaatagaaaggccaaggccaagcctgtgacacgaggagcgggtgctggcggcaggcaaaggggacaaaacaaggagaggccaccacctgttcccaacccagactatgagcccatccggaaaggccagcgggacctgtattctggcctgaatcagagacgcatctgaccctctggagaacactgcctcccgctggcccaggtctcctctccagtccccctgcgactccctgtttcctgggctagtcttggaccccacgagagagaatcgttcctcagcctcatggtgaactcgcgccctccagcctgatcccccgctccctcctccctgccttctctgctggtacccagtcctaaaatattgctgcttcctcttcctttgaagcatcatcagtagtcacaccctcacagctggcctgccctcttgccaggatatttatttgtgctattcactcccttccctttggatgtaacttctccgttcagttccctccttttcttgcatgtaagttgtcccccatcccaaagtattccatctacttttctatcgccgtccccttttgcagccctctctggggatggactgggtaaatgttgacagaggccctgccccgttcacagatcctggccctgagccagccctgtgctcctccctcccccaacactccctaccaaccGCGgacCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO:3064-用于将GFP插入CD3e基因座的载体的完整序列
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCATCGATTGaattcAGGTAAGTCCACGAATCAGTGATTCAGTGGTGTGGAGAGCTTTATTTCTGAGAAGGCCAGTAGCGCTCCCTTCTGACAAGCAAATCTAAGACCTGGATGACAGATGACTTCCTGCATTTGGTTGGTTCTTTTGTCATTCATATCTATCTGTAATACAGTTCTGGCTAATTTAAGAGGATAAGCTTGAAGACCTCTGGAATTTTTCGGCTTTAGGACTTTAAGGCTTTCTGAGCTTCAGTAGATCTAGAT
CTAGGAGCTCATGCTGGTATATTCTGAATCCGATGTATCTGAGTTACATCTATGAGCTACTTAATAAATATATCTATGAGCTAAATCTCATAGGCTAAGCATGAACCTCACCTCCAAGACTCGGGGTTCCTAAATGGATGAGACCCTCTTTGGGAAGTCTTGTGGGCAGTGTCTAATTCCACTAGAAAAGTTTTACCTACAATTTAAACTTAAACCATGATATTTTCTTACTGCTGTTTCCTTTTTTCATTTTCAGGTGGTATTACACAGACACGTGAGTTTATTGGTCTTTTATTTATGCCCTGTCTGAGGATGCAGATTGGTGGGTAGATGAGAAGGAACTGATTGAGAGAGATTAACCCCAAGAACTGATATCTTCCCAGCATTGCATTCTCAACTC
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本申请中引用的所有参考文献、专利或申请(美国或美国以外的)均据此通过引用并入，如同将其全部内容写入本文。在出现任何不一致的情况下，以本文字面上公开的内容为准。
从上文描述，本领域的技术人员可容易地探知本发明的必需特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明进行各种变化和修改以使其适于各种用法和条件。