阅读说明：本技术 去除和/或灭活重组人血小板生成因子原液中病毒的方法 (Method for removing and/or inactivating virus in recombinant human thrombopoietin stock solution ) 是由 钟正明 秦小强 王一凡 于 2019-09-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种用于去除和/或灭活重组人血小板生成因子原液中病毒的方法,所述方法包括：将重组人血小板生成因子的发酵液使用S/D法灭活病毒；和使用纳米膜过滤纯化后的发酵液以除去病毒。根据本发明所述的方法,其包括以下步骤：1)培养rh-TPO工程细胞,获得发酵液；2)将发酵液使用S/D法灭活病毒；3)纯化使用S/D法灭活后的发酵液；4)使用纳米膜过滤纯化后的发酵液,即得。使用本发明的方法不仅能够去除大量的内源及外源脂胞膜病毒,还可以去除非脂胞膜病毒。使用本发明的方法,不仅对较为复杂的糖修饰细胞因子类蛋白灭活有效,而且能够将重组人血小板生成因子的蛋白活性保持在较高的水平,不影响成品的质量。(The invention provides a method for removing and/or inactivating viruses in a recombinant human thrombopoietin stock solution, which comprises the following steps: inactivating virus by using a fermentation liquor of the recombinant human thrombopoietic factor by using an S/D method; and filtering the purified fermentation broth using a nanomembrane to remove viruses. The method according to the invention comprises the following steps: 1) culturing rh-TPO engineering cells to obtain fermentation liquor; 2) inactivating viruses of the fermentation liquor by using an S/D method; 3) purifying the fermentation liquor inactivated by an S/D method; 4) filtering the purified fermentation liquor by using a nano membrane to obtain the nano-composite. The method of the invention can remove not only a large amount of endogenous and exogenous lipid cell membrane viruses, but also non-lipid cell membrane viruses. The method of the invention is not only effective for inactivating more complex carbohydrate-modified cytokine-type proteins, but also can keep the protein activity of the recombinant human thrombopoietin at a higher level without affecting the quality of finished products.)

去除和/或灭活重组人血小板生成因子原液中病毒的方法

技术领域

本发明属于生物制剂领域，涉及一种去除和/或灭活重组人血小板生成因子原液中病毒的方法。

背景技术

上世纪50年代，Kelemen等发现并提出体内存在着一种能够刺激血液中血小板生成的体液因子，并命名为血小板生成因子(Thrombopoietin，TPO)，它对巨核细胞系统的发育和成熟有明显促进作用。重组人血小板生成因子(recombinant human thrombopoietin，rh-TPO)是含有332个氨基酸并且经CHO工程菌表达的重组糖蛋白，通过与其特异性受体Mpl结合而调节巨核细胞生长、分化、成熟并***形成有功能的血小板，用于治疗包括实体瘤及急性白血病放化疗后、骨髓移植、再障和其他骨髓功能不全及HIV等造成的血小板严重减少和特发性血小板减少性紫癜(ITP)。

在使用CHO工程菌制备重组人血小板生成因子的过程中，需要进行病毒灭活。现有的病毒灭活工艺在血液制品及单克隆抗体中主要有以下几种模式：

1、巴氏消毒法：该法适用于较为稳定的白蛋白灭活工艺，对HIV和肝炎病毒灭活是比较成熟的。

2、干热法(冻干制剂)：80℃加热72小时，可以灭活HCV、HBV、HIV和HAV等病毒，但应考虑制品的水分，含量对病毒灭活的影响。

3、低pH灭活孵放法：免疫球蛋白生产中的低pH(如pH＝4)可灭活几种脂胞膜病毒，灭活条件应考虑pH值，孵放时间、温度，溶液溶质等因素。

4、膜过滤方法：该法只用于滤膜的有效直径比病毒小的情况下过滤，该方法不能单独使用，需结合其它方法一起使用。

其中，以上第1、2、4的病毒灭活工艺主要适用于血液制剂，单克隆抗体主要适用于第3和第4方法结合使用。

目前，对于重组人血小板生成因子类产品，由于糖基化占比较高，占分子大小的30％左右，且相对于单克隆抗体而言，由于糖基化修饰位点和糖型较为复杂，蛋白不稳定等导致目前还没有较为成熟的病毒灭活方法。如，国内的rh-TPO产品主要有沈阳三生的特比奥，于2006年生产上市，鉴于之前法规及行业认知度，蛋白复杂性等条件限制，该产品未能进行潜在病毒的灭活和去除，已不符合现阶段要求。进一步地，现有技术中并未提及对糖基化复杂的，蛋白不稳定的细胞因子类产品进行潜在病毒的灭活及处理，对用药安全造成极大的风险及隐患。

因此，当前对用于去除和/或灭活重组人血小板生成因子原液中病毒的方法存在需求。

发明内容

基于现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于去除和/或灭活重组人血小板生成因子原液中病毒的方法。本发明提供的方法步骤简单，同时解决了使用传统方法无法去除的脂胞膜病毒和非脂胞膜病毒，如猪源型病毒、牛源型病毒等的问题，对重组人血小板生成因子的生产和使用具有重要的意义。

一方面，本发明提供了一种用于去除和/或灭活重组人血小板生成因子原液中病毒的方法，所述方法包括：

将重组人血小板生成因子(rh-TPO)的发酵液使用S/D法灭活病毒；和

使用纳米膜过滤纯化后的发酵液以除去病毒。

根据本发明所述的方法，其中，所述S/D法使用的试剂为磷酸三丁酯和曲拉通-100；

其中，所述磷酸三丁酯的工作浓度为0.3％±0.03％(v/v)，所述曲拉通-100的工作浓度为1％±0.1％(v/v)。

根据本发明所述的方法，其中，所述S/D法灭活的条件为：23～27℃下，使用S/D试剂处理至少1小时。

优选地，所述S/D法灭活的条件为：25℃下，使用S/D试剂处理4小时。

优选地，所述纳米膜过滤为使用Millipore公司的ViresolvePro除病毒过滤膜进行。

根据本发明所述的方法，其包括以下步骤：

1)培养重组人血小板生成因子(rh-TPO)的工程细胞，获得发酵液；

2)将发酵液使用S/D法灭活病毒；

3)纯化使用S/D法灭活后的发酵液；

4)使用纳米膜过滤纯化后的发酵液，即得。

根据本发明所述的方法，其中，在步骤3)中，所述纯化依次为阳离子层析、疏水层析和阴离子层析。

根据本发明所述的方法，其中，所述方法进一步包括除菌过滤和/或分装的步骤。

申请人发现，在制备重组人血小板生成因子原液中，使用传统工艺进行病毒灭活，无法去除脂胞膜和非脂胞膜病毒，如猪源型病毒、牛源型病毒等，极大的增加了患者的使用风险及用药安全，已不符合现在制药行业规范要求。因此，需要在制备过程中增加脂包膜病毒和非脂胞膜病毒灭活工艺，从而极大降低了因病毒灭活不彻底带来的巨大风险。发明人根据国内外相关单克隆抗体灭活工艺及血液制品灭活工艺，及相关法律法规要求，积极探索研究rH-TPO细胞因子类生产工艺中对潜在病毒的灭活方式，经过大量实验摸索，最终完成了细胞因子类较为复杂糖基化修饰，蛋白活性不稳定的病毒去除和灭活的空白领。使用本发明的方法不仅能够去除大量的内源及外源脂胞膜病毒，还可以去除非脂胞膜病毒，同时，能够较高的保持蛋白活性，最低的S/D灭活剂残留，对患者用药安全起到了巨大的作用。

本发明解决了重组细胞因子类产品生产工艺中对潜在病毒的灭活方式，经过大量实验摸索，最终完成了细胞因子类较为复杂糖基化修饰，蛋白活性不稳定的生产工艺中未能有效灭活病毒/去除病毒的空白领域，对今后细胞因子类产品生产工艺中病毒去除及灭活具有一定的指导作用。

与现有技术相比，本发明给的方法具有以下优点：

1.使用本发明的方法不仅能够去除大量的内源及外源脂胞膜病毒，还可以去除非脂胞膜病毒。

2.使用本发明的方法，不仅对较为复杂的糖修饰细胞因子类蛋白灭活有效，而且能够将重组人血小板生成因子的蛋白活性保持在较高的水平，不影响成品的质量。

3.使用本发明的方法，后续进行离子交换层析分离几乎可全部除去S/D残留物，使产品达到了对人体无害的标准要求，对患者用药安全起到了巨大的作用。

4.使用本发明的方法，，解决了细胞因子类产品无法灭活潜在病毒的空白，具有重要的生产和实践意义。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为根据本发明的实施例1中使用S/D法灭活后，rh-TPO原液的HPLC图谱；

图2为根据本发明的实施例1中使用S/D法灭活后，rh-TPO原液的SDS PAGE结果；

图3为根据本发明的对比例1中使用低pH孵放法灭活后，rh-TPO原液的SDS PAGE结果；

图4为根据本发明的对比例1中使用低pH孵放法灭活后，如方法1所示疏水层析下样经低pH灭活前的HPLC图谱；

图5为根据本发明的对比例1中使用低pH孵放法灭活后，如方法1所示疏水层析下样经低pH灭活后的HPLC图谱；

图6为根据本发明的对比例1中使用低pH孵放法灭活后，如方法2所示阴离子层析下样经低pH灭活前的HPLC图谱；

图7为根据本发明的对比例1中使用低pH孵放法灭活后，如方法2所示阴离子层析下样经低pH灭活后的HPLC图谱；

图8为根据本发明的对比例2中发酵液使用低pH孵放法灭活后，rh-TPO原液的SDSPAGE结果。

具体实施方式

实施例1使用本发明的方法灭活脂胞膜病毒

该实施例中，主要使用有机溶剂/去污剂混合物(S/D)破坏包膜病毒的脂膜，达到有效灭活脂包膜病毒的效果。

1.1实验方法

首先，本实施例中制备rh-TPO原液的步骤如下：

1)培养rh-TPO工程细胞；

2)发酵液依次经过阳离子层析、疏水层析、阴离子层析；

其中，阳离子层析使用复合型弱阳离子介质MMC Diamond进行；

疏水层析使用Butyl HP填料进行；

阴离子层析使用MixA Mustang离子交换填料进行；

3)除菌过滤和/或分装。

基于S/D试剂为有机试剂和去污剂为疏水性比较强的物质，所以S/D灭活不适合放在疏水层析工艺前，所以申请人研究了将S/D灭活放在疏水层析工艺和阴离子层析Mustang工艺之间或者发酵液步骤去试验。

方法1：使用0.3％磷酸三丁酯1％曲拉通-100灭活

将发酵液过疏水层析，取中试疏水层析下样50mL，加入150μL TNBP和0.5mLTriton X 100，使其最终的体积浓度分别0.3％和1％，搅拌均匀，灭活1h。溶液呈白色混浊液，用0.45μm膜过滤，溶液还是混浊。

方法2：0.3％磷酸三丁酯1％吐温80灭活

将发酵液过疏水层析，取中试疏水层析下样50mL，加入150μL磷酸三丁酯和0.5mL，吐温80，使其最终的体积浓度分别0.3％和1％，搅拌均匀，灭活1h。

对照3：空白不灭活

将方法1、方法2和对照3的样品过阴离子层析，过程：流速0.7mL/min A液平衡→上样→A液清洗3CV→11％B洗4CV→50％B洗脱5CV，并收集洗脱液。

1.2结果分析：

1.2.1 HPLC图谱上述两个方法和对照的HPLC实验结果如图1所示，其中图1为样品经过阴离子层析Mustang步骤后的图谱。

方法1：0.3％TNBP 1％Triton X 100灭活，洗脱收集体积6.4mL；

方法2：0.3％TNBP 1％Tween 80灭活，洗脱收集体积9.2mL；

对比3：空白不灭活，洗脱收集体积6.2mL。

从图中可以得知，方法1和对照3空白不灭活的样品在HPLC液相中出峰时间、峰面积及纯度具有极其相似性，方法1方案可行。

1.2.2 SDS PAGE结果：

上述两个方法和对照的SDS PAGE的结果如图2所示，其中电泳图中1-10分别表示为：1、对照3的上样液；2、对照3的流穿；3、对照3的洗脱液；4、方法1的上样液；5、方法1的流穿；6、方法1的洗脱液；7、方法2的上样液；8、方法2的流穿；9、方法2的洗脱液；10、标记-Marker；

从电泳图可以看出，

1)S/D法灭活对疏水层析下样无影响，rh-TPO条带无降解，

2)选用的S/D灭活条件：0.3％磷酸三丁酯1％曲拉通-100灭活1h，常温；实验图谱中可以看出，空白对照3的洗脱液和方法1(即使用0.3％磷酸三丁酯1％曲拉通-100)的SDAPAGE条带几乎一致，洗脱收集的体积基本一致；从SDS PAGE中还可以看出，方法1和对照3均无流穿，且洗脱的rh-TPO条带基本一样。而方法2，即采用0.3％磷酸三丁酯和吐温80灭活后，目的蛋白表现出收率偏低的结果。

所以，本发明方法采用的灭活条件为S/D灭活剂，即0.3％磷酸三丁酯1％曲拉通-100灭活1h，常温可适用于rh-TPO蛋白的灭活。

1.2.3 S/D灭活效果验证：

S/D灭活效果验证采用中检院指定的指示病毒，采用VSV(水疱性口炎病毒)/PRV(伪狂犬病毒)两种指示病毒对其灭活效果验证，通过对rh-TPO剂原液(20161118、20161119和20161220)S/D灭活结果，无论对PRV或者VSV，其灭活能力基本达到了4logTCID50/0.1mL以上，绝大多数灭活均质1小时可完全灭活。不难看出，使用本发明的S/D法灭活完全可以灭活脂胞膜病毒。

由于本实施例的目的是优化灭活步骤，发明人发现，将灭活脂胞膜病毒步骤位于纯化工艺的前端，可以通过阳离子层析和疏水层析去除所引入的杂质磷酸三丁酯和曲拉通-100。同时，相对应的层析填料也可以进一步去除一定的潜在病毒。因此，S/D法灭活脂胞膜病毒在细胞培养的发酵液中进行。

实施例2使用本发明的方法灭活非脂胞膜病毒

本实施例的目的是在去除脂胞膜病毒的基础上，增加纳米膜过滤的步骤，以去除非脂胞膜病毒，Pro系列纳滤膜是双层聚醚砜材质，可实现高水平的病毒去除，病毒对数去除率≥4Log。

在实施例1中，层析步骤后，选择millipore公司的ViresolvePro除病毒过滤膜开展除病毒过滤小试蛋白载量实验。

实验目的：通过针头式除病毒过滤膜计算蛋白载量。

实验过程：使用蠕动泵和纳滤膜组装病毒纳滤系统，对(蛋白浓度0.425mg/mL)批次进行过滤，纳滤膜型号：Pro Micro Device；膜面积：3.1cm²；设置过滤压力为0.15-0.2MPa，每分钟对过滤液进行称重，根据称重结果计算流速变化，当过滤流速下降到初始流速的80％时，定为过滤膜满载量，计算此时蛋白载量，并推算出生产规模所需的过滤膜规格。

表1每分钟称重数据汇总单位(g)

结果分析，从上表可以看出在过滤至22分钟时，纳滤速度降至初始速度的80％以下，即22分钟时达到蛋白满载。

计算：

过滤膜载量＝0.425mg/mL×88.9mL÷3.1cm²＝12.19mg/cm²

在规模化批量按照100L发酵时，纳米膜过滤阶段总蛋白约为1600mg，所以，需要的纳米膜总面积为1600mg/12.19/cm²＝140cm²

实施例3 S/D残留效果的检测分析：

相关的TNBP和Triton残留需满足最新药典的要求，对此，申请人分别使用本发明的方法进行了三个批次(20161118、20161119和20161220)的rh-TPO原液的病毒灭活，并在最终的产品中检测了S/D的残留效果，结果如下表所示：

表2 S/D灭活剂残留量检测

从表中可以得知，使用本发明的方法，具有最低的S/D灭活剂残留，对患者的安全用药起到了巨大的作用。

对比例1使用低pH孵放法和纳米膜过滤灭活病毒：

低pH孵放法：一般控制溶液的pH值3.8以下，灭活2h，可灭活几种脂包膜病毒。首先确定各个层析步骤下样的目的蛋白pH 3.8的稳定性，实验如下：

3.1实验目的

比较阳离子层析MMC下样、疏水层析Butyl HP下样、阴离子MixA层析下样，调节pH值至3.8用于灭活，确认灭活工艺步骤。

3.2实验方法

首先，本对比例中制备rh-TPO原液的步骤如下：

1)培养rh-TPO工程细胞；

2)发酵液依次经过阳离子层析、疏水层析、阴离子层析

其中，阳离子层析使用复合型弱阳离子介质MMC Diamond进行；

疏水层析使用Butyl HP填料进行；

阴离子层析使用MixAMustang离子交换填料进行；

3)除菌过滤和/或分装。

方法1：

取发酵液经MMC和疏水层析，洗脱液42mL，pH 6.94，Cond：11.81ms/cm，用1M HAC调整pH值3.8，缓慢加入并用磁力搅拌器加入，用量3.5mL pH3.80，维持2h后用1M Tris-HClpH 9.0调节pH 7.0，用量为4mL，测定Cond：13.10(阴离子层析Mustang可直接上样)，测定HPLC；

方法2：

取发酵液经MMC、疏水层析和阴离子层析下样50mL，pH 6.98用1M HAC调节pH 3.8，缓慢加入并用磁力搅拌器加入，用量4mL pH3.80，维持2h后用1M Tris-HCl pH 9.0调节pH7.0，用量4.25mL，测定HPLC；

方法3：

取发酵液经阳离子层析MMC Diamond下样38mL pH 8.16，用1M HAC调节pH 3.8，缓慢加入并用磁力搅拌器加入，用量6.5mL pH3.80，维持2h后；取30mL用1M Tris-HCl pH 9.0调节pH 7.0，用量6mL，测定电泳。

3.3结果分析：

3.3.1 SDS PAGE结果

上述三种方法的SDS-PAGE电泳图结果如图3所示，其中电泳图中1-9分别表示：

1为MMC下样(4℃48h未灭活)；

2为MMC下样(25℃室温20h未灭活)；

3为MMC下样(pH灭活后)；

4为butyl HP下样(4℃48h未灭活)；

5为butyl HP下样(25℃室温20h未灭活)；

6为butyl HP下样(pH灭活后)；

7为Mix A Mustang下样(4℃48h未灭活)；

8、Mix A Mustang下样(25℃室温20h未灭活；

9、Mix A Mustang(pH灭活后)；

其中，第3，第6和第9条带为低pH灭活后样品，相比较未灭活样品，的蛋白已降解，不符合质量要求。

3.3.2 HPLC图谱

上述三种方法的HPLC色谱分析结果如图4-7和表3-6所示，其中图4和表3为如方法1所示疏水层析下样经低pH灭活前的HPLC图谱和结果；灭活前：HPLC纯度85.32％。其中图5和表4为如方法1所示疏水层析下样经低pH灭活后的HPLC图谱和结果；灭活后：主峰保留时间从14.73min至15.81min，可见目的物已降解。图6和表5为如方法2所示阴离子层析下样经低pH灭活前的HPLC图谱和结果；灭活前：纯度98.97％；图7和表6为如方法2所示阴离子层析下样经低pH灭活后的HPLC图谱和结果，阴离子层析下样pH 3.8灭活后，纯度：89.08％。

表3

表4

表5

表6

分析：

1)低pH灭活：MMC下样和Butyl下样低pH灭活不稳定，低pH灭活不适合放在MMC和Butyl之后。

2)阴离子层析下样做低pH灭活样品液相纯度从98.97％降到89.08％，下降7％，有聚体产生，阴离子层析下样同样不适合做低pH灭活。

对比例2发酵液阶段使用低pH孵放法灭活病毒：

发酵液经过低pH灭活后，开始纯化制备样品分析：

阳离子层析步骤：

柱子：BXK 50/30h:18cm体积：360mL N/m：4913AS：1.86

Buffer A：20mM PB pH 6.50.1M NaCl Buffer B：20mM PB pH 6.5 1M NaCl

Buffer C:50mM Tris pH 8.01M NH4Cl 2M Urea

样品处理：发酵液2L用1M HAC调节pH 3.8，室温2h后用1M Tris调节pH 6.5，在用1μm过滤器过滤，3.3L即为样品。

过程：0.5M NaOH处理→纯化水→A液平衡→上样25mL/min，2.9L(1.75L的发酵液)→A液清洗→B液清洗→C液洗脱→纯化水→0.5M NaOH再生；

疏水层析步骤:

柱子：BXK 26/20h：14cm

缓冲液A:20mM PB 0.8M AS pH 7.0 Cond:115ms/cm

缓冲液B:20mM PB pH 7.0

样品：阳离子层析下样450mL，用HCl调节pH 7.0再用3M硫酸铵调节Cond：100ms/cm，即为样品。

过程：0.5M NaOH处理→纯化水→A液平衡→上样8mL/min→A液清洗→B液洗脱→纯化水→0.5M NaOH再生

3.5 SDS PAGE结果分析：

本方法的SDS-PAGE电泳图结果如图8所示，其中电泳图中1-10分别表示

1、发酵液

2、MMC流穿结束时

3、MMC流穿液混合样4、MMC洗杂第一个峰

5、MMC洗杂第二个峰

6、MMC洗脱目的蛋白峰

7、butyl HP流穿峰

8、butyl HP洗杂峰

9、Butyl HP洗脱目的峰

10、Marker

分析与结论：

1)阳离子-E3与之前的纯化工艺对比，AKTA制备图谱的峰高比小试工艺时低一倍；疏水层析E1也比小试工艺低一倍多。

2)SDS PAGE检测结果：未发现MMC洗脱有明显的TPO条带，疏水层析洗脱也未发现，蛋白全部降解。

3)低pH灭活放在发酵液上，同样不适合。

综上所述，采用常规的低pH孵放的方法不适用于rh-TPO重组蛋白生产工艺的病毒灭活。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。