阅读说明：本技术 一种高度交联的松香基高分子微球及其制备方法和应用 (High-crosslinking rosin-based polymer microsphere and preparation method and application thereof ) 是由 雷福厚 谢文博 夏璐 李文 李�浩 李鹏飞 程格格 鄂羽羽 丁猛 杨建林 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种高度交联的松香基高分子微球及其制备方法和应用,以含有三个丙烯基聚合基团的富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯为交联剂,甲基丙烯酸甲酯为功能单体,采用膜乳化-微悬浮聚合方法制备高度交联的松香基高分子微球。本发明的高度交联的松香基高分子微球为球形多孔材料,其粒径分布为2-10μm,平均孔径为12-28nm,比表面积为32-102m<Sup>2</Sup>/g；无毒环保、粒径均一、机械强度高,作为色谱柱填料具有耐压性更高、极性更小等特点,填充制备色谱柱对糖苷类药物具有较好的分离效果。(The invention discloses a highly crosslinked rosin-based polymer microsphere and a preparation method and application thereof. The highly crosslinked rosin-based polymer microsphere is a spherical porous material, the particle size distribution of the highly crosslinked rosin-based polymer microsphere is 2-10 mu m, the average pore diameter is 12-28nm, and the specific surface area is 32-102m 2 (ii)/g; no toxicity, environmental protection, uniform grain diameter and high mechanical strengthThe chromatographic column packing has the characteristics of higher pressure resistance, smaller polarity and the like, and the chromatographic column packed and prepared has better separation effect on glucoside medicines.)

一种高度交联的松香基高分子微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于高效液相色谱法领域，具体涉及一种高度交联的松香基高分子微球及其制备方法和应用。

背景技术

高效液相色谱法(HPLC)已成为药物分析，特别是多组分分析和杂质控制中最重要、最广泛的分析技术之一。伴随着理论体系不断完善，分离方法不断更新，仪器性能不断改进，应用领域不断扩展，液相色谱分析技术必将继续飞速发展。就技术领域发展而言，主要包括仪器性能、数据处理以及色谱柱技术等方面的提高和改进。如今，色谱柱技术的不断改进创新，填料种类的日益丰富，分离模式和分离方法的逐步完善，为分离分析科学描绘了一幅幅绚丽的图景。由于色谱柱是液相色谱分离的核心，开发新型或高性能的高效液相色谱填料(又称为填充剂、固定相)，提供多种色谱柱类型一直是色谱研究中最丰富、最有活力、最富于创造性的内容。为适应日益增加的分离要求，开发选择性更高、性能更优越的色谱柱就成为液相色谱法的研究热点之一。目前商品柱多以硅胶基质为主，硅胶填料在色谱应用中存在两个难于解决的问题：(1)可使用的pH范围窄：一般只能在pH为2-8的流动相条件下使用。碱度过大，特别是当季铵离子存在时，硅胶易于粉碎溶解；酸度过大，连接有机基团的化学键容易断裂。(2)硅胶表面残余的硅羟基和金属离子等杂质的存在易对碱性物质，尤其是含氮化合物产生不可逆吸附作用，使生物大分子，特别是多肽、蛋白质等样品产生变性和非特异吸附，造成峰形变差和回收率降低，限制了硅胶基质填料在生物体系分离分析中的应用。而同样被广泛作为色谱填料的聚合物微球呈现出良好的发展态势，有机聚合物柱填料与硅胶基质相比，其色谱性能有如下优点：(1)柱的重现性好；(2)柱寿命长；(3)样品负载量高；(4)pH值范围宽。因此，其在各个领域的研究发展很活跃。

目前，关于色谱固定相制备方法的报道，我们查到如下一些文献：

1.吕述权,Shuquan L V,石国宗,et al.键合β-环糊精琼脂凝胶微球分离纯化大豆苷元及其色谱机制研究[J].中草药,2016,Vol.47Issue(15):2627-2634.利用琼脂为原料,通过乳化、交联并键合功能基团β-环糊精(β-CD)制备制备键合β-环糊精琼脂凝胶微球，对大豆异黄酮粗品中大豆苷元进行高效分离纯化。

2.申请号：201510120168.0发明名称：一种大孔纤维素色谱微球的绿色合成新方法，其中提到了采用固化剂使离子液体内的纤维素固化形成大孔微球；最后对生成的大孔纤维素微球进行交联和改性，制备出具有灌流传质功效的纤维素阴离子交换材料。

3.申请号：201710710292.1发明名称：一种弱极性松香基高分子微球及其制备方法和应用，其中以甲基丙烯酸甲酯为单体，丙烯海松酸丙烯酸乙二醇酯为交联剂，采用膜乳化-微悬浮聚合方法制备弱极性松香基高分子微球，用于天然产物的分离。

然而以上微球制备的色谱柱固定相对糖苷类药物的分离效果差，因此有必要探索一种新的高分子微球用于糖苷类药物的分离。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种高度交联的松香基高分子微球及其制备方法和应用，该高度交联的松香基高分子微球无毒环保、粒径均一、机械强度高，作为色谱柱填料耐压性更高、极性更小，填充制备色谱柱对糖苷类药物具有较好的分离效果。

本发明的技术方案如下：

一种高度交联的松香基高分子微球，该高度交联的松香基高分子微球由甲基丙烯酸甲酯与富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯交联聚合而成，

所述富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯的结构式为：

所述高度交联的松香基高分子微球结构式为：

式中R为：

作为技术方案的优选，所述高度交联的松香基高分子微球酸值≤1mgKOH/g树脂，为球形多孔材料，粒径分布为2-10μm，平均孔径为12-28nm，比表面积为32-102m²/g。

一种如上所述的高度交联的松香基高分子微球的制备方法为，以甲基丙烯酸甲酯为功能单体，富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯为交联剂，采用膜乳化-微悬浮聚合方法制备高度交联的松香基高分子微球，其反应式为：

式中，为富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯的化学式，

为甲基丙烯酸甲酯的化学式，为高度交联的松香基高分子微球的化学式，式中n≥1。

作为技术方案的优选，所述膜乳化-微悬浮聚合方法具体为：将去离子水、聚乙烯醇组成的水相和甲基丙烯酸甲酯、交联剂富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯、溶剂氯仿、引发剂偶氮二异丁腈组成的油相混合，用膜乳化机进行乳化，得到预乳液，然后进行升温聚合反应即可得到高度交联的松香基高分子微球。

作为技术方案的优选，所述升温聚合反应为程序升温70-80℃反应60-120min，80-85℃反应60-120min，95-100℃反应60-120min。

作为技术方案的优选，所述水相中去离子水、聚乙烯醇的质量比为50：0.1～2。

作为技术方案的优选，所述油相中甲基丙烯酸甲酯、富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯、氯仿、偶氮二异丁腈的质量比为1～30：6：20～100：0.1～5。

一种如上所述的高度交联的松香基高分子微球的应用为，将所述高度交联的松香基高分子微球作为固定相填料，采用湿法装柱制备得到高度交联的松香基高分子色谱柱；将高度交联的松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，装柱压力为3000-5000psi；设置液相色谱仪的流动相流速为1.0-2.0mL/min，检测波长203nm，柱温35±10℃；启动进样阀使流动相将三七总皂苷带入高度交联的松香基高分子色谱柱中，实现三七皂苷的分离。

本发明的原理：

本发明的高度交联的松香基高分子微球由甲基丙烯酸甲酯与富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯交联聚合而成，本发明的高度交联的松香基高分子微球的模型图如图7所示。一方面，富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯上面含有与三七皂苷相似的甾环结构，并且其上的手性C原子使得合成的松香基高分子色谱柱具有更好的立体选择性用于分离结果相似物，另一方面，富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯具有三个酯基，交联度更高，能形成更致密的网状结构，有利于提高色谱柱的耐压性能；微球表面孔结构可以根据被分离物质尺寸大小进行调整，有利于分离过程的吸附解析。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明的高度交联的松香基高分子微球以天然产物松香的衍生物富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯为原料，可再生，机械强度高，安全无毒，可以用于食品级的分离。

(2)本发明的高度交联的松香基高分子微球为弱极性，与现有的松香基高分子微球比较，其酸值更低，属于完全中性的微球，有更好的耐碱性、膨胀度小等特点。

(3)本发明的高度交联的松香基高分子微球用作色谱固定相填料膨胀度小、粒径均一、比表面积大，对糖苷类药物具有较好的分离效果；与申请人的在先申请201710710292.1采用两个丙烯基制备的松香基高分子微球相比，机械强度高，作为色谱柱填料耐压性更高、极性更小，不会因膨胀而破坏微球的网络结构，耐压性能从8MPa提高至20MPa。

附图说明

图1为实施例1制备的高度交联的松香基高分子微球扫描电镜图；

图2为实施例2制备的高度交联的松香基高分子微球氮气吸附-脱附曲线图；

图3为实施例3制备的高度交联的松香基高分子微球粒径分布图；

图4为实施例4制备的高度交联的松香基高分子微球热重图；

图5为实施例5制备的高度交联的松香基高分子色谱柱流通性能图；

图6为本发明实施例6的高度交联的松香基高分子色谱柱对三七总皂苷混合溶液的分离图。

图7为本发明高度交联的松香基高分子微球模型图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明进一步详细说明，但不限于本发明的保护范围。

高度交联的松香基高分子微球的制备

制备实施例1

将500g去离子水、1g聚乙烯醇(离子水、聚乙烯醇的质量比为50：0.1)混合，加热至100℃使聚乙烯醇完全溶解，得到水相。将6.0g富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯，溶于20.0g氯仿中，使用超声波促溶解，待富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯完全溶解后，再依次加入1.0g甲基丙烯酸甲酯、0.1g偶氮二异丁腈(功能单体、交联剂、溶剂、引发剂质量比为1：6：20：0.1)，超声振荡10～15min，溶解完全，得到油相。将油相加入到水相中，用膜乳化机进行乳化，得到乳液，将乳液在200rad/min的搅拌速度下升温聚合，温度升至70℃时恒温120min，升至80℃时恒温120min，升至95℃时恒温120min。反应结束后，将产物依次用乙酸乙酯、乙醇进行提取，最后用水蒸气蒸馏法除去微球中的乙酸乙酯、乙醇，得到高度交联的松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例得到的高度交联的松香基高分子微球，酸值为0.52mgKOH/g树脂，粒径分布为2-5μm，平均孔径为18nm，比表面积为32m²/g。

制备实施例2

将400g去离子水、8g聚乙烯醇(离子水、聚乙烯醇的质量比为50：1)混合，加热至100℃使聚乙烯醇完全溶解，得到水相。将6.0g富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯，溶于70.0g氯仿中，使用超声波促溶解，待富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯完全溶解后，再依次加入10.0g甲基丙烯酸甲酯、4g偶氮二异丁腈(功能单体、交联剂、溶剂、引发剂质量比为10：6：70：4)，超声振荡2～10min，溶解完全，得到油相。将油相加入到水相中，用膜乳化机进行乳化，得到乳液，将乳液在160rad/min的搅拌速度下升温聚合，温度升至70℃时恒温90min，升至83℃时恒温90min，升至98℃时恒温90min。反应结束后，将产物依次用乙酸乙酯、乙醇进行提取，最后用水蒸气蒸馏法除去微球中的乙酸乙酯、乙醇，得到高度交联的松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例得到的高度交联的松香基高分子微球，酸值为0.40mgKOH/g树脂，粒径分布为2-5μm，平均孔径为12nm，比表面积为49m²/g。

制备实施例3

将500g去离子水、20g聚乙烯醇(离子水、聚乙烯醇的质量比为50：2)混合，加热至100℃使聚乙烯醇完全溶解，得到水相。将6.0g富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯，溶于30.0g氯仿中，使用超声波促溶解，待富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯完全溶解后，再依次加入20.0g甲基丙烯酸甲酯、5g偶氮二异丁腈(功能单体、交联剂、溶剂、引发剂质量比为20：6：30：5)，超声振荡2～10min，溶解完全，得到油相。将油相加入到水相中，用膜乳化机进行乳化，得到乳液，将乳液在200rad/min的搅拌速度下升温聚合，温度升至80℃时恒温60min，升至85℃时恒温60min，升至100℃时恒温60min。反应结束后，将产物依次用乙酸乙酯、乙醇进行提取，最后用水蒸气蒸馏法除去微球中的乙酸乙酯、乙醇，得到高度交联的松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例得到的高度交联的松香基高分子微球，酸值为0.43mgKOH/g树脂，粒径分布为5-8μm，平均孔径为25nm，比表面积为76m²/g。

制备实施例4

将500g去离子水、6g聚乙烯醇(离子水、聚乙烯醇的质量比为50：0.6)混合，加热至100℃使聚乙烯醇完全溶解，得到水相。将6.0g富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯，溶于100.0g氯仿中，使用超声波促溶解，待富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯完全溶解后，再依次加入30.0g甲基丙烯酸甲酯、3g偶氮二异丁腈(功能单体、交联剂、溶剂、引发剂质量比为30：6：100：3)，超声振荡2～10min，溶解完全，得到油相。将油相加入到水相中，用膜乳化机进行乳化，得到乳液，将乳液在200rad/min的搅拌速度下升温聚合，温度升至75℃时恒温60min，升至80℃时恒温60min，升至95℃时恒温60min。反应结束后，将产物依次用乙酸乙酯、乙醇进行提取，最后用水蒸气蒸馏法除去微球中的乙酸乙酯、乙醇，得到高度交联的松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例得到的高度交联的松香基高分子微球，酸值为0.41mgKOH/g树脂，粒径分布为5-7μm，平均孔径为22nm，比表面积为93m²/g。

制备实施例5

将500g去离子水、15g聚乙烯醇(离子水、聚乙烯醇的质量比为50：1.5)混合，加热至100℃使聚乙烯醇完全溶解，得到水相。将6.0g富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯，溶于45.0g氯仿中，使用超声波促溶解，待富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯完全溶解后，再依次加入15.0g甲基丙烯酸甲酯、2g偶氮二异丁腈(功能单体、交联剂、溶剂、引发剂质量比为15：6：45：2)，超声振荡2～10min，溶解完全，得到油相。将油相加入到水相中，用膜乳化机进行乳化，得到乳液，将乳液在200rad/min的搅拌速度下升温聚合，温度升至70℃时恒温70min，升至80℃时恒温70min，升至100℃时恒温70min。反应结束后，将产物依次用乙酸乙酯、乙醇进行提取，最后用水蒸气蒸馏法除去微球中的乙酸乙酯、乙醇，得到高度交联的松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例得到的高度交联的松香基高分子微球，酸值为0.49mgKOH/g树脂，粒径分布为5-10μm，平均孔径为28nm，比表面积为102m²/g。

高度交联的松香基高分子微球的材料表征：

(一)表征分析方法

扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope，SEM)是一种表征纳米材料形貌特征的重要方法。本研究使用场发射扫描电子显微镜(FESEM)对高度交联的松香基高分子微球进行微观形貌分析。

氮气吸附-脱附曲线是表征多孔材料的重要方法。本研究使用MicromeriticsASAP 2020M物理吸附仪对高度交联的松香基高分子微球的比表面积、孔容及其孔径进行表征。

激光粒度仪是通过颗粒的衍射或散射光的空间分布(散射谱)来分析颗粒大小的仪器，本研究使用马尔文激光粒度仪(Mastersizer 3000，Malvern,UK)对高度交联的松香基高分子微球的颗粒大小进行表征。

热重分析(Thermogravimetric Analysis，TG)，本发明采用日本岛津DTA-60/60H型热重分析仪，通过失重率随程序升温的变化，探究高度交联的松香基高分子微球的热稳定性。

色谱柱流通性能指标是说明色谱柱流速与柱压关系的曲线，在设定的操作范围内，色谱柱没有发生形变，填料机械强度高，耐压性强。

(二)表征分析结果

1.实施例1制备的高度交联的松香基高分子微球扫描电镜图如图1所示。从图1可以看出，本发明制备的高度交联的松香基高分子微球大小均一，表面孔隙丰富，球形度良好且未出现粘连现象。

2.实施例2制备的高度交联的松香基高分子微球氮气吸附-脱附曲线如图2所示。从图2可以看出，本发明制备的高度交联的松香基高分子微球呈现较为明显的Ⅳ曲线，在相对压力为0.4-0.9之间存在滞回环，表明材料内存在介孔。

3.实施例3制备的高度交联的松香基高分子微球的粒径分布图如图3所示。从图3可以看出，本发明制备的高度交联的松香基高分子微球粒径分布集中在2-10μm，分布范围较窄，能达到高效液相色谱固定相的要求。

4.实施例4制备的高度交联的松香基高分子微球的热失重曲线如图4所示。从图4可以看出，本发明制备的高度交联的松香基高分子微球热稳定性良好，在350℃附近开始分解，到500℃左右分解完全，失重率达到95％以上。

5.实施例5制备的高度交联的松香基高分子微球的流通性能评价如图5所示。从图5可以看出，本发明制备的高度交联的松香基高分子微球作为色谱固定相在0-2mL/min的流速范围内与柱压呈现良好的线性关系。

对比应用实施例1应用C18色谱柱分离三七总皂苷中的三七皂苷

C18色谱柱，为市场购买得到。

以乙腈水为流动相，设定检测波长为203nm，柱温为25℃，流速为1.5mL/min。启动进样阀使乙腈水将样品带入上述C18色谱柱中，进样量为20μL，对三七总皂苷中的三七皂苷进行分离，分离度为0.56。

对比应用实施例2应用弱极性松香基高分子色谱柱分离三七总皂苷中的三七皂苷

弱极性松香基高分子色谱柱，按照申请号为201710710292.1的发明专利申请公布的方法制备得到。

以乙腈水为流动相，设定检测波长为203nm，柱温为25℃，流速为1.5mL/min。启动进样阀使乙腈水将样品带入上述松香基高分子色谱柱中，进样量为20μL，对三七总皂苷中的三七皂苷进行分离，分离度为2.18。

应用实施例1应用高度交联的松香基高分子色谱柱分离三七总皂苷中的三七皂苷

将制备实施例1得到的高度交联的松香基高分子微球作为固定相填料，采用湿法装柱制备得到高度交联的松香基高分子色谱柱；将高度交联的松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，装柱压力为3000-5000psi；以乙腈水为流动相，设定检测波长203nm，柱温35±10℃，流动相流速为1.0-2.0mL/min；启动进样阀使乙腈水将三七总皂苷带入高度交联的松香基高分子色谱柱中，实现三七皂苷的分离。所得结果如图6所示，在保留时间15.56min时出现三七皂苷Rg1，在保留时间18.71min时出现三七皂苷Re峰，分离度为3.36。

可见，本发明的高度交联的松香基高分子色谱柱对三七总皂苷中的三七皂苷的分离效果远优于同样色谱条件下C18色谱柱，也优于同样色谱条件下弱极性松香基高分子色谱柱。