利用分子伴侣构建的吡喃糖氧化酶基因、蛋白、毕赤酵母菌及制备和应用

文档序号：1668363 发布日期：2019-12-31 浏览：35次 >En<

阅读说明：本技术 利用分子伴侣构建的吡喃糖氧化酶基因、蛋白、毕赤酵母菌及制备和应用 (Pyranose oxidase gene, protein and pichia pastoris constructed by utilizing molecular chaperones, and preparation and application thereof ) 是由董聪王玥高庆华王庆庆罗同阳马清河马金国于 2019-10-28 设计创作，主要内容包括：本发明属于新基因的制备及工程菌的构建,特别是指一种利用分子伴侣构建的吡喃糖氧化酶基因、蛋白、毕赤酵母菌及制备和应用。本发明是将毕赤酵母中EroⅠ、PDI、CNE1、SEC53等基因分别克隆连接到毕赤酵母表达载体pPICZ等系列衍生质粒连接,并与P2O共表达转化入Pichia pastoris GS115菌株中,涂布于不同博来霉素浓度梯度YPD平板上考察其效果,通过分子伴侣共表达和发酵条件优化,经筛选鉴定得到一株较原有菌株增强分泌表达吡喃糖氧化酶的菌株,该菌株表达的吡喃糖氧化酶在10L发酵罐上酶活达405U/mL,比没有分子伴侣共表达菌株酶活提高1倍,为吡喃糖氧化酶规模化生产奠定了良好基础。(The invention belongs to the preparation of new genes and the construction of engineering bacteria, and particularly relates to a pyranose oxidase gene, a pyranose protein and pichia pastoris constructed by utilizing a molecular chaperone, and preparation and application thereof. The invention clones and connects Ero I, PDI, CNE1, SEC53 and other genes in Pichia pastoris to a Pichia pastoris expression vector pPICZ and other series derivative plasmids respectively, and co-expresses and converts the Ero I, PDI, CNE1, SEC53 and other genes into a Pichia pastoris GS115 strain with P2O, coats the Pichia pastoris GS115 strain on YPD plates with different bleomycin concentration gradients to investigate the effect of the Pichia pastoris strain, obtains a strain for enhancing secretion and expression of pyranose oxidase compared with the original strain through molecular chaperone co-expression and fermentation condition optimization through screening and identification, improves the enzyme activity of pyranose oxidase expressed by 405U/mL on a 10L fermentation tank by 1 time compared with the enzyme activity of the strain without the molecular chaperone co-expression, and lays a good foundation for scale production.)

技术领域

本发明属于新基因的制备及工程菌的构建，特别是指一种利用分子伴侣构建的吡喃糖氧化酶基因、蛋白、毕赤酵母菌及制备和应用。

背景技术

吡喃糖氧化酶(pyranose oxidase,PROD,简称P2O)又名吡喃糖-2-氧化酶或葡萄糖-2-氧化酶(pyranose-2-oxidase,glucose-2-oxidase)，系统编号EC 1.1.3.10，是以黄素蛋白为辅酶、以六元环吡喃单糖类化合物为底物的氧化还原酶类，具有多底物催化特征。该酶属于葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(glucose-methanol-choline oxidoreductases，GMC)家族，可以催化葡萄糖和其他几种吡喃糖C-2位氧化生成相应的2-酮糖，同时将O₂还原为 H₂O₂。吡喃糖氧化酶在糖化学、分析化学和临床化学等行业应用十分广泛。

研究发现，以基因工程菌株异源表达蛋白具有较多优势。工程菌一般遗传背景清楚，培养条件成熟，生长速率较快，蛋白表达调控较易操作。目前，使用较多的异源表达有原核和真核表达系统。经查阅文献发现，到目前为止，吡喃糖氧化酶基因的克隆与表达只在大肠杆菌中进行并成功的实现，如湖南大学的张可可等曾利用大肠杆菌作为宿主菌表达吡喃糖氧化酶，虽能检测到活性(最高0.11U/mL)，但表达量极低。且利用大肠杆菌作为异源表达宿主时，要进行细胞破碎、离心，还经常会遇到包涵体问题，包涵体变性过程容易，而复性却比较复杂，操作不方便。

毕赤酵母表达系统作为一种真核表达系统，具有以下优点：遗传改造方便，外源蛋白表达水平高，真核蛋白翻译后修饰，便于大规模发酵，分泌的重组蛋白易于纯化。毕赤酵母表达系统已经被成功地用来表达多种重组外源蛋白。但是，随着某些外源蛋白的表达水平过高，超过了宿主细胞翻译后处理加工能力所能承担的最大负荷，引起蛋白的错误折叠、不加工或错误定位，进而导致目的蛋白在内质网腔中形成多聚体，并阻滞在内质网妨碍其功能，或者分泌到胞外的蛋白质无活性。这些问题越来越成为阻碍毕赤酵母表达系统应用于高水平表达的瓶颈问题。

分子伴侣是一大类在生物大分子折叠、组装及降解过程中起重要的协同作用，但自身并不发生任何变化的蛋白质分子。不同细胞定位的分子伴侣具有不同的功能。细胞质中的分子伴侣的主要功能是协助蛋白质核糖体转运到内质网膜上，同时分子伴侣之间相互作用，促进错误折叠蛋白多聚体解聚和降解，维护细胞正常的生理代谢状态。内质网膜上的分子伴侣蛋白主要是介导蛋白质核糖体结合到内质网膜上，并组成蛋白质多肽连转运通道，例如 Sec61、Sec62和Sec63组成的转运通道能转运多肽进入内质网腔中。内质网腔中的分子伴侣对保证蛋白质正确折叠具有重要作用。

二硫键异构酶(PDI)和内质网氧化还原酶(Ero Ⅰ)广泛存在于真菌、植物、动物和人内质网中，能够帮助蛋白分泌。二硫键异构酶(Protein disul fide isomerase，PDI)是内质网中含量最丰富的蛋白之一，主要催化氧化反应帮助蛋白形成正确的折叠结构而分泌到胞外，它可以明显提高异源蛋白在毕赤酵母中的表达。在酵母内质网中大部分以氧化状态存在，意味着PDI主要显示氧化活性帮助蛋白形成正确的折叠结构而分泌到胞外。EroⅠ在内质网中氧化还原态的PDI成氧化态，间接帮助蛋白分泌。缺失EroⅠ的细胞内质网不能氧化新合成的蛋白，而缺少PDI的细胞不能存活。Zhang等在毕赤酵母中通过共表达PDI使葡萄糖苷酶比活提高1.5倍；Wu等在毕赤酵母中通过共表达PDI和EroⅠ使人血清白蛋白和人生长激素的融合蛋白在5L发酵罐上表达量提高到304g/L。

在P.pastoris中提高外源蛋白生产的重要瓶颈在于蛋白折叠与分泌的低效率。蛋白折叠与分泌的过程十分复杂，牵扯到一系列相互关联的胞内机制和应激反应。申请人将蛋白生产的代谢通路区分为4个主要的模块，分别为：蛋白折叠模块，囊泡运输模块，内质网相关降解机制(ERAD)模块和胁迫应激反应模块。各个功能之间相互影响，调节一个区域的功能将直接影响到其他的区域功能。

在研究中，选取了对蛋白质合成转运具有重大影响的分子伴侣进行研究考察，它们是蛋白折叠相关基因CNE1和囊泡运输相关基因SEC53。折叠模块主要存在于ER中，由CNE1基因编码的内质网凝集蛋白(calnexin)属于ER 质量控制机制中另一重要控制蛋白，主要参与糖蛋白的折叠与糖基化修饰。凝集蛋白(calnexin)能够识别并结合即将进行折叠的糖蛋白中间体，作为蛋白折叠状态的传感信号存在于ER的折叠机制中。同时若蛋白持续地错误折叠，calnexin蛋白能够减缓释放结合的蛋白中间体，使其参与下一轮的折叠步骤。囊泡运输模块对于外源蛋白分泌起到重要作用。研究表明，在酵母表达系统中，蛋白的分泌跨越几种细胞器，包含了胞质空间、内质网、高尔基体、液泡和细胞膜。SEC53基因编码的Sec53p蛋白是参与ER膜上准运新生肽链进行糖基化修饰的功能，关系到新生肽链在ER膜上被驻留蛋白识别的重要功能蛋白。江南大学顾磊等将这两个分子伴侣基因与葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中共表达，提高了葡萄糖氧化酶的表达量。

在毕赤酵母常用的系列表达载体中引入了抗性标记基因。转化完成后，外源基因和抗性基因以同源重组的方式同时整合到毕赤酵母染色体上。通过提高抗性,可以筛选到多拷贝数***的外源基因，毕赤酵母转化子拷贝数越高, 抗性的能力越强。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种利用分子伴侣构建的吡喃糖氧化酶基因。

本发明的目的之二在于提供一种利用分子伴侣构建的吡喃糖氧化酶基因的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种利用吡喃糖氧化酶基因编码的蛋白。

本发明的目的之四在于提供一种利用吡喃糖氧化酶基因转化的巴斯德毕赤酵母菌Phchia pastoris CGMCC No.18464。

本发明的目的之五在于提供一种巴斯德毕赤酵母菌Phchia pastoris CGMCCNo.18464在制备吡喃糖氧化酶中的应用。

本发明的整体技术构思是：

利用分子伴侣构建的吡喃糖氧化酶基因，其基因序列为SEQ ID No.1。

利用分子伴侣构建的吡喃糖氧化酶基因的制备方法，包括如下工艺步骤：

A、构建质粒与菌株

将巴斯德毕赤酵母Phchia pastoris CGMCC No.16552制备成感受态；

B、分子伴侣基因克隆

根据伴侣蛋白Ero1、PDI、CNE1和SEC53基因序列设计寡核苷酸链，合成引物，以毕赤酵母Phchia pastoris CGMCC No.16552基因组为模板，通过 PCR技术利用引物以毕赤酵母的基因组为模板分别扩增出Ero1、PDI、CNE1和 SEC53基因序列，引物具体如下：

ERoI-F：5′-ctatttcgaaacgatgaggatagtaaggagcgtagctatc-3′，其中下划线为BstBI酶切位点；

ERoI-R：5′-ataagaatgcggccgcttacaagtctactctatatgtggtatc-3′，其中下划线为NotI酶切位点；

PDI-F：5′-ctatttcgaaacgatgcaattcaactgggatattaaaactg-3′，其中下划线为BstBI酶切位点；

PDI-R：5′-ataagaatgcggccgctaaagctcgtcgtgagcgtctgcctc-3′，其中下划线为NotI酶切位点；

CNE1-F：5′-ctatttcgaaacgatgaagatctctaccattgcaag-3′，其中下划线为BstBI酶切位点；

CNE1-R：5′-ataagaatgcggccgctaggttctctttgtagctttagtc-3′，其中下划线为NotI酶切位点；

SEC53-F：5′-ctatttcgaaacgatgtcgttttctaataaagaagatc-3′，其中下划线为BstBI酶切位点；

SEC53-R：5′-ataagaatgcggccgcttacagggaaaagagctcct-3′，其中下划线为NotI酶切位点；

PCR反应共30个循环，PCR反应体系如下：Q5聚合酶1μl，5×Buffer20 μl，5×GCenhance 20μl，上、下游引物各4μl，浓度为l0mM的dNTP 2 μl，毕赤酵母基因组模版4μl，ddH₂O添加至100μL；

双酶切纯化后将Ero1、PDI、CNE1和SEC53的成熟片段与分别同样双酶切的pPICZ载体连接，构建克隆载体pPICZ-EroⅠ、pPICZ-PDI、pPICZ-CNE1 和pPICZ-SEC53，转化E.coliT1感受态细胞，挑取单克隆进行PCR，酶切鉴定和基因测序，获得正确的融合载体；

C、重组质粒的构建

重组质粒pPICZ-PDI的构建方法：在pPICZ载体的BstB I和Not I酶切位点之间***了PDI基因的双链分子；重组质粒pPICZ-EroⅠ的构建方法：在 pPICZ载体的BstB I和NotI酶切位点之间***了EroⅠ基因的双链分子；重组质粒pPICZ-CNE1的构建方法：在pPICZ载体的BstB I和Not I酶切位点之间***了CNE1基因的双链分子；重组质粒pPICZ-SEC53的构建方法：在 pPICZ载体的BstB I和Not I酶切位点之间***了SEC53基因的双链分子。

利用吡喃糖氧化酶基因编码的蛋白，其序列为SEQ ID No.2。

利用吡喃糖氧化酶基因转化的巴斯德毕赤酵母，其拉丁文分类命名为 Phchiapastoris，其保藏编号为CGMCC No.18464。

申请人已于2019年9月4日将上述菌种提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该菌种的分类命名为巴斯德毕赤酵母Phchia pastoris ，保藏编号为CGMCC No.18464，该保藏机构位于北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，该保藏机构的简称为CGMCC。

巴斯德毕赤酵母在制备吡喃糖氧化酶中的应用。

本发明的具体技术构思还有：

巴斯德毕赤酵母Phchia pastoris CGMCC No.18464在制备吡喃糖氧化酶中的应用，包括如下工艺步骤：

挑取保藏编号为CGMCC No.18464的巴斯德毕赤酵母接种于5ml的YPD液体培养基培养10小时，按3％接种量转接于150mL的BMGY培养基至OD₆₀₀≈6接种于发酵罐中，容积为10L发酵罐的装液量为5.4L的BSM培养基，灭菌后以10％发酵体积接种，以浓氨水控制pH＝5.0，培养温度30℃，培养阶段甘油耗尽时，开始流加体积百分比浓度为50％甘油4h后至OD₆₀₀≈180，停止流加甘油；待培养基中甘油耗尽，开始流加甲醇诱导，甲醇溶液的体积百分浓度为1％，期间每隔24h 加Vc水溶液至终浓度80μg/L，每12h取样测定发酵液酶活，当酶活不再升高时停止发酵。

本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：

1、本发明在巴斯德毕赤酵母菌Phchia pastoris CGMCC No.16552的基础上构建了含有分子伴侣PDI、EroⅠ、CNE1和SEC53的重组载体，通过整合分子伴侣共表达进一步提高P2O的表达水平。

2、将构建的测序正确的重组质粒进行SfoⅠ线性化后分别电转制成的感受态，构建菌，通过不同博来霉素浓度梯度筛选得到分子伴侣高拷贝数菌株，通过抗生素浓度梯度筛选得到高拷贝数的基因整合到染色体DNA上，在提高表达量的同时也保证后代的遗传稳定性。

3、通过发酵培养基YPCS进行初步发酵筛选高酶活菌株，经筛选鉴定得到一株较原有菌株增强分泌表达吡喃糖氧化酶的菌株，该菌株表达的吡喃糖氧化酶在10L发酵罐上酶活405U/mL，比没有分子伴侣共表达菌株酶活提高1 倍。

具体实施方式

以下实施例对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定。本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范畴。本发明实施例中未注明具体条件的方法，均按照本领域常用的技术手段或厂商所建议的条件进行。

实施例1

利用分子伴侣构建的吡喃糖氧化酶基因，其基因序列为：

GAATTCATGTCTACTTCCTCCTCCGATCCATTCTTCAACTTTACCAAGTCCTCCTTCAGATCCGCT GCTGCTCAAAAGGCTTCTGCTACTTCTTTGCCACCATTGCCAGGTCCAGACAAGAAAGTTCCAGGT ATGGACATCAAGTACGACGTGGTTATCGTTGGTTCCGGTCCAATCGGTTGTACTTACGCTAGAGAA TTGGTTGAGGCCGGTTACAAGGTTGCCATGTTCGACATTGGTGAGATCGACTCCGGTTTGAAGATT GGTGCTCACAAGAAGAACACCGTCGAGTACCAGAAGAACATCGACAAGTTCGTCAACGTCATCCAG GGTCAGTTGATGTCTGTTTCCGTTCCAGTTAACACCCTGGTCATCGATACTTTGTCTCCAACTTCT TGGCAGGCCTCCTCATTCTTCGTTAGGAACGGTTCTAACCCAGAGCAGGACCCATTGAGAAACTTG TCTGGTCAGGCTGTTACCAGAGTTGTTGGTGGTATGTCTACTCACTGGACTTGTGCTACTCCAAGA TTCGACAGAGAGCAAAGACCATTGCTGGTTAAGGATGACACTGATGCTGATGACGCTGAATGGGAC AGACTGTACACTAAGGCTGAGTCCTACTTCAAGACTGGTACTGACCAGTTCAAAGAGTCCATCAGA CACAACCTGGTCTTGAACAAGTTGGCCGAAGAGTACAAGGGTCAGAGAGACTTCCAACAGATTCCA TTGGCTGCCACTAGAAGATCCCCAACTTTTGTTGAATGGTCCTCCGCCAACACCGTTTTCGACTTG CAAAACAGACCAAACACTGACGCTCCAAACGAGAGATTCAACTTGTTTCCAGCTGTTGCCTGTGAG AGAGTCGTTAGAAACACTTCCAACTCCGAGATCGAGTCCTTGCACATTCACGACTTGATTTCCGGT GACAGATTCGAGATCAAGGCCGACGTTTTCGTTTTGACTGCTGGTGCTGTTCACAACGCTCAGCTG TTGGTTAACTCTGGTTTCGGTCAATTGGGTAGACCAGATCCAGCTAACCCACCAAGATTGCTTCCA TCTTTGGGTTCCTACATCACCGAGCAGTCCTTGGTTTTCTGTCAGACTGTTATGTCCACCGAGCTG ATTGACTCTGTCAAGTCCGACATGATCATCAGAGGTAACCCAGGTGATCCAGGTTACTCCGTTACT TACACTCCAGGTGCCTCCACTAACAAGCACCCAGATTGGTGGAACGAGAAGGTCAAGAACCACATG ATGCAACACCAAGAGGACCCACTGCCAATTCCATTCGAAGATCCAGAGCCACAGGTTACCACTTTG TTTCAACCATCTCACCCATGGCACACCCAGATCCATAGAGATGCTTTTTCTTACGGTGCCGTCCAG CAATCCATTGACTCCAGATTGATCGTTGACTGGCGTTTCTTCGGTAGAACCGAGCCAAAAGAAGAG AACAAGCTTTGGTTCTCCGACAAGATCACCGACACCTACAACATGCCACAACCTACCTTCGACTTC AGATTCCCAGCTGGTAGAACTTCCAAAGAGGCTGAGGATATGATGACCGACATGTGTGTTATGTCT GCCAAGATCGGTGGTTTCTTGCCAGGTTCTTTGCCCCAATTCATGGAACCAGGTTTGGTCTTGCAC CTTGGTGGTACTCACAGAATGGGTTTCGATGAGCAAGAGGACAAGTGTTGTGTCAACACCGACTCCAGAGTGTTCGGTTTCAAGAACTTGTTCCTTGGTGGCTGCGGTAACATCCCAACTGCTTATGGTGCT AACCCAACTTTGACTGCCATGTCCTTGGCTATCAAGTCCTGCGAGTACATCAAGAACAACTTCACC CCATCTCCATTCACTGACCAGGCTCAGCACCATCACCATCACCATTAAGCGGCCGC。

实施例2

利用上述吡喃糖氧化酶基因基因编码的蛋白，其氨基酸序列为：

EFMSTSSSDPFFNFTKSSFRSAAAQKASATSLPPLPGPDKKVPGMDIKYDVVIVGSGPIGCTYARE LVEAGYKVAMFDIGEIDSGLKIGAHKKNTVEYQKNIDKFVNVIQGQLMSVSVPVNTLVIDTLSPTS WQASSFFVRNGSNPEQDPLRNLSGQAVTRVVGGMSTHWTCATPRFDREQRPLLVKDDTDADDAEWD RLYTKAESYFKTGTDQFKESIRHNLVLNKLAEEYKGQRDFQQIPLAATRRSPTFVEWSSANTVFDL QNRPNTDAPNERFNLFPAVACERVVRNTSNSEIESLHIHDLISGDRFEIKADVFVLTAGAVHNAQL LVNSGFGQLGRPDPANPPRLLPSLGSYITEQSLVFCQTVMSTELIDSVKSDMIIRGNPGDPGYSVT YTPGASTNKHPDWWNEKVKNHMMQHQEDPLPIPFEDPEPQVTTLFQPSHPWHTQIHRDAFSYGAVQ QSIDSRLIVDWRFFGRTEPKEENKLWFSDKITDTYNMPQPTFDFRFPAGRTSKEAEDMMTDMCVMS AKIGGFLPGSLPFMEPGLVLHLGGTHRMGFDQEDKCCVNTDSRVFGFKNLFLGGCGNIPTAYGANP TLTAMSLAIKSCEYIKNNFTPSPFTDQAQHHHHHH*AA。

实施例3

利用分子伴侣构建的吡喃糖氧化酶基因的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤：

A、构建质粒与菌株

将巴斯德毕赤酵母Phchia pastoris CGMCC No.16552制备成感受态；

B、分子伴侣基因克隆

根据伴侣蛋白Ero1、PDI、CNE1和SEC53基因序列设计寡核苷酸链，合成引物，以巴斯德毕赤酵母Phchia pastoris CGMCC No.16552基因组为模板，通过PCR技术利用引物以巴斯德毕赤酵母的基因组为模板分别扩增出Ero1、 PDI、CNE1和SEC53基因序列，引物具体如下：