阅读说明：本技术 一种可用于饲料的三孢布拉霉菌及其制备方法与应用 (Blakeslea trispora for feed and preparation method and application thereof ) 是由 李翔宇 余超 熊淑婷 陆姝欢 汪志明 于 2019-10-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及饲料制备领域,具体涉及一种可用于饲料的三孢布拉霉菌及其制备方法与应用。所述三孢布拉霉菌的细胞膜完整,细胞壁部分破坏。制备方法包括：在发酵结束后,按30-150mg/每克生物质在发酵液中加入酶制剂,作用2-5h；所述酶制剂为选自蛋白酶、β-葡聚糖酶、蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶、几丁质酶一种或其混合物。本发明提供了一种可用于饲料的“半破壁”的三孢布拉霉菌,并针对三孢布拉霉菌提供了一种特定的酶解破壁的方法,可以有效防止胞内有效物质的破坏,同时菌体进入动物体内后有效成分能够顺利释出,有利于动物的快速吸收。(The invention relates to the field of feed preparation, and in particular relates to Blakeslea trispora for feed and a preparation method and application thereof. The cell membrane of the Blakeslea trispora is intact, and the cell wall is partially destroyed. The preparation method comprises the following steps: after fermentation is finished, adding an enzyme preparation into the fermentation liquor according to the proportion of 30-150 mg/g biomass for acting for 2-5 h; the enzyme preparation is selected from one or a mixture of protease, beta-glucanase, helicase, cellulase, lysozyme and chitinase. The invention provides the Blakeslea trispora which can be used for the 'semi-wall breaking' of the feed, and provides a specific enzymolysis wall breaking method for the Blakeslea trispora, so that the damage of intracellular effective substances can be effectively prevented, and meanwhile, effective components can be smoothly released after thalli enter an animal body, thereby being beneficial to the rapid absorption of the animal.)

一种可用于饲料的三孢布拉霉菌及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及饲料制备领域，具体涉及一种可用于饲料的三孢布拉霉菌及其制备方法与应用。

背景技术

类胡萝卜素作为动物饲料，对畜禽具有防治、抑制癌症的作用，能够提高动物免疫功能，保护动物有效预防和抑制疾病的发生，可替代或减少抗生素的使用量，减少由于饲料安全问题而带来的食品安全等一系列问题。类胡萝卜素色泽丰满自然，在饲料中添加类胡萝卜素对改善肉类色泽有一定的应用空间，这样可以减低使用化学合成色素带来的危害。且钾、镁、钙、锌离子对类胡萝卜素的影响不大，因此，类胡萝卜素与常用的饲料添加剂不产生拮抗作用。

三孢布拉霉菌可以产生多种类胡萝卜素，尤其是其中的β-胡萝卜素和番茄红素具有高度抗氧化，清除体内自由基的特性，因此已作为功能性原料在食品、保健品中广泛使用。

三孢布拉霉菌为丝状菌体，细胞壁成分复杂，在动物体内难以释放，导致动物吸收效率低。如果直接将霉菌中的类胡萝卜素提取出来制成饲料，或者是将霉菌完全破壁制备饲料，在制备和贮存运输过程中都非常容易发生氧化，为了保护类胡萝卜素不被氧化则需要对产品进行充氮、抽真空，即使如此也无法保证制备和使用过程中的氧化反应，并且无形中也将成本提高，这对于饲料应用来说并不划算。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提出了一种可以提高所需成分的稳定性，同时有利于动物吸收的三孢布拉霉菌及其制备方法与应用。

为了实现上述技术目的，本发明技术方案如下：

本发明首先提供一种可用于饲料的三孢布拉霉菌，所述三孢布拉霉菌的细胞膜完整，细胞壁部分破坏。

当三孢布拉霉菌的菌体处于上述状态时，能够有效防止内含的类胡萝卜素或其他有效物质被氧化，同时作为饲料，菌体进入动物体内后类胡萝卜素或其他有效物质能够从开孔处释出，有利于动物的快速吸收。

本发明进一步提供一种可用于饲料的三孢布拉霉菌的制备方法，可用于制备上述三孢布拉霉菌，该方法包括：

在三孢布拉霉菌发酵结束后，按30-150mg/每克生物质在发酵液中加入酶制剂，作用2-5h。

作为优选，所述酶制剂为选自蛋白酶、β-葡聚糖酶、蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶、几丁质酶一种或其混合物。

本发明发现，采用酶解破壁的方法，通过选用上述特定酶，并进一步控制酶的添加量(相当于控制反应时酶的浓度)及处理时间，可以控制三孢布拉霉菌细胞壁的溶解程度，达到细胞壁只是被部分破坏产生多个开孔，但仍能保留完整或大部分完整的细胞结构的效果。

为了进一步使三孢布拉霉菌达到只是细胞壁出现部分破坏，但是细胞膜尽量完整的情况，本发明进一步对酶解条件进行了优化，得到了如下优选方案：

作为优选，发酵液中三孢布拉霉菌的浓度为30-60g/L。

本发明中所提到的蛋白酶包括碱性蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶，优选本发明中的蛋白酶优选为中性蛋白酶。

作为优选，所述酶制剂为中性蛋白酶、纤维素酶、溶菌酶、几丁质酶的混合物；

优选所述中性蛋白酶、纤维素酶，溶菌酶，几丁质酶的重量比为(10-20):(5-10):(0.4-0.8):(0.1-0.5)。

优选所述酶制剂按上述比例复配时，添加量为75-130mg/每克生物质，作用时间为3-4.5h。作为优选，酶解过程中辅佐以搅拌操作。

进一步优选的，中性蛋白酶、纤维素酶，溶菌酶，几丁质酶的质量比为15:6:0.5:0.2。

作为优选，在25-40℃下进行酶解；更优选为28-35℃。

在本领域大多数的方案中，需要将发酵液干燥后用于制作饲料，在将干燥应用于本发明技术方案中时，按照本领域一般的干燥方法即可获得不错的效果。

作为优选，采用喷雾干燥或滤出菌体后真空干燥的方式对破壁结束后的发酵液进行干燥。

本发明中所提到的三孢布拉霉菌中可以只生产β-胡萝卜素或者番茄红素，也可以过通过调整阻断剂的方法使其菌体中同时含有β-胡萝卜素和番茄红素。

经过本发明方法制得的三孢布拉霉菌干菌体中类胡萝卜素总含量为3-10％。

本发明进一步提供本发明进一步提供经上述方法制备得到的三孢布拉霉菌。

本发明进一步提供上述三孢布拉霉菌在动物养殖中的应用，优选为在动物药品或饲料中的应用。

其中的动物指畜禽所涵盖的范围，偶蹄目下的包括猪、牛、羊等，禽类动物如鸡、鸭、鹅等。

本发明进一步提供一种饲料添加剂，含有所述的三孢布拉霉菌。

本发明进一步提供一种饲料，含有所述的三孢布拉霉菌。

优选的，所述三孢布拉霉菌的添加量为60～1000mg/kg日粮。

饲料中的其他成分可以是玉米、豆粕、苜蓿、燕麦草等常见日粮饲料成分，在此不做进一步限定。

本发明有益效果如下：

本发明提供了一种可用于饲料的“半破壁”的三孢布拉霉菌，并针对三孢布拉霉菌提供了一种特定的酶解破壁的方法，可以控制其细胞壁只是被部分破坏产生多个孔洞，但仍能保留完整或大部分完整的细胞结构的效果。尤其在经条件优化后，进一步使三孢布拉霉菌达到只是壁出现孔洞，但是细胞膜尽量完整的情况。通过上述制备方法，可以有效防止胞内有效物质的破坏，同时此种半破壁的菌体进入动物体内消化后有效成分容易释出，有利于动物的快速吸收。

本发明得到的三孢布拉霉菌可以作为饲料添加剂与其他日粮成分一同作为饲料应用于畜禽养殖业，能够提高养殖畜禽的抗炎症、抗氧化能力，同时提高其免疫力，其中针对禽类动物如蛋鸡，能够加深其蛋黄色度，提高其营养和经济价值。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

为了对比不同实施例与对比例的效果，以下实施方式中均使用保藏编号为CCTCCM2014378的三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)BT7251(+)和保藏编号为CCTCCM2014379的三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)BT7603(-)。

由于本发明主要目的在于考察三孢布拉霉的处理方法对于其中类胡萝卜素的影响和在动物体内的转化能力，所以以下实施例中三孢布拉霉在发酵中均不添加阻断剂，只考察β-胡萝卜素的应用情况。但值得注意的是，实际应用中三孢布拉霉产物并不限于β-胡萝卜素。

其发酵过程如下：

斜面培养：取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，于25℃恒温培养箱中培养5-7天。

种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌正、负菌株的PDA斜面培养基上用接种铲铲取一铲的正菌、负菌，再分别接种到含有150ml种子培养基的1000ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养48小时，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液。

发酵：三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液，按照正、负菌菌体质量比为1:1混合均匀，得到种子液混合液，以10％(体积比)接种量将该种子液混合液接入装有40ml发酵液的250ml三角瓶中，于25℃，180rpm条件下培养。

其中，斜面培养基(g/L)：葡萄糖20g/L，琼脂粉25g/L，去皮土豆200g/L；其配制方法可参考如下：将土豆切成1cm方块加入去离子水煮沸30分钟，冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加入葡萄糖和琼脂粉即可。

种子培养基(g/L)：葡萄糖10g/L，玉米淀粉30g/L，玉米浆干粉50g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖20g/L，玉米淀粉40g/L，酵母浸膏25g/L，黄豆饼粉40g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。

在发酵40h，添加浓度1mol/L的烟碱，使发酵液终浓度在0.05％-0.2％。

实施例1

在发酵结束后，调整温度为35℃，按108.5mg/每克生物质在发酵液中加入酶制剂，作用4h；

所述酶制剂为重量比为15:6:0.5:0.2的中性蛋白酶，纤维素酶，溶菌酶，几丁质酶。

酶解破壁结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

实施例2

在发酵结束后，调整温度为40℃，按75mg/每克生物质在发酵液中加入酶制剂，作用3h；

所述酶制剂为重量比为15:6:0.5:0.2的中性蛋白酶，纤维素酶，溶菌酶，几丁质酶。

酶解破壁结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

实施例3

在发酵结束后，调整温度为35℃，按127.5mg/每克生物质在发酵液中加入酶制剂，作用4h；

所述酶制剂为重量比为20:5:0.4:0.1的中性蛋白酶，纤维素酶，溶菌酶，几丁质酶。

酶解破壁结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

实施例4

在发酵结束后，调整温度为35℃，按106.5mg/每克生物质在发酵液中加入酶制剂，作用4h；

所述酶制剂为重量比为10:10:0.8:0.5的中性蛋白酶，纤维素酶，溶菌酶，几丁质酶。

酶解破壁结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

实施例5

在发酵结束后，调整温度为35℃，按108.5mg/每克生物质在发酵液中加入酶制剂，作用2h；

所述酶制剂为重量比为15:6:0.5:0.2的中性蛋白酶，纤维素酶，溶菌酶，几丁质酶。

酶解破壁结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

实施例6

在发酵结束后，调整温度为35℃，按108.5mg/每克生物质在发酵液中加入酶制剂，作用5h；

所述酶制剂为重量比为15:6:0.5:0.2的中性蛋白酶，纤维素酶，溶菌酶，几丁质酶。

酶解破壁结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

实施例7

在发酵结束后，调整温度为35℃，按118mg/每克生物质在发酵液中加入酶制剂，作用4.5h；

所述酶制剂为重量比为18:5:0.3:0.3的中性蛋白酶，纤维素酶，溶菌酶，几丁质酶。

酶解破壁结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

实施例8

在发酵结束后，调整温度为35℃，按108.5mg/每克生物质在发酵液中加入酶制剂，作用4h；

所述酶制剂为重量比为6:15:0.5:0.2的β-葡聚糖酶，纤维素酶，溶菌酶，几丁质酶。

酶解破壁结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

实施例9

在发酵结束后，调整温度为35℃，按30mg/每克生物质在发酵液中加入酶制剂，作用5h；

所述酶制剂为重量比为15:6:0.5:0.2的中性蛋白酶，纤维素酶，溶菌酶，几丁质酶。

酶解破壁结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

实施例10

在发酵结束后，调整温度为35℃，按150mg/每克生物质在发酵液中加入酶制剂，作用2h；

所述酶制剂为重量比为15:6:0.5:0.2的中性蛋白酶，纤维素酶，溶菌酶，几丁质酶。

酶解破壁结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

对比例1

在发酵结束后，调整温度为40℃，按10mg/每克生物质在发酵液中加入酶制剂，作用6h，每1h开动搅拌2-5分钟；

所述酶制剂为重量比为15:6:0.5:0.2的中性蛋白酶，纤维素酶，溶菌酶，几丁质酶。

酶解破壁结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

对比例2

在发酵结束后，调整温度为35℃，按200mg/每克生物质在发酵液中加入酶制剂，作用1.5h；

所述酶制剂为重量比为15:6:0.5:0.2的中性蛋白酶，纤维素酶，溶菌酶，几丁质酶。

酶解破壁结束后，采用喷雾干燥，得到干菌体。

对比例3

本对比例与实施例1的区别在于：三孢布拉霉发酵后将发酵液直接喷雾干燥得到干菌体。

对比例4

本对比例与实施例1的区别在于：三孢布拉霉发酵后，将发酵液进行喷雾干燥，再进行干法破壁，破碎后粒径小于100μm。

试验例1菌体中三孢布拉霉菌的稳定性

本试验例对实施例1-8以及对比例1-4所得到的三孢布拉霉菌干菌体所含有β-胡萝卜素稳定性比较。

稳定性考察方法具体为：将干菌体装入铝箔袋中密封在37℃的环境下，6个月后检测含量。

干菌体中β-胡萝卜素检测方法：

准确称取样品，破壁后用三氯甲烷反复提取，至样品完全无色，用环己烷定容。

采用紫外分光光度计在455nm处测定吸光度。

β-胡萝卜素含量计算公式如下，计算结果见表1：

其中：A-被测试样也吸光度值；

n-稀释倍数；

m-称取样品重量；

2500-β-胡萝卜素在环己烷中的百分吸光系数；

表1β-胡萝卜素含量变化

组别	初始含量	3个月含量	变化率
				实施例1	5.53	5.08	8.2％
实施例2	5.47	5.02	8.3％
				实施例3	6.25	5.72	8.5％
实施例4	5.84	5.33	8.8％
				实施例5	4.95	4.53	8.5％
实施例6	5.32	4.76	10.6％
				实施例7	6.17	5.23	14.8％
实施例8	5.20	4.77	8.2％
				实施例9	5.33	4.89	8.2％
实施例10	5.45	4.78	12.3％
				对比例1	5.50	4.99	9.3％
对比例2	4.82	3.94	18.2％
				对比例3	5.24	4.82	8.0％
对比例4	5.72	4.28	25.1％

由表1可知，6个月后，完全破壁后的对比例4的β-胡萝卜素的含量变化最大，而经过半破壁处理后，实施例1-10中β-胡萝卜素的氧化率在15％以内，与对比例4相比氧化率明显降低。当处理条件控制在较优的范围时其氧化率与未破壁干菌体相当。

试验例2促进动物吸收实验

(1)动物分组

选择230日龄、体况良好、体重相近的京粉1号商品蛋鸡，随机分为15个组，每组3个重复，每个重复7只鸡。其中，对照组饲喂基础日粮(玉米-豆粕型)，其他14组分别为实施例1～10和对比例1～4的处理组，按照日粮中20mg/kg的β-胡萝卜素的比例添加干菌体进行喂养。

(2)饲养管理

三层笼养，光照为16L:8D。自由饮水，自由采食。环境温度为20-27℃。

预试期为2周，预试期后3天内各组每日收集各组所产鸡蛋，蛋黄色度采用蛋品质指标分析仪(以色列ORKA)进行测定，结果计算其平均值。测定结果见下表2。

表2

组别	蛋黄颜色
		实施例1	10.73
实施例2	10.75
		实施例3	10.02
实施例4	10.23
		实施例5	8.89
实施例6	10.90
		实施例7	10.62
实施例8	8.84
		实施例9	9.30
实施例10	10.31
		对比例1	8.46
对比例2	10.83
		对比例3	8.14
对比例4	11.32
		对照组	7.56

从表2数据可知，采用本发明制备的三孢布拉霉菌的着色度与对照组相比差值都在1以上，颜色已经产生明显变化。直接用完全破壁的干菌体喂养蛋鸡时，其着色率能够达到11.32，采用优选的部分破壁方法处理后的三孢布拉霉干菌体的着色率能够达到与其相当的水平。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。