阅读说明：本技术 过瘤胃保护淀粉酶及其制备方法 (Rumen-protected amylase and preparation method thereof ) 是由 武瑞 刘春海 陶春卫 于 2019-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种过瘤胃保护淀粉酶及其制备方法。该过瘤胃保护淀粉酶由芯材和囊材两部分组成；囊材的主要成分为饱和脂肪酸、丙烯酸树脂IV或壳聚糖中任意一种或几种,丙烯酸树脂IV和壳聚糖不混合,芯材的主要成分为淀粉酶。制法：将淀粉酶进行干法制粒,低温烘干,流化；将熔融态的饱和脂肪酸、溶解于乙醇中的丙烯酸树脂IV或溶解于乙酸中的壳聚糖喷涂到颗粒表面,进行包被,制得过瘤胃保护淀粉酶。本发明使得淀粉酶在反刍动物的瘤胃中不易被降解,在4小时间里过瘤胃率仍达到90％以上,过瘤胃保护淀粉酶到达反刍动物的肠道中可有效释放,能够有效消化小肠内未被消化的淀粉,减少了酮病、亚临床酮病及脂肪肝病的发生,提高了产奶量。(The invention discloses a rumen protected amylase and a preparation method thereof. The rumen protected amylase consists of a core material and a capsule material; the main component of the capsule wall material is one or more of saturated fatty acid, acrylic resin IV and chitosan, the acrylic resin IV and the chitosan are not mixed, and the main component of the core material is amylase. The preparation method comprises the following steps: dry granulating amylase, drying at low temperature, and fluidizing; and spraying the saturated fatty acid in a molten state, the acrylic resin IV dissolved in ethanol or the chitosan dissolved in acetic acid on the surface of the granules for coating to prepare the rumen protected amylase. The invention ensures that amylase is not easily degraded in the rumen of the ruminant, the rumen bypass rate still reaches more than 90 percent within 4 hours, the amylase can be effectively released when the amylase reaches the intestinal tract of the ruminant after rumen bypass protection, the undigested starch in the small intestine can be effectively digested, the occurrence of ketosis, subclinical ketosis and fatty liver disease is reduced, and the milk yield is improved.)

过瘤胃保护淀粉酶及其制备方法

技术领域

本发明是关于反刍动物的营养物质领域，特别是关于一种过瘤胃保护淀粉酶及其制备方法。

背景技术

淀粉是由许多葡萄糖分子聚缩而成的高聚体，在淀粉酶的作用下能够转换成葡萄糖，是奶牛主要的能量来源，也是奶牛葡萄糖的主要来源。淀粉大部分由α-1，4糖苷键连接，少量由α-1，6糖苷键连接，以分子结构不同分为直链淀粉和支链淀粉两种。反刍动物由于瘤胃的发酵作用，对淀粉的消化和利用与单胃动物有根本区别。淀粉进入瘤胃后，首先被瘤胃微生物分解为挥发性脂肪酸(VFA)，未被分解的淀粉进入小肠为过瘤胃淀粉(RES)，在胰腺α-淀粉酶和粘膜寡糖酶的作用下水解为葡萄糖被吸收。瘤胃中降解的淀粉与过瘤胃到达小肠的淀粉相比，在小肠被消化吸收的淀粉能量利用率更高，淀粉在小肠的功能效率比瘤胃高42％。同时过瘤胃淀粉量的增加可使小肠消化的淀粉量增加，小肠中吸收的葡萄糖量也会相应增加，这样可以减少糖异生过程中所需要的氨基酸，有利于节约体内的氨基酸，促进体蛋白的沉积，Cameron等(1991)的研究结果发现日粮中添加淀粉可以增加进入小肠的蛋氨酸和精氨酸量。但过多的过瘤胃淀粉供应会降低淀粉的小肠消化率，造成能量损失。胰腺α-淀粉酶分泌不足是限小肠消化率的最关键因素。Philippeau等(1999b)认为，大量的淀粉逃脱小肠消化进入大肠发酵，提高在小肠消化的淀粉的数量具有一定的潜力。

但是，日粮中添加过多的淀粉可导致瘤胃发酵类型的改变，使丙酸产量增多，乙酸：丙酸比例偏低，从而影响纤维的正常消化及乳脂率的降低。增加过瘤胃淀粉可以防止瘤胃发酵不平衡，并保持较高的采食量，从而提高日粮能量的摄入；但过瘤胃淀粉在小肠的消化及小肠对葡萄糖的吸收能力是有限的。Huntington等(1997)报道奶牛小肠每日吸收葡萄糖的最大量为1300g。为了防止淀粉在后段消化道的过度发酵，也应该限制奶牛日粮中过瘤胃淀粉的最大量。生产中，为了提高奶牛、奶山羊的生产性能，给其饲喂过量的富含可发酵碳水化合物的饲料，导致发生瘤胃酸中毒等营养代谢病。通常认为，当瘤胃pH值降到5.5-5.0之间时，可能已发生亚急性瘤胃酸中毒(SARA)。与SARA并发的还有蹄叶炎等营养代谢病，这些疾病均降低生产性能。

淀粉是动物能量的主要来源，动物所需能量的60％-80％来自于饲料中的淀粉。淀粉酶是淀粉消化和吸收的关键酶。在饲料中添加淀粉酶，可以提高动物对淀粉的消化吸收，改善生产性能，提高饲料的利用率。淀粉酶是专门水解淀粉的一类酶。目前，人们对淀粉酶各方面的研究都取得了较大进展，除了动物生产行业，淀粉酶还普遍应用于造纸、纺织、医药、食品加工等行业。在动物生产行业中，淀粉酶主要被添加到动物饲料中，弥补动物体内淀粉酶的不足，从而可以提高饲料的利用率，降低养殖成本，还可减少养殖环境的污染。动物可以通过饲料获取人为添加的外源淀粉酶，其自身消化系统也可以分泌出内源消化酶。不论是外源淀粉酶还是内源淀粉酶，其都可以帮助动物消化饲料中的淀粉，增强动物机体的免疫能力，有利于动物的生长。

淀粉酶分类方式多样，最普遍的是依据淀粉水解形式的差异将其分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶和糖化酶，还可根据其来源以及水解生成的主要产物直接命名为相应的淀粉酶。四种常见的淀粉酶作用机理分别为：

①α-淀粉酶能作用于淀粉分子内部的任意α-1,4糖苷键，遇到α-1,6糖苷键时便越过其来断开α-1,4糖苷键；

②β-淀粉酶也可以断裂α-1,4糖苷键，然而其不可以断裂α-1,6糖苷键，且一碰到该键就立刻断绝反应。其可从淀粉分子的非还原性末端入手，依次断裂α-1,4糖苷键，最终生成麦芽糖；

③异淀粉酶可以特异水解支链淀粉中支叉部位的α-1,6糖苷键，将其转化成直链淀粉；

④糖化酶可作用于多种糖苷键，它不但能使α-1,4糖苷键断裂，还能水解α-1,3和α-1,6糖苷键。其依次切开α-1,4糖苷键的最终产物是β-D葡萄糖。

从动物消化生理特点来看，能真正发挥有效作用的淀粉酶应具备：(1)在动物体温(37-42℃)的条件下具有较高的活性；(2)最适pH值与消化道内食糜的pH值相一致；(3)对淀粉有较高的酶解效果(应是内切型淀粉酶)；

具有较好的稳定性，包括在饲料高温制粒过程中的稳定性、保存过程中的稳定性以及在动物消化道中对胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、金属离子等的耐受性。

由于反刍动物特殊的消化系统，对于酶制剂的利用受到瘤胃及瘤胃微生物的影响。此外，反刍动物日粮以粗饲料为主，粗纤维含量较高，因此反刍动物饲料中加入淀粉酶对反刍动物的消化功能影响不明显。王进波等(2000)的研究表明，日粮纤维含量较高时会导致动物内源消化酶活性降低，其原因主要是粗纤维与消化酶发生络合，进而阻碍了消化酶与底物之间的反应。所以普通淀粉酶应用于反刍动物日粮中，对提高反刍动物生产性能效果不明显。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种过瘤胃保护淀粉酶及其制备方法，所得过瘤胃保护淀粉酶能够使淀粉酶在瘤胃中不被降解，到达肠道中有效释放进一步提高肠道淀粉的消化率，给反刍动物提供更多的能量，提高增重或产奶量。

为实现上述目的，本发明提供了一种过瘤胃保护淀粉酶，由芯材和囊材两部分组成；所述囊材的主要成分为饱和脂肪酸、丙烯酸树脂IV或壳聚糖中任意一种或几种，其中，丙烯酸树脂IV和壳聚糖不混合，所述芯材的主要成分为淀粉酶。

在一优选的实施方式中，上述饱和脂肪酸的熔点在52℃以上且其中C16-C18饱和脂肪酸的质量百分比在70％以上；优选的，所述C16-C18饱和脂肪酸是棕榈油脂肪粉。

在一优选的实施方式中，上述C16-C18饱和脂肪酸选自硬脂酸及其盐、动植物来源氢化油类、动植物来源脂肪醇类中的任意一种。

在一优选的实施方式中，每1g上述过瘤胃保护淀粉酶中包含淀粉酶100U-5000U；

上述U的定义是：指酶活力国际单位，规定为：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个酶活力国际单位(IU，又称U)。

在一优选的实施方式中，上述淀粉酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、糖化酶中的任意一种。

本发明还提供了以上任一项所述的过瘤胃保护淀粉酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)将淀粉酶进行干法制粒，然后在60-75℃进行低温烘干；

(2)将饱和脂肪酸加热熔融，得到熔融态的饱和脂肪酸；将丙烯酸树脂IV溶解于乙醇中，得到溶解于95％乙醇中的丙烯酸树脂IV；将壳聚糖溶解于乙酸中，得到溶解于乙酸中的壳聚糖；然后，将处理后的饱和脂肪酸、丙烯酸树脂IV或壳聚糖中任意一种或几种作为囊材，其中丙烯酸树脂IV和壳聚糖不混合；

(3)将步骤(1)所得烘干颗粒加入到流化床中进行流化，将步骤(2)所得囊材喷涂到颗粒表面，进行包被，制得过瘤胃保护淀粉酶。

在一优选的实施方式中，在步骤(1)中，还可在淀粉酶中加入不含淀粉的其他成分进行混合，然后干法制粒；优选的，所述不含淀粉的其他成分是氨基酸；进一步优选的，所述氨基酸是赖氨酸。

在一优选的实施方式中，上述所述淀粉酶和氨基酸的质量比是1∶0-9。

在一优选的实施方式中，在步骤(1)中，在70℃进行低温烘干。

在一优选的实施方式中，在步骤(2)中，所述加热熔融的温度是80-100℃。

上述所得过瘤胃保护淀粉酶为颗粒状，直径为1mm左右，以利于快速通过瘤胃，并保证产品在饲料中的混合均匀度。

淀粉酶酶活定义：1g酶粉在pH＝6.0，60℃条件下，1小时液化1g可溶性淀粉为一个酶活力单位，以U/g表示。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明是将淀粉酶用微胶囊包膜技术制成过瘤胃的颗粒，其中，过瘤胃技术是利用物理或化学的方法把一些容易被瘤胃微生物破坏的营养物质保护起来使之不被瘤胃微生物分解，完好的通过瘤胃，到达皱胃和肠道中再释放出来，在小肠中发挥其作用，从而满足机体对营养物质的需求；本发明所得过瘤胃保护淀粉酶能够使得淀粉酶在反刍动物的瘤胃中不易被降解，在4小时间里，过瘤胃率仍达到90％以上，淀粉酶的包衣效果好。

(2)本发明所得过瘤胃保护淀粉酶到达反刍动物的肠道中可以有效释放，在2小时内的小肠释放率就达到了90％以上，8小时后，淀粉酶已经实现了100％的释放，因此，该过瘤胃保护淀粉酶能够有效消化小肠内未被消化的淀粉，进一步提高了反刍动物中肠道淀粉的消化率，给反刍动物提供了更多的能量，从而有效预防围产期反刍动物酮病，减少了酮病或亚临床酮病以及脂肪肝病的发生，减少了反刍动物产后失重，提高了反刍动物情期受胎率，提高了产奶量。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

以下实例所使用的α-淀粉酶购买自山东隆大生物工程有限公司；棕榈油脂肪粉购买自天津诺思特贸易有限公司。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。

实施例1：100单位/g的过瘤胃淀粉酶的制备方法

称取120克的2000单位/g的α-淀粉酶，加入到880克的赖氨酸粉中混合，在干法制粒机中干法制粒，70℃低温烘干，得到烘干颗粒；把1000克的棕榈油脂肪粉加热到100℃熔融，作为包材；将含淀粉酶的烘干颗粒放到流化床中流化，把熔融的包材冷却到80℃的喷涂在含淀粉酶的颗粒的表面，即得到100单位/g过瘤胃淀粉酶。

实施例2：400单位/g的过瘤胃淀粉酶的制备方法

称取480克的2000单位/g的α-淀粉酶，加入到520克的赖氨酸粉中混合，在干法制粒机中干法制粒，70℃低温烘干，得到烘干颗粒；把1000克的棕榈油脂肪粉加热到100℃熔融，作为包材；将含淀粉酶的烘干颗粒放到流化床中流化，把熔融的包材冷却到80℃的喷涂在含淀粉酶的颗粒的表面，即得到400单位/g的过瘤胃淀粉酶。

实施例3：2000单位/g的过瘤胃淀粉酶的制备方法

称取600克的8000单位/g的α-淀粉酶，加入到400克赖氨酸粉中混合，在干法制粒机中干法制粒，70℃低温烘干，得到烘干颗粒；把1000克的棕榈油脂肪粉加热到100℃熔融，作为包材；将含淀粉酶的烘干颗粒放到流化床中流化，把熔融的包材冷却到80℃的喷涂在含淀粉酶的颗粒的表面，即得到2000单位/g的过瘤胃淀粉酶。

实施例4：5000单位/g的过瘤胃淀粉酶的制备方法

称取1440克的10000单位/g的α-淀粉酶，在干法制粒机中干法制粒，70℃低温烘干，得到烘干颗粒；把560克的棕榈油脂肪粉加热到100℃熔融，作为包材；将淀粉酶烘干颗粒放到流化床中流化，把熔融的包材冷却到80℃的喷涂在淀粉酶颗粒的表面，即得到5000单位/g的过瘤胃淀粉酶。

实施例5：2000单位/g的过瘤胃淀粉酶的制备方法(囊材成分主要是丙烯酸树脂IV与饱和脂肪酸的混合物)

称取600克的8000单位/g的α-淀粉酶，在干法制粒机中干法制粒，70℃低温烘干，得到烘干颗粒；将500克的丙烯酸树脂IV溶解于乙醇中，将900克的棕榈油脂肪粉加热到100℃熔融；将含淀粉酶的烘干颗粒放到流化床中流化；把熔融的棕榈油脂肪粉冷却到80℃，与溶解于乙醇中的丙烯酸树脂IV进行混合，所得混合物作为囊材喷涂在含淀粉酶的颗粒的表面，即得到2000单位/g的过瘤胃淀粉酶。

实施例6：5000单位/g的过瘤胃淀粉酶的制备方法(囊材成分主要是丙烯酸树脂IV)

称取1200克的10000单位/g的α-淀粉酶，在干法制粒机中干法制粒，70℃低温烘干，得到烘干颗粒；将800克的丙烯酸树脂IV溶解于乙醇中；将含淀粉酶的烘干颗粒放到流化床中流化；将溶解于乙醇中的丙烯酸树脂IV作为囊材喷涂在含淀粉酶的颗粒的表面，即得到5000单位/g的过瘤胃淀粉酶。

实施例7：5000单位/g的过瘤胃淀粉酶的制备方法(囊材主要成分为壳聚糖)

称取1200克的10000单位/g的α-淀粉酶，在干法制粒机中干法制粒，70°℃低温烘干，得到烘干颗粒；将800克的壳聚糖溶解于乙酸中；将含淀粉酶的烘干颗粒放到流化床中流化；将溶解于乙酸中的壳聚糖作为囊材喷涂在含淀粉酶的颗粒的表面，即得到5000单位/g的过瘤胃淀粉酶。

实验例

为了验证本发明制备的过瘤胃淀粉酶的产品性能，运用体外法(In Vitro)模拟反刍动物消化道进行稳定性检验(模拟瘤胃环境：pH值6.6缓冲液、皱胃和十二指肠：pH值2.4缓冲溶液)和评价。

材料和方法

本研究采用pH值6.6、pH值2.4缓冲液分别模拟反刍动物瘤胃、皱胃和十二指肠的环境。

不同pH值缓冲溶液配方

表1不同pH值的缓冲溶液配方(单位：克)

将表中所列物质溶于少量蒸馏水中，定容至1000ml即可。

试验样品

样品A：实施例1制备的过瘤胃淀粉酶，淀粉酶含量：100单位/克；

样品B：实施例2制备的过瘤胃淀粉酶，淀粉酶含量：400单位/克；

样品C：实施例3制备的过瘤胃淀粉酶，淀粉酶含量：2000单位/克；

样品D：实施例4制备的过瘤胃淀粉酶，淀粉酶含量：5000单位/克；

每个样品3个生产批次，各400克，备用。

过瘤胃淀粉酶在不同pH值缓冲液中的稳定性检验

分别准确称取样品A、样品B、样品C、样品D各1.00g，放在50ml具塞试管底部，加入20ml缓冲液，盖紧试管塞；在39℃的恒温水浴摇床内消化2、4、8、12、24小时；取出后冲洗、过滤，滤液定容，测定滤液中的淀粉酶的含量，由此计算出淀粉酶的过瘤胃率和小肠释放率。每种包被过瘤胃淀粉酶在每个时间点设三个重复。

淀粉酶的检测方法：GB/T24401α-淀粉酶的测定方法

计算公式

产品过瘤胃率(W1)＝(1-A2)/A1×100％

式中：A1——产品中淀粉酶含量；

A2——产品在pH6.6缓冲溶液滤液中淀粉酶的含量。

产品小肠释放率(W2)＝A3/A1×100％

式中：A1——产品中淀粉酶含量；

A3——产品在pH2.4缓冲溶液滤液中淀粉酶的含量。

产品有效释放率＝W1×W2×100％

式中：W1——产品过瘤胃率；

W2——产品小肠释放率。

统计方法：采用SPSS 19.0进行数据分析。

结果分析

(1)各产品不同时间点的过瘤胃率(pH＝6.6)

表1pH＝6.6时各产品不同时间点的过瘤胃率(％)

时间	2h	4h	8h	12h	24h
						样品A	96.51	93.41	81.50	71.00	69.44
样品B	95.40	93.60	80.00	71.15	70.21
						样品C	93.90	92.13	79.90	68.20	65.20
样品D	94.10	92.32	74.30	68.13	64.20

通过用pH＝6.6的缓冲溶液模拟反刍动物的瘤胃环境，对各试验样品在39℃恒温水域床中进行培养，，得到表1中所列结果。从表1可以看出，各样品的过瘤胃率在相同时间点效果差异不大，且随着时间的延长，各样品在不同程度的缓慢释放；在4h前，过瘤胃率均达到90％以上，已达到食糜在瘤胃中停留时间，说明各样品包衣效果好，淀粉酶几乎没有在瘤胃中降解，未在瘤胃中受到较大破坏。

(2)各产品不同时间点的小肠释放率(pH＝2.4)

表2pH＝2.4时各产品不同时间点的小肠释放率(％)

时间	2h	4h	8h	12h	24h
						样品A	93.20	97.40	100.00	100.00	100.00
样品B	94.14	97.21	100.00	100.00	100.00
						样品C	93.30	97.02	100.00	100.00	100.00
样品D	94.24	98.10	100.00	100.00	100.00

通过用pH＝2.4的缓冲溶液模拟反刍动物的小肠环境，对各试验样品在39℃恒温水域床中进行培养，得到表2中所列结果。从表2可以看出，各样品在2h时内的小肠释放率就已经达到90％以上，8小时已100％释放，说明包衣材料能在反刍动物的小肠内消化分解，使得淀粉酶释放在小肠发挥作用，从而分解淀粉，为反刍动物的机体提供能量。

(3)各产品不同时间点的产品有效释放率(过瘤胃率/小肠释放率)

表3各产品不同时间点的有效释放率(％)

时间	2h	4h	8h	12h	24h
						样品A	89.95	90.98	81.50	71.00	69.44
样品B	89.81	90.99	80.00	71.15	70.21
						样品C	87.61	89.38	79.90	68.20	65.20
样品D	88.68	90.57	74.30	68.13	64.20

通过用pH6.6、pH2.4的缓冲溶液对各试验样品在39℃恒温水域床中培养，得到表3中所列结果。从表3可以看出，综合过瘤胃率和小肠释放率计算出各样品有效释放率，各样品在同一时间点有效释放率差异不大，同时各样品在各个时间点也相对稳定，表明各样品的制备方法和效果都较好。

本试验通过体外模拟反刍动物瘤胃液和小肠溶液的方法对四种过瘤胃淀粉酶产品进行体外培养，得出该四种产品在不同时间点的过瘤胃率、小肠释放率以及产品有效释放率。试验结果表明，本发明所得的过瘤胃淀粉酶的过瘤胃率、小肠释放率以及产品有效释放率性能稳定。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。