阅读说明：本技术 一种可提高畜禽饲料能量利用效率的复合酶技术及其应用 (Complex enzyme technology capable of improving energy utilization efficiency of livestock and poultry feed and application thereof ) 是由 宋全芳 余璐璐 李阳 严峰 彭翔 张广民 蔡辉益 于 2019-11-08 设计创作，主要内容包括：一种可提高畜禽饲料能量利用效率的复合酶及其应用,目的在于提高畜禽日粮能量利用效率。所述复合酶包括液态发酵酶,固态发酵复合酶和载体,所述复合酶以β-甘露聚糖酶为主,还包括木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶、纤维素酶。所述复合酶中β-甘露聚糖酶活性为4000-8000U/g,木聚糖酶活性为2000-4000U/g,β-葡聚糖酶活性为400-800U/g,果胶酶活性为200-1000U/g,纤维素酶300-600U/g。本发明所述复合酶在低能日粮中应用,可保持动物机体对能量的正常需要。本发明产品具有绿色,环保,无抗等优点,具有较高的推广应用价值。(A complex enzyme capable of improving the energy utilization efficiency of livestock and poultry feed and an application thereof, aiming at improving the energy utilization efficiency of livestock and poultry daily ration. The compound enzyme comprises liquid fermentation enzyme, solid fermentation compound enzyme and a carrier, and the compound enzyme mainly comprises beta-mannase, and also comprises xylanase, beta-glucanase, pectinase and cellulase. In the complex enzyme, the activity of beta-mannase is 4000-. The complex enzyme is applied to low-energy daily ration, and can keep the normal requirement of animal organism on energy. The product of the invention has the advantages of green, environmental protection, no resistance and the like, and has higher popularization and application values.)

一种可提高畜禽饲料能量利用效率的复合酶技术及其应用

技术领域

本发明属于饲料添加剂领域，具体涉及的是一种在低能日粮中应用可有效提高饲料能量利用效率的复合非淀粉多糖酶及其应用。

背景技术

近年来随着我国畜牧业的持续高速发展，主要饲料原料长期依赖进口的状况严重影响了我国饲料工业与养殖业的稳定与发展。我国有大量的谷物加工副产物(棉粕、菜籽粕、DDGS等)，开发利用这些非粮资源将是保障我国畜牧业持续健康发展的重要出路。但是这些副产物往往含有较高水平的非淀粉多糖(NSP)，其作为饲料中主要的抗营养因子存在，不仅限制了这些副产物在养殖业中的广泛使用，同时也阻碍了畜禽对营养物质的消化吸收。

非淀粉多糖(NSP)是植物组织中除淀粉、木质素以及少量寡糖之外的所有多糖碳水化合物的总称，主要包括纤维素、β-葡聚糖、***木聚糖、甘露聚糖和果胶等。β-甘露聚糖是广泛分布在玉米、豆粕、芝麻粕、椰子粕、棕榈粕等饲料原料中的一种对动物营养物质消化吸收有害的半纤维素，其中水溶性β-甘露聚糖是最具抗营养性的半纤维素，其抗营养作用远高于木聚糖和葡聚糖等，主要表现在：增加畜禽肠道食糜粘度，致使肠道内容物运动困难；阻碍消化酶与底物之间的相互作用，对养分的吸收产生物理性障碍，增加其吸水性；降低食糜向黏膜表层的扩散速度，从而极大的影响了营养物质的吸收利用；另外，β-甘露聚糖是一种病原相关分子结构，在肠道中可以被模式识别受体所识别，从而诱发多余的免疫应答。

目前市场上的复合酶多是以液态发酵的单酶组合而成。液态发酵是国内主流发酵方式，优势是生产效率高，灭菌充分等，但是液态发酵复配的复合酶很难达到野生状态微生物产生的天然的酶组合系统。固态发酵产生的酶种类丰富，与植物组织复杂性相适应，固态发酵更适合于饲料，在复杂的酶系统作用下，破坏复杂化学结构的天然植物细胞壁。目前国内对固态发酵酶与液态发酵酶的组合使用的研究较少，有研究表明固态发酵酶中补加液态发酵单酶对保育猪的日增重、采食量均有明显作用，生长性能和增重成本均优于液态发酵组合复合酶。

因此，发明人利用单胃动物仿生消化系统与肉鸡饲养试验在体外与体内对以β-甘露聚糖酶为主的复合酶与固态发酵复合酶进行组合效果研究，优化其比例组成。该发明可明显提高畜禽能量利用效率，降低畜禽生产成本，提高其生产性能。

发明内容

基于目前市场上能量类饲料原料的紧张，本发明的目的是提供了一种在畜禽日粮中应用提高饲料能量利用效率的饲料添加剂及其应用。本复合酶产品既能改善畜禽养殖环境，又能达到提高生产性能的目的。

本发明复合酶由液态发酵酶与固态发酵酶组合而成，所述液态发酵酶质量占比25-50％，固态发酵酶质量占比20-35％，玉米淀粉载体质量占比15-55％。

本发明所述复合酶，是将液态发酵的β-甘露聚糖酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶，纤维素酶与固态发酵复合酶按比例复配而成，复合酶中β-甘露聚糖酶活性为4000-8000U/g，木聚糖酶活性为2000-4000U/g，β-葡聚糖酶活性为400-800U/g，果胶酶活性为200-1000U/g，纤维素酶300-600U/g。

优选地，所述复合酶中β-甘露聚糖酶活性为5000U/g，木聚糖酶活性为3000U/g，β-葡聚糖酶活性为600U/g，果胶酶活性为600U/g，纤维素酶活性为400U/g。

所述复合酶中液态发酵酶，β-甘露聚糖酶活性为4000-8000U/g，木聚糖酶活性为1500-3500U/g，β-葡聚糖酶活性为200-700U/g，纤维素酶200-500U/g，优选地，β-甘露聚糖酶活性为5000U/g，木聚糖酶活性为2000U/g，β-葡聚糖酶活性为400U/g，纤维素酶300U/g。

所述复合酶中固态发酵酶木聚糖酶活性为3000-9000U/g，β-葡聚糖酶活性为500-1200U/g，果胶酶活性为1800-2500U/g，纤维素酶300-600U/g，优选地，木聚糖酶活性为4000U/g，β-葡聚糖酶活性为800U/g，果胶酶活性为2400U/g，纤维素酶400U/g。

本发明所述β-甘露聚糖酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶，纤维素酶均由酵母菌、黑曲霉、米曲霉、长柄木霉或枯草芽孢杆菌发酵产生，采用液态深层发酵工艺制备而成。

本发明所述固态发酵复合酶由酵母菌、黑曲霉、米曲霉、长柄木霉或枯草芽孢杆菌发酵产生，采用固态深层发酵工艺制备而成。

所述复合酶由上述多种单酶及固态发酵复合酶以优选配比组成；同时和使用纯固态发酵酶与纯液态发酵酶相比，本发明复合酶效果更为优异；上述复合酶组合是发明人通过大量仿生消化试验最终确定，对本发明效果有至关重要的影响。

本发明复合酶可应用于肉鸡的饲养过程中，更优选地，应用于肉鸡的低能日粮配方中。

本发明的一个优选实施方案中，上述复合酶的最终添加量为100-300克/吨全价饲料。

本发明复合酶在肉鸡低能日粮中应用，可明显降低饲料成本，且能提高肉鸡生产性能，本发明复合酶体外体内效果在低能日粮中应用均有显著效果，具有较强的经济应用效益，市场推广价值。

具体实施方式

实施例1

一种可提高畜禽饲料能量利用效率的复合非淀粉多糖酶，是将液态发酵的β-甘露聚糖酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶，纤维素酶与固态发酵复合酶按比例复配而成，所述复合酶中β-甘露聚糖酶活性为5000U/g，木聚糖酶活性为3000U/g，β-葡聚糖酶活性为600U/g，果胶酶活性为600U/g，纤维素酶活性为400U/g。

作为另外一种方案，β-甘露聚糖酶活性为5000U/g，木聚糖酶活性为2000U/g，β-葡聚糖酶活性为400U/g，纤维素酶300U/g。

作为另外一种方案，，木聚糖酶活性为4000U/g，β-葡聚糖酶活性为800U/g，果胶酶活性为2400U/g，纤维素酶400U/g。

本发明所述β-甘露聚糖酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶，纤维素酶均由酵母菌、黑曲霉、米曲霉、长柄木霉或枯草芽孢杆菌发酵产生，采用液态深层发酵工艺制备而成。

实施例2

体外评估低能日粮添加复合型非淀粉多糖酶对肉鸡料还原糖释放量及体外可消化能的影响

单胃动物仿生消化操作流程如下所述：

1、材料与方法

1.1仪器和设备

植物样品粉碎机或研钵；试验筛：孔径0.30mm(60目)；分析天平：分度值0.0001g；pH计：分度值0.01；恒温水浴锅；分光光度计；干燥器：无水氯化钙或变色硅胶为干燥剂；漩涡振荡器；单胃动物仿生消化系统(SDS-III)

1.2试剂和材料及处理方式

除特别注明者外，所有试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682-2008中三级水的规格。

胃蛋白酶(Sigma P7000)；淀粉酶(Sigma A3306)；胰蛋白酶(Amresco 0785)；糜蛋白酶(Amresco 0164)；盐酸(HCl)；氯化钠(NaCl)；氯化钾(KCl)；无水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)；无水磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)；磷酸(H₃PO₄)；氢氧化钠(NaOH)；山梨酸钾(C6H7KO2)；青霉素(160万U)；3,5-二硝基水杨酸(C₇H₄N₂O₇)；四水酒石酸钾钠(C₄H₄KNaO₆·4H₂O)；苯酚(C₆H₅OH)；无水亚硫酸钠(Na₂SO₃)；葡萄糖(Sigma G8270)；一次性使用注射器；0.22um滤膜；

胃缓冲液(pH 3.0)：称取2.59g氯化钠、0.25g氯化钾、6g无水磷酸二氢钠和1g山梨酸钾，放入500mL烧杯中，加入400mL去离子水溶解，并用2mol/L的盐酸(HCL)在39℃下调节溶液的pH至2.80。冷却后将上述溶液转入500mL容量瓶，并用去离子水定容。

小肠缓冲液：称取7.99g无水磷酸氢二钠，5.84g无水磷酸二氢钠，1.265g山梨酸钾，青霉素60万U。放入500mL烧杯中，加入180-200mL去离子水溶解，并用1mol/L的磷酸或1mol/L的氢氧化钠在39℃下调节溶液的pH至7.15。冷却后将上述溶液转入250mL容量瓶中，并用去离子水定容。

模拟胃液(胃蛋白酶活性737.5U/mL)根据模拟胃液中胃蛋白酶的浓度为737.5U/mL，称取184.38ku的胃蛋白酶溶解于250mL pH2.80的胃缓冲液中(39℃下标定pH)，缓慢搅拌直至溶解。勿在加热板上加热模拟胃液，或配制时过热。

模拟小肠液(淀粉酶活性221.43U/mL，胰蛋白酶活性69.10U/mL，糜蛋白酶活性8.68U/mL)：根据模拟肠液中这三种消化酶的活性，分别称(量)取淀粉酶41.41KU，胰蛋白酶12.82KU，糜蛋白酶1.62KU溶解于17mL去离子水中，并缓慢搅拌直至溶解。勿在加热板上加热，或配制时过热。

葡萄糖溶液(浓度C(C₆H₁₂O₆)，10.0mg/mL)：称取无水葡萄糖1.000g，加去离子水溶解，定容至100mL。

DNS显色液的配制

氢氧化钠溶液(浓度C(NaOH)200g/L):称取NaOH20.0g,去离子水溶解，定容至100mL。

称取3,5-二硝基水杨酸3.15g，加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃，然后逐步加入100mL NaOH溶液，同时不断搅拌，直到溶液澄清透明(注意：加入NaOH过程中，溶液温度不要超过48℃)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g，继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解，停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。储存在棕色瓶子中，避光保存，室温下放置7d后可以使用，有效期6个月。

1.3试样制备

1.3.1样品采集

按GB/T14699.1进行采样。

1.3.2样品处理

将采样的样品用四分法分至200g左右，用植物粉碎机或研钵将样品粉碎至过孔径0.30mm试验筛(60目)，封入样品袋密封存放，作为试样。

1.4测定步骤

1.4.1准备与上样

1.4.1.1用1000mL去离子水代替胃缓冲液、小肠前段缓冲液、小肠后段缓冲液放入单胃动物仿生消化系统的相应位置，并将系统的管道与缓冲液瓶连接好。

1.4.1.2在控制软件中，设置单胃动物仿生消化系统立式消化模块的预热时间为60min。待所有消化阶段的参数输入完毕后，运行模拟消化过程。

1.4.1.3在单胃动物仿生消化系统预热期间，进行下述上样工作。

1.4.1.4将特制的玻璃模拟消化管清洗干净，烘干。

1.4.1.5称取0.25-0.80g饲料样品(精确到0.0002g，)置于特制的玻璃模拟消化管中。同步测定样品的干物质含量。

1.4.2模拟鸡胃肠道消化

1.4.2.1胃模拟消化

1.4.2.1.1往消化管中加入10mL模拟胃液。

1.4.2.1.2将10根模拟消化器安装到单胃动物仿生消化系统的立式专用模块架上。

1.4.2.1.3将立式专用模块架置于单胃动物仿生消化系统中，按照模拟消化器下端进水，上端出水的原则，接好管路。每组5根模拟消化器间串联连接。消化液加液管与系统依次以快速接头相连，将电机的插头与电源相连接。

1.4.2.1.4在单胃动物仿生消化系统控制软件中，胃阶段模拟消化的参数为：温度39℃，蠕动泵转速180rpm/min，消化时间4h。其他控制参数按仪器说明书操作。

1.4.2.2小肠模拟消化

1.4.2.2.1在胃模拟消化结束时，6mL小肠缓冲液通过SDS-III的3号蠕动泵自动注入消化管中，然后将1.6mL模拟小肠液自动注入模拟消化管中。

1.4.2.2.2在单胃动物仿生消化系统控制软件中，小肠阶段模拟消化的参数为：温度39℃，蠕动泵转速180rpm/min，小肠消化时间为16h。其他控制参数按仪器说明书操作。

1.4.3消化残渣的处理

1.4.3.1消化结束后，将玻璃消化管内的消化液无损失地转移到200mL干净的容量瓶中，然后用去离子水定容，封口膜密封，摇匀备用(酶空白组不需要转移到容量瓶中，直接进行滤膜过滤)。

1.4.3.2从容量瓶中取30mL消化液，用一次性注射器吸取，通过0.22um滤膜过滤，滤液备用。

1.4.4葡萄糖标准曲线制作

1.4.4.1吸取去离子水4mL于25mL刻度试管中，加入DNS显色液5mL，沸水浴5min，自来水冷却至室温，去离子水定容至25mL(直接加16mL去离子水)，制成标准空白样。

1.4.4.2分别吸取10mg/mL的葡萄糖溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL，分别用去离子水定容至100mL，配制成浓度为0.10mg/mL～0.70mg/mL的葡萄糖标准溶液。

1.4.4.3分别吸取上述浓度的葡萄糖标准液各2mL(2个平行)，分别加到试管中，再加入2.0mL去离子水，混匀，加入5.0mL DNS试剂，混匀。沸水浴5min，自来水冷却至室温，加16mL去离子水，摇匀。以标准空白样为对照调零，在540nm处测吸光度OD值。

1.4.4.4以葡萄糖浓度为Y轴，吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。(每次新配置的DNS显色液需重新绘制标准曲线)。

1.4.5还原糖含量测定

1.4.5.1取定容后的消化液5mL于试管中，然后再加入5mL去离子水，进行2倍稀释。

1.4.5.2取2mL稀释后的消化液加到25mL刻度试管中，然后再加2mL去离子水，振荡混匀，加入5mL DNS显色液，混匀，沸水浴5min。自来水冷却至室温，加16mL去离子水，混匀。分光光度计540nm处测OD值(注意OD值应该在0.1-0.5之间)。

1.4.5.3根据测得的OD值及稀释倍数，代入葡萄糖标准曲线公式中，计算还原糖含量。

1.5结果计算

1.5.1计算公式

可消化碳水化合物总量(mg/g DM)＝((a×OD_测定+b)×2×200-(a×OD_空白+b)×17.6)/(w×DM)

式中：a为标准曲线回归系数；

b为标准曲线回归常数；

OD_测定为每个重复测定管的吸光度值；

OD_空白为消化酶空白管的吸光度值；

w为每个重复测定管饲料样品重量；

DM为饲料样品的干物质含量。

2、试验日粮

试验开始前，采集所用饲料原料，分析其常规养分含量，以实际检测结果进行饲料配方制作，各原料其它营养成分含量参照“中国饲料成分及营养价值表2017”，营养需要量参考NRC(1994)肉鸡饲养标准。其中日粮一为正常日粮代谢能：3000kcal/kg，日粮二为低能日粮代谢能：2950kcal/kg，日粮三为低能日粮代谢能：2900kcal/kg，组别设计为组别一为日粮一不加复合酶组，组别二为日粮二加复合酶0.15g/kg，组别三为日粮三加复合酶0.15g/kg，组别四为日粮三加复合酶0.3g/kg，每个组别5个重复，每个重复1根消化管，试验设计如表1所示：

本发明复合酶均由酵母及黑曲霉等经液体或固体发酵而成，生产流程均为常规工艺，在此不做赘述。复合酶包含β-甘露聚糖酶活性为5000U/g，木聚糖酶活性为3000U/g，β-葡聚糖酶活性为600U/g，果胶酶活性为600U/g，纤维素酶活性为400U/g。

表1试验设计

组别	试验日粮
		组别一	正常日粮ME：3000kcal/kg
组别二	低能日粮ME：2950kcal/kg+0.15g/kg复合酶
		组别三	低能日粮ME：2900kcal/kg+0.15g/kg复合酶
组别四	低能日粮ME：2900kcal/kg+0.30g/kg复合酶

数据分析采用SPSS17.0软件ANOVO模块单因素进行分析，P值＜0.05表示差异显著。试验结果如表2所示：

由表2可知，在代谢能ME为2950kcal/kg的日粮中添加0.15g/kg复合酶与正常日粮相比，对还原糖释放量无明显差异(P＞0.05)；在代谢能ME为2900kcal/kg的日粮中添加0.15g/kg复合酶与正常日粮相比，还原糖释放量明显降低，且差异显著(P＜0.05)；但在代谢能ME为2900kcal/kg的日粮中添加0.30g/kg复合酶与正常日粮相比，还原糖释放量可达到正常日粮水平(P＞0.05)。

表2在低能日粮中添加复合NSP酶对还原糖释放量的影响

组别	还原糖释放量(mg/g)
		组别一	577.36±3.35<sup>a</sup>
组别二	575.43±2.87<sup>a</sup>
		组别三	568.11±3.26<sup>b</sup>
组别四	579.68±4.37<sup>a</sup>

不同字母间表示差异显著(P＜0.05)。

实施例3在低能日粮中添加复合型非淀粉多糖酶对肉鸡生产性能的影响

1、试验动物

为了研究在低能日粮中添加复合型NSP酶对肉鸡生产性能的影响，选择1日龄肉仔鸡648只，按公母和体重随机分为3个处理，每个处理12个重复，每个重复18只鸡，试验阶段为42天，分两阶段进行饲喂。

2、试验日粮

试验开始前，采集所用饲料原料，分析其常规养分含量，以实际检测结果进行饲料配方制作，各原料其它营养成分含量参照“中国饲料成分及营养价值表2017”，营养需要量参考NRC(1994)肉鸡饲养标准。其中日粮一为正常日粮代谢能：3000kcal/kg，日粮二为低能日粮代谢能：2950kcal/kg，日粮三为低能日粮代谢能：2900kcal/kg，组别设计为组别一为日粮一不加复合酶组，组别二为日粮二加复合酶0.15g/kg，组别三为日粮三加复合酶0.15g/kg；试验设计如表3所示：

本发明复合酶均由酵母及黑曲霉等经液体或固体发酵而成，生产流程均为常规工艺，在此不做赘述。复合酶包含β-甘露聚糖酶活性为5000U/g，木聚糖酶活性为3000U/g，β-葡聚糖酶活性为600U/g，果胶酶活性为600U/g，纤维素酶活性为400U/g。

表3试验设计

组别	试验日粮
		对照组	正常日粮ME：3000kcal/kg
处理一组	低能日粮ME：2950kcal/kg+0.15g/kg复合酶
		处理二组	低能日粮ME：2900kcal/kg+0.15g/kg复合酶

3、饲养管理

饲养试验在北京挑战生物技术有限公司遵化动物试验基地进行，试验过程为常规饲养，自由采食与饮水，免疫和用药按照鸡场《免疫程序》和《用药指南》进行操作。

饲养试验分别于试验开始和结束时在早上空腹称重，试验过程中记录每日采食量，试验结束后计算肉鸡全阶段平均采食量，日增重及料肉比，数据分析采用SPSS17.0软件ANOVO模块单因素进行分析，P值＜0.05表示差异显著。试验结果如表4所示。

由表4可知，各处理之间平均日增重及平均日采食量差异均不显著(P＞0.05)，但处理一组与对照组相比日均采食量降低了5.46％；料肉比降低了1.78％(P＞0.05)，在肉鸡低能日粮中添加复合酶对肉鸡生产性能无明显影响，且对肉鸡料肉比有降低的趋势，从而降低生产成本。

表4在低能日粮中添加复合酶对肉鸡生产性能的影响

组别	对照组	处理一组	处理二组
				日均增重ADG(g)	50.51±2.73	50.79±2.05	51.34±1.97
日均采食量ADFI(g)	85.42±3.14	83.76±4.56	86.75±3.64
				料肉比FCR	1.69±0.06	1.65±0.05	1.69±0.05

本发明的研究结果显示，在低能日粮中添加本发明复合酶能明显改善畜禽生产性能，在低能日粮中应用能达到正常营养水平，明显提高对日粮的能量利用效率，改善肉鸡料肉比，节约生产成本。