阅读说明：本技术 一种抗蜜蜂麻痹病毒提取物及其制备方法 (Anti-bee paralysis virus extract and preparation method thereof ) 是由 侯春生 邓帅 杨卅 刁青云 王新玲 于 2019-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗蜜蜂麻痹病毒的组合物及其制剂与应用。该抗蜜蜂麻痹病毒的组合物,其特征在于,它由下述质量百分含量的组分组成：丹桂50-65％、八月桂25-35％,人参花5-25％。本发明的抗蜜蜂麻痹病毒的组合物适用于预防和治疗蜜蜂麻痹病及改善蜂群整体抗病毒能力。(The invention discloses a composition for resisting bee paralytic virus, and a preparation and application thereof. The composition for resisting the bee paralytic virus is characterized by comprising the following components in percentage by mass: 50-65% of cinnamon, 25-35% of Balaurel and 5-25% of ginseng flower. The composition for resisting the bee paralysis virus is suitable for preventing and treating the bee paralysis and improving the overall antiviral ability of bee colonies.)

一种抗蜜蜂麻痹病毒提取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗蜜蜂麻痹病毒提取物及其制备方法。

背景技术

蜜蜂是社会性昆虫，同其它畜禽动物一样，蜜蜂也受到细菌、真菌、病毒、寄生虫等多种病害的侵袭，在蜜蜂的多种病害中，蜜蜂病毒病是最为特殊且致病机制最复杂的一种。加之全球化的蜜蜂和蜂产品贸易，导致蜜蜂病敌害迅速在全球不同地区扩散，严重威胁蜜蜂健康。其中病毒病是目前为止流行最为严重的病害也是威胁蜜蜂群体健康的重要因素之一。虽然有的化学药物可用，但是药效并不显著也不能完全清除病毒，从而导致病毒很容易在蜂群中潜伏感染，在第二年春季再次大流行大爆发。

目前全球范围内可用防治蜜蜂麻痹病毒的机理主要是针对病毒RNA依赖的RNA聚合酶或解旋酶的抑制或阻断。当时能够降低病毒的快速增殖，但是病毒的最大特点是变异特别快，容易逃避寄主或药物的抵抗从而改变原有基因的序列，使得无法有效防治病毒病，且有污染蜜蜂产品的风险。

天然产物，一直以来被认为最广泛应用于药物研发或病害防控的原料，得益于其无毒无害无毒副作用，且容易降解不残留，最大程度发挥其天然产物功能分子的作用。

蜜蜂病毒病，尤其是麻痹病对蜜蜂危害最大的病害之一，昆虫病毒界仍未彻底解决此病毒，蜜蜂一旦感染，容易潜伏，造成极大的传染源与危害。

传统意义上，病毒病不像其他细菌病和寄生虫病一样有真正的治疗方法。但是随着分子生物技术在这一领域的快速发展，不断发现具有抗病毒特性的新物质。现有的药物不是毒副作用大不能长期使用，就是其配伍不精准，治标不治本，不能根除病毒，未能起到抑制蜜蜂麻痹病毒的扩散，从而造成蜂群免疫力低下，最后造成蜂群大量死亡。

发明内容

本发明是根据现代生物技术，再经长期的实验验证，采用新工艺制炼出来的，通过防治大量蜜蜂麻痹病毒引起的蜂群，证明了植物提取物在治疗蜜蜂急性麻痹病、以色列蜜蜂麻痹病、蜜蜂慢性麻痹病等病毒感染这个蜜蜂顽症中有巨大的潜力。

基于此，本发明的目的是提供一种用药配伍得当，以现代提取工艺保留原天然成份功效不变，具有抗病毒、增强免疫、提高蜂群健康等功效，适用于防治以色列蜜蜂麻痹病，蜜蜂急性麻痹病，蜜蜂慢性麻痹病的抗蜜蜂麻痹病毒组合物及其提取液与制剂，以及其制备方法。

本发明的抗蜜蜂麻痹病毒的组合物，由下述质量百分含量的组分组成：丹桂叶50-65％、八月桂叶25-35％，人参花5-25％。

作为本发明的优选方案，所述的抗蜜蜂麻痹病毒的组合物，它由下述质量百分含量的组分组成丹桂叶55％、八月桂叶30％，人参花15％。

本发明还提供一种抗蜜蜂麻痹病毒提取物。

本发明的抗蜜蜂麻痹病毒提取物是利用上述的组合物制成，所述抗蜜蜂麻痹病毒提取物的制备方法，包括：将所述人参花提取皂苷，然后与所述丹桂叶和八月桂叶粉末混合后获得抗蜜蜂麻痹病毒提取物。其中，利用人参花提取皂苷的方法是以60-75％乙醇溶液为溶剂进行浸提。丹桂叶和八月桂叶粉末是超微粉碎获得的，颗粒大小优选80目-120目。

在本发明的一个实施方式中，抗蜜蜂麻痹病毒提取物的制备方法，包括如下步骤：

1)将人参花用体积百分浓度为60-75％的乙醇溶液作溶剂进行浸提，等可溶性成分完全渗出，渗液回收乙醇，并在55℃下浓缩成相对密度为1.25-1.50的人参花提取液备用；人参花提取液的主要成分是皂苷。

2)丹桂叶、八月桂叶按80目-120目粉碎，过筛，备用；

3)将步骤2)丹桂叶和八月桂叶粉末以及步骤1)获得的皂苷提取液加入水中，混匀，过滤(80目-120目)，滤液在55℃下浓缩至相对密度为1.25-1.50的浓缩液，即为抗蜜蜂麻痹病毒提取物。

上述抗蜜蜂麻痹病毒提取物还可以制成胶囊、膏剂或喷剂。

本发明的抗蜜蜂麻痹病毒的组合物或抗蜜蜂麻痹病毒提取物在预防和治疗蜜蜂麻痹病中的应用，以及在改善蜂群整体抗蜜蜂麻痹病毒能力中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的抗蜜蜂麻痹病毒的组合物用药配伍得当，以现代提取工艺保留原天然成份功效不变，具有抗病毒、增强免疫、提高蜂群健康等功效，适用于防治以色列蜜蜂麻痹病，蜜蜂急性麻痹病，蜜蜂慢性麻痹病的抗蜜蜂麻痹病毒，效果优异。

附图说明

图1为实施例3的抗蜜蜂麻痹病毒的组合物的抗病毒实验效果。

图2为第五天与第六天死亡的蜂与空白对照组的检测结果比较。泳道5和6分别为第五与第六天的空白对照蜂样；泳道1，7是第五、六天病毒感染组蜂样；泳道4，8是第六天病毒感染组蜂样；泳道2，3是第五、六天病毒加抗病毒提取物剂量100μg/mL组蜂样；泳道9，10是第五、六天病毒组加抗病毒提取物剂量10μg/mL组蜂样；泳道11是第五天病毒加抗病毒提取物剂量50μg/mL组蜂样。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

本发明实施例中所用的材料如下：

丹桂叶：购自阿里巴巴网上商城，重量以干重计。

八月桂叶：购自阿里巴巴网上商城，重量以干重计。

人参花：购自阿里巴巴网上商城，重量以干重计。

实施例1、抗蜜蜂麻痹病毒的组合物及其提取物的制备

本实施例中，所述抗蜜蜂麻痹病毒的组合物，它由下述质量百分含量的组分组成丹桂叶50％、八月桂叶25％，人参花25％。

抗蜜蜂麻痹病毒的组合物的提取物的制备方法如下所述:

(1)按配方称取丹桂叶5克、八月桂叶2.5克，人参花2.5克，遴选干净材料并洗净，干燥，备用。将人参花用体积百分浓度为60％的乙醇溶液作溶剂进行浸提，等可溶性成分完全渗出，渗液回收乙醇，并在55℃下浓缩成相对密度为1.25-1.50的人参花提取液备用；人参花提取液的主要成分是皂苷。

(2)丹桂叶、八月桂叶按80目-120目粉碎，过筛，备用；

(3)将步骤2)丹桂叶和八月桂叶粉末以及步骤1)获得的皂苷提取液加入水中，混匀，过滤除去杂质，滤液在55℃下浓缩至相对密度为1.25-1.50的浓缩液，即为抗蜜蜂麻痹病毒提取物。

(4)将步骤(3)所得提取液混匀，制成混合提取液，最终制成胶囊、膏剂或喷剂。

实施例2、抗蜜蜂麻痹病毒的组合物及其提取物的制备

本实施例中，所述抗蜜蜂麻痹病毒的组合物，它由下述质量百分含量的组分组成丹桂叶60％、八月桂叶25％，人参花15％。

抗蜜蜂麻痹病毒提取物的制备方法如下所述:

(1)按配方称取丹桂叶6克、八月桂叶2.5克，人参花1.5克，遴选干净材料并洗净，干燥，备用。将人参花用体积百分浓度为75％的乙醇溶液作溶剂进行浸提，等可溶性成分完全渗出，渗液回收乙醇，并在55℃下浓缩成相对密度为1.25-1.50的人参花提取液备用；人参花提取液的主要成分是皂苷。

(2)丹桂叶、八月桂叶按80目-120目粉碎，过筛，备用；

(3)将步骤(2)丹桂叶和八月桂叶粉末以及步骤1)获得的人参花提取液加入水中，混匀，过滤除去杂质，滤液在55℃下浓缩至相对密度为1.25-1.50的浓缩液，即为抗蜜蜂麻痹病毒提取物。

(4)将步骤(3)所得提取液混匀，制成混合提取液，最终制成胶囊、膏剂或喷剂。实施例3、抗蜜蜂麻痹病毒的组合物及其提取物的制备

本实施例中，所述抗蜜蜂麻痹病毒的组合物，它由下述质量百分含量的组分组成丹桂55％、八月桂30％，人参花15％。

抗蜜蜂麻痹病毒的组合物的提取物的制备方法如下所述:

(1)按配方称取丹桂叶5.5克、八月桂叶3.0克，人参花1.5克，遴选干净材料并洗净，干燥，备用。将人参花用体积百分浓度为75％的乙醇溶液作溶剂进行浸提，等可溶性成分完全渗出，渗液回收乙醇，并在55℃下浓缩成相对密度为1.25-1.50的人参花提取液备用；人参花提取液的主要成分是皂苷。

(2)丹桂叶、八月桂叶按80目-120目粉碎，过筛，备用；

(3)将步骤(2)丹桂叶和八月桂叶粉末以及步骤1)获得的人参花提取液加入水中，混匀，过滤除去杂质，滤液在55℃下浓缩至相对密度为1.25-1.50的浓缩液，即为抗蜜蜂麻痹病毒提取物。

(4)将步骤(3)所得提取液混匀，制成混合提取液，最终制成胶囊、膏剂或喷剂。

实施例4、抗蜜蜂麻痹病毒的组合物的在预防和治疗蜜蜂麻痹病中的应用将实施例1-3制备的抗蜜蜂麻痹病毒提取物进行如下实验：

一、安全性实验

(1)将实施例1-3制备的抗蜜蜂麻痹病毒提取物以浓度为0.1μg/mL,10μg/mL,50μg/mL,100μg/mL and 500μg/mL为最终浓度加入到50％蔗糖溶液中饲喂健康的蜜蜂，每组蜜蜂30只，每个剂量3组，连续饲喂10天。

(2)另外有两组，一组为只饲喂PBS缓冲溶液作为阴性对照，另一组为只饲喂上述50％蔗糖溶液，作为空白对照。每天所有组都记录每组蜜蜂死亡个体数及死亡率。

结果表明，任何组均未发现个体死亡，此抗病毒药物对蜂群的健康不会造成影响。

二、抗病毒检测

(1)根据上面的实验数据，选取10μg/mL,50μg/mL,100μg/mL的量添加实施例1-3制备的抗蜜蜂麻痹病毒提取物作为实验剂量加入含病毒的50％蔗糖溶液饲喂蜜蜂作为三组实验组(表1中的病毒+D100(提取物浓度100μg/mL，图1中IAPV+D100)、病毒+D50(提取物浓度50μg/mL，图1中IAPV+D50)、病毒+D10(提取物浓度10μg/mL，图1中IAPV+D10))，另外有三组，一组为只饲喂PBS缓冲溶液作为阴性对照(PBS)，另一组为只饲喂入含病毒的50％蔗糖溶液，作为病毒组(IAPV)，第三组只饲喂不含病毒的的50％蔗糖溶液作为空白对照(ck)。上述实验组和空白组的病毒是通过超速离心获得，并以每微升含有约10¹²拷贝数添加到50％蔗糖溶液中进行饲喂。另外用已知之前已证明能够对蜜蜂麻痹病毒有抑制作用的蜂病毒一号药物，作为药物对照组。每天所有组都记录每组蜜蜂死亡率及死亡个体数。结果如图1所示。

(2)通过对死亡的蜜蜂采用荧光定量PCR与蛋白印迹杂交，荧光定量PCR检测麻痹病毒的前引物5'-CCAGCCGTGAAACATGTTCTTACC-3'和反向引物5'-ACATAGTTGCACGCCAATACGAGAAC-3'被用来扩增一个226-bp的片段。管家基因用β-actin 5'-TTGTATGCCAACACTGTCCTTT-3'和actin5'-TGGCGCGATGATCTTAATTT-3'分别为正向反向引物。其反应条件为95度3秒，60度30秒，72度20秒，40个循环。采用绝对定量的方法对所得数据进行计算。蛋白杂交检测为将蜜蜂研磨于含有0.2％的DTT和1uM的PMSF中，上清于15度下12500转，离心10分钟，然后200ul氯仿被加入后再在12500转下于4度10分钟。得到的蛋白煮沸3分钟后上样于SDS-PAGE胶上，于110V下跑胶约1个小时，而后用ECL检测试剂盒对麻痹病毒的壳蛋白VP3的抗体，将检测结果拍照并保存。荧光定量结果如表1所示，蛋白杂交检测部分结果如图2所示，结果发现病毒与药物处理组的蜜蜂感染病毒滴度明显低于病毒处理组的；并且有的病毒与药物处理的蜜蜂经过5或7天后不能检测到其表达蛋白。表明有较好的病毒抑制效果。

表1.荧光定量测量病毒滴度结果

实施例5、抗蜜蜂麻痹病毒组合物在改善蜂群整体抗蜜蜂麻痹病毒能力中的应用。

根据上面的实验数据，选取10μg/mL,50μg/mL,100μg/mL作为实验剂量，将含终浓度为10μg/mL,50μg/mL,100μg/mL实施例3制备的抗蜜蜂麻痹病毒提取物的蔗糖溶液饲喂蜜蜂作为实验组(表2-4中的病毒+D100、病毒+D50、病毒+D10)，另外有三组，一组为只饲喂PBS缓冲溶液作为阴性对照，另一组为只饲喂正常的糖水，作为空白对照。另外用已知之前已证明能够对蜜蜂麻痹病毒有抑制作用的蜂病毒一号药物，作为药物对照组。每组有3群蜂，每群约7框蜂。处理组每7天饲喂一次，共计喂2次，观察20天。每天所有组都记录每组蜂箱前死亡个体数及蜜蜂死亡率。每天清晨清扫蜂箱前死蜂，并记录有出现麻痹症状的蜂数。

通过对死亡的蜜蜂采用荧光定量PCR的方法，计算抗病毒药物的抑制作用，结果如表2所示，发现病毒与药物处理组的蜜蜂感染病毒滴度明显低于病毒处理组的。同时测定有表现麻痹症状的蜂与健康的比较，结果如表3和表4所示，有存活力差异，表明有较好的病毒抑制效果。荧光定量PCR检测麻痹病毒的前引物5'-CCAGCCGTGAAACATGTTCTTACC-3'和反向引物5'-ACATAGTTGCACGCCAATACGAGAAC-3'被用来扩增一个226-bp的片段。管家基因用β-actin 5'-TTGTATGCCAACACTGTCCTTT-3'和actin5'-TGGCGCGATGATCTTAATTT-3'分别为正向反向引物。其反应条件为95度3秒，60度30秒，72度20秒，40个循环。采用绝对定量的方法对所得数据进行计算。

表2.荧光定量结果

表3.存活率

表4.有麻痹症状的蜂数比较