阅读说明：本技术 化合物及其作为脂肪酸合酶活性探针上的应用 (Compounds and their use as probes for fatty acid synthase activity ) 是由 周怡青 石悦 徐悦 邓张双 许静远 李文龙 于 2019-10-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种化合物及其作为脂肪酸合酶活性探针上的应用。并公开了一种评估潜在的脂肪酸合酶抑制剂在哺乳动物中的效力的方法,其步骤包括：A、将待评估的脂肪酸合酶抑制剂施用于哺乳动物中；B、将权利要求1-3任一项所述的化合物施用于该哺乳动物或从该哺乳动物分离的细胞中；C、测量所述化合物的报告物部分的活性,将报告物部分的活性与标准进行比较,得到脂肪酸合酶抑制剂在哺乳动物中的效力。本发明提供一种针对脂肪酸合酶(FAS)的高选择性探针,能够选择性地标记FAS并提供在活细胞中直接测量FAS活性及抑制剂的靶结合效力。(The invention discloses a compound and application thereof as a fatty acid synthase activity probe. And a method of assessing the efficacy of a potential fatty acid synthase inhibitor in a mammal comprising the steps of: A. administering a fatty acid synthase inhibitor to be evaluated into a mammal; B. administering a compound of any one of claims 1-3 to the mammal or to a cell isolated from the mammal; C. measuring the activity of the reporter moiety of the compound and comparing the activity of the reporter moiety to a standard to obtain the efficacy of the fatty acid synthase inhibitor in the mammal. The present invention provides a highly selective probe for Fatty Acid Synthase (FAS), capable of selectively labeling FAS and providing direct measurement of FAS activity and the target binding potency of inhibitors in living cells.)

化合物及其作为脂肪酸合酶活性探针上的应用

技术领域

本发明属于医药检测领域，更具体的涉及一种可作为脂肪酸合酶活性探针的化合物及其应用。

背景技术

3-脂肪酸合酶(Fatty Acid Synthase，FAS)是催化乙酰CoA和丙二酰CoA合成内源性长链脂肪酸的关键酶，在正常情况下主要表达于脑、肺、肝脏、脂肪、泌乳期乳腺等组织中。

脂肪酸合酶(FAS)在能量代谢中发挥着重要作用。作为脂肪合成中最关键的酶，抑制FAS可以显著减少脂肪的合成代谢，因而抑制FAS是治疗肥胖的有效策略之一。与此同时，FAS抑制剂还具有其令人瞩目的抗癌作用，它能通过控制癌细胞增殖产生的脂肪酸来消灭癌细胞。因此，FAS抑制剂可能为治疗肥胖和癌症提供新的途径，对FAS抑制剂的研究有望为肥胖和癌症的治疗提供新的靶点。

近20年内，有大量FAS抑制剂被设计合成并报道。但所有评估FAS抑制剂效力及FAS活性评价的方法局限于体外生化实验，还没有在活体内直接检测FAS活性及评价FAS抑制剂动力学的方法被报道。

活性探针通常包括三个组成部分：识别基团、反应基团和报告基团(Annu.Rev.Biochem.2008,77,383-414.)。所述识别基团将探针导入所靶向蛋白的结合口袋里并促进所述反应基团与生物分子之间的共价键的形成。所述报告基团提供鉴别复杂蛋白质组内与探针结合的蛋白的便利手段。

奥利司他(Orlistat)是目前唯一通过FDA认证的上市FAS抑制剂。Yao等人开发了基于Orlistat的分子探针用于FAS标记及成像。但是，由于奥利司他脱靶效应较大，该探针同时共价标记几十个蛋白，因此其选择性限制了该探针的进一步应用(J.Am.Chem.Soc.2010,132,656-666)。

氟磷酸酯探针用于丝氨酸水解酶标记。研究发现该探针亦能在体外标记FAS蛋白。但是鉴于该探针主要标记丝氨酸水解酶，其选择性同样存在问题。而且该探针在体内不稳定，目前尚无活体标记和成像的报道(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999,96,14694-14699)。

PF-yne探针的结构与本申请的化合物相近，曾被报道共价修饰日本血吸虫sjGST蛋白的酪氨酸111残基，因此可以用于GST融合蛋白的标记和固定化，但该探针在哺乳动物蛋白质组中的结合情况并不清楚(Chem.Commun.2018,54,4661-4664)。

靶结合(Target engagement)是指预期生物靶标被药物分子占据(Nat.Rev.DrugDiscov.2006,5,730-739)。这一信息在活体内的药代动力学研究，特别是对于在分子水平建立表型观察结果和抑制剂-生物分子相互作用之间的关联性而言是至关重要的。同时，在临床试验中分子探针在确定患者的合适药物剂量方面起到重要的作用。

检查药物分子的靶结合的测定法的一般方案如下：通过顺序添加抑制剂和探针到生物样品(细胞、组织等)中，探针标记的条带的强度将给出未被抑制剂占据的那些生物靶标的直接读出。随着抑制剂的浓度增加，条带强度的降低指示一部分生物靶标被抑制剂结合(Annu.Rev.Biochem.2008,77,383-414)。

发明内容

1、发明目的。

本发明提供一种针对脂肪酸合酶(FAS)的高选择性探针。

2、本发明所采用的技术方案。

一种化合物在作为脂肪酸合酶活性探针上的应用，其通式如式(I)所示：

其中：

R₁为报告基团，是苯基的任选取代基，选自标记物、染料、光交联剂、细胞毒性化合物、药物、活性标记物、光活性标记物、反应性化合物、抗体或抗体片段、生物材料、纳米粒子、自旋标记物、荧光团、含金属部分、炔基、叠氮基、放射性部分、新型官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼蔽部分、光化辐射易激部分、配体、可光异构化部分、生物素、生物素类似物、掺入重原子的部分、可化学裂解的基团、可光解的基团、氧化还原剂、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光性基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、***基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记物或其组合；

式(1)中的氟代磷酸酯为反应基团；

反应基团和报告基团以外的部分为识别基团，其中：

R₂是苯基的任选取代基，选自卤素，NH₂-、CN-，OH-，HS-，-NO₂，-CF₃，-COOH，CH₃CO-，(C_1-10烷基)-COO-，-O-C_1-10烷基，C_1-10烷基-、C_2-10烯基-、C_2-10炔基-；

连接部位选自键、任选取代的烷基部分、任选取代的杂环部分、任选取代的酰胺部分、酮部分、任选取代的氨基甲酸酯部分、酯部分或其组合。

优选的，其结构式为：

还包括上述的化合物在药学上可接受的盐在作为脂肪酸合酶活性探针上的应用。

本发明还公开了一种评估潜在的脂肪酸合酶抑制剂在哺乳动物中的效力的方法，其步骤包括：

A、将待评估的脂肪酸合酶抑制剂施用于哺乳动物中；

B、将上述的化合物施用于该哺乳动物或从该哺乳动物分离的细胞中；

C、测量所述化合物的报告物部分的活性，将报告物部分的活性与标准进行比较，得到脂肪酸合酶抑制剂在哺乳动物中的效力。

3、本发明所产生的技术效果。

本发明提供一种针对脂肪酸合酶(FAS)的高选择性探针，能够选择性地标记FAS并提供在活细胞中直接测量FAS活性及抑制剂的靶结合(Target engagement)效力。

附图说明

图1：探针1(Probe 1)在HeLa细胞裂解液中浓度依赖地标记一个250～300kDa的高分子量蛋白条带。左图：荧光扫描；右图：考马斯亮蓝染色。

图2：探针1(Probe 1)在HeLa细胞裂解液标记条带的富集和鉴定。(A)银染检测探针1在HeLa细胞裂解液中的富集蛋白；(B)质谱分析；(C)利用FAS抗体验证探针1富集蛋白。

图3：探针1(Probe 1)在HeLa细胞中浓度依赖地标记FAS蛋白。(A)荧光扫描和考马斯亮蓝染色；(B)基于荧光定量确定探针1选择性标记FAS的浓度区间。

图4：探针1(Probe 1)在HeLa细胞中时间依赖地标记FAS蛋白。(A)荧光扫描和考马斯亮蓝染色；(B)荧光条带定量分析。

图5：探针1在各种细胞中选择性标记FAS蛋白。左图：荧光扫描；右图：考马斯亮蓝染色。

图6：利用探针1评估FDA认证的上市FAS抑制剂药物奥利司他的细胞内动力学过程。

具体实施方式

探针1的结构式为：

合成路径见文献(Chem.Commun.2018,54,4661-4664)：

生物实验:

基于凝胶电泳荧光扫描的HeLa细胞裂解液标记

在反应缓冲液(50mM HEPES,pH 7.4,150mM NaCl,5mM MgCl₂)中将HeLa细胞裂解液稀释至5μg/μL的最后浓度并且在室温下用0.01～10μM探针1培养1小时。蛋白样品中加入终浓度1％SDS后进行"click"反应：对于每次反应，将19.2μL的蛋白样品添加到各自0.2μL的TAMRA-N₃(10mM在DMSO中的储液，Lumiprobe)、CuSO₄(100mM在水中的储备液)、THPTA(10mM在水中的储备液，Sigma)和抗坏血酸钠(100mM在水中的储备液)。将样品在室温下在黑暗中培养1小时。然后通过添加5μL 4×SDS加样缓冲液(Invitrogen)并且在95℃煮沸15分钟使反应结束。将样品施加到NUPAGE 12％Bis-tris变性凝胶(Invitrogen)并且用4600SF成像系统(上海天能)进行凝胶内荧光扫描。如图1所示，探针1可以浓度依赖地在HeLa细胞裂解液中标记一个250～300kDa的大分子量蛋白。

探针1标记的高分子量蛋白的富集与鉴定

在反应缓冲液(50mM HEPES,pH 7.4,150mM NaCl,5mM MgCl₂)中将HeLa细胞裂解液稀释至5μg/μL的最后浓度并且在室温下分别用DMSO或1μM探针1培养1小时。蛋白样品中加入终浓度1％SDS后进行"click"反应：对于每次反应，将300μL的蛋白样品添加到各自3μL的Biotin-N₃(100mM在DMSO中的储液，Biomatrix)、CuSO₄(100mM在水中的储备液)、THPTA(10mM在水中的储备液，Sigma)和抗坏血酸钠(100mM在水中的储备液)。将样品在室温下避光培养1小时。依次加入0.6mL甲醇，0.15mL氯仿以及0.4mL水使蛋白沉淀，混匀后14000g离心5分钟，收集沉淀，并用0.5mL甲醇洗涤沉淀，风干。加入200μL PBS，1％SDS使蛋白复溶，再加入含有50μLStreptavidin Sepharose树脂的200μL PBS，室温孵育2小时。依次0.5mL PBS(3次)，PBS+0.5M NaCl(3次)，PBS(1次)，去离子水(1次)洗涤，然后通过添加30μL 4×SDS加样缓冲液(Invitrogen)并且在95℃煮沸15分钟使树脂上结合的蛋白洗脱。将样品施加到NUPAGE 4～12％Bis-tris变性凝胶(Invitrogen)并且用银染显色。如图所示，探针1成功富集到前述实验所标记之大分子量蛋白。将该条带切下后进行胶内酶切，通过质谱鉴定为人脂肪酸合酶(Fatty acid synthase,FAS)。同时将洗脱样品经由NUPAGE 4～12％ Bis-tris变性凝胶(Invitrogen)分离后，转移至PVDF膜，利用FAS抗体验证质谱结果。图2显示探针1所富集之高分子量蛋白确实是FAS。

基于凝胶电泳荧光扫描的HeLa活细胞标记(探针浓度梯度)

HeLa细胞培养于无血清DMEM培养基中。加入终浓度为0.1～10μM探针1并在37℃培养1小时。加入裂解液(50mM HEPES,pH 7.4,150mM NaCl,0.1％Triton X-100,5mM MgCl₂)将K562细胞裂解，并将裂解液液稀释至5μg/μL的最后浓度。蛋白样品中加入终浓度1％SDS后进行"click"反应：对于每次反应，将19.2μL的蛋白样品添加到各自0.2μL的TAMRA-N₃(10mM在DMSO中的储液，Lumiprobe)、CuSO₄(100mM在水中的储备液)、THPTA(10mM在水中的储备液，Sigma)和抗坏血酸钠(100mM在水中的储备液)。将样品在室温下在黑暗中培养1小时。然后通过添加5μL 4×SDS加样缓冲液(Invitrogen)并且在95℃煮沸15分钟使反应结束。将样品施加到NUPAGE 12％Bis-tris变性凝胶(Invitrogen)并且用4600SF成像系统(上海天能)进行凝胶内荧光扫描。如图3所示，探针1可以浓度依赖地在HeLa细胞中选择性标记FAS，在100nM～1μM范围内探针1选择性标记单一FAS蛋白条带。

基于凝胶电泳荧光扫描的HeLa活细胞标记(孵育时间梯度)

HeLa细胞培养于无血清RPMI培养基中。加入终浓度为0.1μM探针1并在37℃培养5分钟至2小时不等。加入裂解液(50mM HEPES,pH 7.4,150mM NaCl,0.1％Triton X-100,5mMMgCl₂)将HeLa细胞裂解，并将裂解液液稀释至5μg/μL的最后浓度。蛋白样品中加入终浓度1％SDS后进行"click"反应：对于每次反应，将19.2μL的蛋白样品添加到各自0.2μL的TAMRA-N₃(10mM在DMSO中的储液，Lumiprobe)、CuSO₄(100mM在水中的储备液)、THPTA(10mM在水中的储备液，Sigma)和抗坏血酸钠(100mM在水中的储备液)。将样品在室温下在黑暗中培养1小时。然后通过添加5μL 4×SDS加样缓冲液(Invitrogen)并且在95℃煮沸15分钟使反应结束。将样品施加到NUPAGE 12％Bis-tris变性凝胶(Invitrogen)并且用4600SF成像系统(上海天能)进行凝胶内荧光扫描。如图4所示，100nM探针1可以时间依赖地在HeLa细胞中选择性标记FAS蛋白，30分钟即能达到饱和标记。

基于凝胶电泳荧光扫描的各种细胞标记

HeLa，MCF-7，HCT116，HepG2，Hep3B，K562，BJAB，Jurkat，HEK293T细胞培养于无血清DMEM/RPMI培养基中。加入终浓度为100nM探针1并在37℃培养1小时。加入裂解液(50mMHEPES,pH 7.4,150mM NaCl,0.1％Triton X-100,5mM MgCl₂)将HeLa细胞裂解，并将裂解液液稀释至5μg/μL的最后浓度。蛋白样品中加入终浓度1％SDS后进行"click"反应：对于每次反应，将19.2μL的蛋白样品添加到各自0.2μL的TAMRA-N₃(10mM在DMSO中的储液，Lumiprobe)、CuSO₄(100mM在水中的储备液)、THPTA(10mM在水中的储备液，Sigma)和抗坏血酸钠(100mM在水中的储备液)。将样品在室温下在黑暗中培养1小时。然后通过添加5μL 4×SDS加样缓冲液(Invitrogen)并且在95℃煮沸15分钟使反应结束。将样品施加到NUPAGE12％Bis-tris变性凝胶(Invitrogen)并且用4600SF成像系统(上海天能)进行凝胶内荧光扫描。如图5所示，100nM探针1可以在所测细胞中选择性标记FAS蛋白。

基于凝胶电泳荧光扫描的FAS抑制剂奥利司他(Orlistat)的靶结合测定

检查探针1能否测量活细胞中FAS被抑制剂占据的程度。检查了已上市的FAS药物奥利司他。HeLa细胞培养于无血清DMEM培养基中。细胞首先用不同浓度的奥利司他在37℃孵育60分钟，接着用100nM的探针1孵育30分钟。加入裂解液(50mM HEPES,pH 7.4,150mMNaCl,0.1％Triton X-100,5mM MgCl₂)将HeLa细胞裂解，并将裂解液液稀释至5μg/μL的最后浓度。蛋白样品中加入终浓度1％SDS后进行"click"反应：对于每次反应，将19.2μL的蛋白样品添加到各自0.2μL的TAMRA-N₃(10mM在DMSO中的储液，Lumiprobe)、CuSO₄(100mM在水中的储液)、THPTA(10mM在水中的储液，Sigma)和抗坏血酸钠(100mM在水中的储液)。将样品在室温下在黑暗中培养1小时。然后通过添加5μL 4×SDS加样缓冲液(Invitrogen)并且在95℃煮沸15分钟使反应结束。将样品施加到NUPAGE 12％Bis-tris变性凝胶(Invitrogen)并且用4600SF成像系统(上海天能)进行凝胶内荧光扫描。如图6A所示，奥利司他在50μM时有效阻断探针1对FAS的标记。

类似的，检查探针1能否测量活细胞中FAS被抑制剂占据的程度。检查了已上市的FAS药物奥利司他。HeLa细胞培养于无血清DMEM培养基中。细胞首先用50μM的奥利司他在37℃孵育不同时间，接着用100nM的探针1孵育30分钟。加入裂解液(50mM HEPES,pH 7.4,150mM NaCl,0.1％Triton X-100,5mM MgCl₂)将HeLa细胞裂解，并将裂解液液稀释至5μg/μL的最后浓度。蛋白样品中加入终浓度1％SDS后进行"click"反应：对于每次反应，将19.2μL的蛋白样品添加到各自0.2μL的TAMRA-N₃(10mM在DMSO中的储液，Lumiprobe)、CuSO₄(100mM在水中的储液)、THPTA(10mM在水中的储液，Sigma)和抗坏血酸钠(100mM在水中的储液)。将样品在室温下在黑暗中培养1小时。然后通过添加5μL 4×SDS加样缓冲液(Invitrogen)并且在95℃煮沸15分钟使反应结束。将样品施加到NUPAGE 12％Bis-tris变性凝胶(Invitrogen)并且用4600SF成像系统(上海天能)进行凝胶内荧光扫描。如图6C所示，50μM奥利司他在60分钟后有效阻断探针1对FAS的标记。

基于荧光共聚焦显微镜活细胞原位标记的奥利司他靶结合测定

HeLa细胞培养于无血清DMEM培养基中。细胞首先用不同浓度的奥利司他在37℃孵育1小时，接着用100nM的探针1并在37℃培养箱孵育0.5小时。PBS洗三遍，在冰上加入含有0.4％多聚甲醛的PBS固定10分钟，PBS洗三遍，加入含有0.5％Triton X-100的PBS使细胞膜穿透。PBS洗三遍后，加入含有各自0.2μL的TAMRA-N₃(10mM在DMSO中的储液，Lumiprobe)、CuSO₄(100mM在水中的储备液)、THPTA(10mM在水中的储备液，Sigma)和抗坏血酸钠(100mM在水中的储备液)的1mL PBS,避光孵育1小时。PBS洗5遍后，加入DAPI染料孵育30分钟，再用PBS洗3遍后，利用Leica TSC SP8 STED 3X超高分辨率激光扫描共聚焦显微镜成像。如图6B结果所示，60分钟孵育条件下，奥利司他在50μM时有效阻断探针1对FAS的标记。如图6D结果所示，50μM的奥利司他在60分钟后有效阻断探针1对FAS的标记。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。