一种人源化纳米抗体及其制备方法
阅读说明：本技术 一种人源化纳米抗体及其制备方法 (Humanized nano antibody and preparation method thereof ) 是由 纪雪梅 刘煜 赵明军 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药领域,具体公开了一种抗TNFα纳米抗体的人源化改造方法,本发明公开的人源化改造的抗TNFα纳米抗体核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示,氨基酸序列如SEQ.ID.NO.12；其改造方法包括以下步骤：确定FR2区三种关键氨基酸单突变与联合突变,核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1,3,5,7,9所示,氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2,4,6,8,10所示；进一步多重序列对比确定人源化方案；通过上述得到人源化抗TNFα纳米抗体；经酵母表达系统表达。本发明改造的人源化抗TNFα纳米抗体,能保留较高的抗原亲和力,热稳定性以及生物活性,为今后人源化纳米抗体的疾病治疗药物的开发奠定基础。(The invention relates to the field of biomedicine, and particularly discloses a humanized modification method of an anti-TNF alpha nano antibody, wherein the nucleotide sequence of the humanized modified anti-TNF alpha nano antibody is shown as SEQ ID No.11, and the amino acid sequence is shown as SEQ ID No. 12; the transformation method comprises the following steps: determining single mutation and combined mutation of three key amino acids in FR2 region, wherein the nucleotide sequence is shown as SEQ ID No.1, 3, 5, 7 and 9, and the amino acid sequence is shown as SEQ ID No.2, 4, 6, 8 and 10; further multiple sequence alignment to determine a humanization scheme; obtaining the humanized anti-TNF alpha nano antibody through the method; expressed by a yeast expression system. The humanized anti-TNF alpha nano antibody modified by the invention can retain higher antigen affinity, thermal stability and biological activity, and lays a foundation for the development of disease treatment drugs of humanized nano antibodies in the future.)
技术领域
本发明属于纳米抗体，具体涉及一种抗TNFα纳米抗体(NbTNFα)的人源化方法及其制备。
背景技术
肿瘤坏死因子α(TNFα)是一种研究最热门的多效应细胞因子，主要由活化的巨噬细胞分泌，同时淋巴细胞、可扑弗氏细胞、平滑肌细胞以及黑色素瘤、乳腺癌等多种肿瘤细胞也可以分泌。它不仅是炎症反应的关键介质，同时也可以通过调节信号转导引起细胞的凋亡与坏死。最近有新的研究发现，靶向TNFα的阻断剂在治疗相关疾病时，会引起糖尿病，银屑病，多发性硬化症等多种自身免疫疾病。另外，更多的研究也发现TNFα与肿瘤之间有着密切的关系，一方面低浓度的TNFα可以通过多种信号途径参与肿瘤的发生发展，另一方面高浓度的TNFα具有较强的抗肿瘤作用。目前对于TNFα的研究越来越深入，同时TNFα作为最成熟的靶点。目前已经多种TNFα抗体药物上市，其中包括三个进口(类克、恩利、修美乐)，三个国产(益赛普、强克、安百诺)。
纳米抗体(nanobody)是一种特殊的小分子抗体，是从骆驼血清中分离出的一种缺失轻链和CH1恒定区的重链抗体，通过克隆其可变区可得到重链单域抗体(variabledomain of the heavy-chain of heavy-chain antibody,VHH)即纳米抗体。它作为一种小分子抗体，具有传统抗体不具备的优势，1)分子量小，仅为15Kd，是传统单抗的1/10，具有强而快的穿透力，极易于穿过血管或组织到达靶部位，同时由于其能穿透血脑屏障，为脑部给药提供了新方法；2)稳定性好，研究发现，将纳米抗体放置在37℃一周以上，发现其仍然能保持80％以上的抗原结合能力，而单链抗体却发生了聚集与失活；同时有人将纳米抗体与单抗长期放置在90℃以及强变性剂下，发现纳米抗体仍保持很高的活性，而单抗已完全失活，发生不可逆性的聚合，这使得纳米抗体在常温条件下以及恶劣环境下更容易保存与运输；3)与单抗相比，纳米抗体有较长的CDR3区，这个CDR3形成凸出的环状可以特异性的识别隐藏的抗原表位，而这些表位是常规抗体无法识别的；4)纳米抗体结构简单，可以在细菌以及酵母中大量表达。这些优势都是常规抗体以及其他小分子抗体(Fab，Fv，scFv等)不具备的，因此纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的发展机遇。目前进入临床阶段的纳米抗体主要以双价、多价、PEG修饰、Fc融合以及白蛋白融合等多种形式出现，这样做不仅增加药物的治疗疗效，同时也可以延长药物半衰期。但随着分子量的不断增大，纳米抗体的免疫原性也不得不被人们所关注，目前处于临床试验的纳米抗体部分为人源化纳米抗体，因此寻找一种简单，方便且对活性影响不大的人源化改造方法越来越得到人们的关注。与鼠源抗体一样，纳米抗体人源化的一般原则是在能有效地降低免疫原性的同时，能够保证较高的亲和力、热稳定性、活性和产量等。目前对于纳米抗体进行人源化改造主要有以下两种方法：
表面氨基酸人源化法：根据相关文献报道，纳米抗体与人抗体重链可变区结构很相似，且同源性高达80-90％，另外，通过分析骆驼的VHH胚系基因序列，发现其与人源VH基因III家族具有很高的同源性。通过序列比较，发现其骨架区表面约有十几个氨基酸不同，其中最重要的是FR2骨架区，人源抗体VH的42、49、50、52位氨基酸主要为疏水性残基且相对保守，通常与VL相互作用，参与形成VH-VL界面，而VHH主要为亲水性残基，使得VHH在缺失轻链的情况下仍具有很好的水溶性，并且研究也发现VHH FR2骨架区的这几个残基也与CDR3构象有密切的关系。因此对于人源化改造首先研究FR2这几个残基对CDR构象的影响，对影响较大的残基予以保留。其次对FR1，FR3与FR4表面氨基酸进行人源化突变，由于这三个FR区对CDR的构象影响不大，可借助模拟分析或序列对比的方法选择突变位点。
VHH人源化通用框架移植法：Vincke等人利用人源VH基因III家族的抗体胚系基因DP-47作为模板，对β-内酰胺酶纳米抗体(NbBcII10)进行人源化改造，得到了最大程度人源化NbBcII10FGLA纳米抗体(h-NbBcII10FGLA)。它在降低免疫原性的基础上，不仅保留抗体的亲和力和溶解性，而且热稳定性也有一定程度的提高。同时有相关研究将不同来源的纳米抗体的CDR区嫁接到人源化通用框架h-NbBcII10FGLA的骨架区产生的人源化纳米抗体，通过比较发现移植前后亲和力与热稳定性并没有发生很明显的改变，而且生物活性影响也不明显，因此h-NbBcII10FGLA是目前设计出较理想的一个人源化纳米抗体通用模板。
目前，针对TNFα纳米抗体(专利号：CN 103333253A)已进行了表达制备及抗乳腺癌肿瘤方面的研究，但该抗TNFα纳米抗体的人源化并无文献报道。本发明完成了TNFα的人源化改造并对其TNFα结合活性进行了验证，获得具有高亲和性的TNFα人源化纳米抗体，为进一步开发针对自身免疫性疾病和肿瘤疾病的治疗性TNFα纳米抗体药物奠定基础。
本发明的目的在于提供一种抗TNFα纳米抗体人源化的方法，可以为以后制备人源化纳米抗体奠定一定的基础。
本发明公开了TNFα纳米抗体FR2区42，50，52位关键氨基酸单突变以及组合突变序列，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1，3，5，7，9；氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2，4，6，8，10。
本发明公开的一种人源化改造的抗TNFα纳米抗体，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示；氨基酸序列，如SEQ.ID.NO.12所示。
本发明还公开了抗TNFα纳米抗体的人源化改造方法，包括以下步骤：
1)通过IMGT抗体CDRs区Numbering方案，对抗TNFα纳米抗体的CDRs与FR进行分区；
2)将对CDR3构象有影响的FR2骨架区的第42，50以及52位关键氨基酸进行不同组合突变，已经确定50和52位氨基酸共突变对构象影响不大；
3)将抗TNFα纳米抗体的序列通过IgBLAST进行序列相似性搜索，搜索出与其序列同源性较高的人抗体胚系基因序列，并利用MEGA5.0软件对抗TNFα纳米抗体与人抗体胚系基因序列进行多重序列对比；
4)人源化方案的制定：根据步骤2)和3)的分析结果，对抗TNFα纳米抗体进行合理的人源化设计，包括以下步骤：
4.1)FR骨架区不能替换的氨基酸残基：第42位的苯丙氨酸不能替换；CDR区外侧邻近的残基(一般为邻近的两个氨基酸残基)往往对CDR构象有较大的影响；
4.2)FR骨架区不需要替换的残基：在人源抗体序列变化范围之内的残基可不用进行替换；
4.3)FR骨架区可以替换的残基：人源抗体序列独有的可以考虑进行替换；
4.4)FR骨架区需要考虑的残基：同时替换连续的几个残基可能对CDR构象有一定的影响。
本发明还公开了人源化改造的TNFα纳米抗体表达及活性验证方法，包括以下步骤：
1)将人源化改造的抗TNFα纳米抗体(h-NbTNFα)通过PCR扩增，酶切酶连的方式连接到pPICZαA质粒；
2)对上述1)得到的重组载体进行线性化，并将线性化重组质粒电转化到GS115毕赤酵母表达菌株中，通过甲醇诱导表达，经镍柱纯化得到人源化抗TNFα纳米抗蛋白；
3)利用间接ELISA法对人源化改造的抗TNFα纳米抗体的亲和力以及热稳定性进行检测，并与亲本NbTNFα纳米抗体进行比较；
4)采用MTT法检测人源化改造的抗TNFα纳米抗体抑制hTNFα抗原诱导的L929细胞毒作用，并与亲本NbTNFα纳米抗体进行比较。
附图说明
图1为SDS-PAGE和WB对所纯化的蛋白进行分析(A：SDS-PAGE检测图，Lane1：NbTNFα纳米抗体目的蛋白；Lane2：NbTNFα42纳米抗体目的蛋白；Lane3：NbTNFα50纳米抗体目的蛋白；Lane4：NbTNFα52纳米抗体目的蛋白：M：蛋白Marker.B：WB鉴定图，Line1-4与图A Line1-4对应C：SDS-PAGE检测图：Lane1是NbTNFα50-52纳米抗体目的蛋白；Lane2是NbTNFα42-50-52纳米抗体目的蛋白；M：蛋白Marker.D：WB鉴定图：Line1-2与图C Line1-2相对应)
图2间接ELISA法测定NbTNFα蛋白及突变蛋白对TNFα抗原亲和力(A:NbTNFα，B:NbTNFα42，C:NbTNFα50，D:NbTNFα52，E:NbTNFα50-52，F:NbTNFα42-50-52；角标1代表TNFα包被浓度为1μg/ml，角标2代表TNFα包被浓度为2μg/ml)；
图3NbTNFα与人胚系基因V和J片段多序列对比图；
图4A:PCR法扩增h-NbTNFα基因序列结果图；B:h-NbTNFα纳米抗体菌液PCR结果；
C:PCR法鉴定线性化质粒电转化酵母获得阳性菌株；
图5为SDS-PAGE检测A:h-NbTNFα纳米抗体阳性酵母菌株蛋白表达情况；B:纯化后的h-NbTNFα纳米抗体蛋白电泳图；
图6间接ELISA法测定抗体蛋白对TNFα抗原亲和力A:NbTNFαB:h-NbTNFα(角标1代表TNFα包被浓度为1μg/ml，角标2代表TNFα包被浓度为2μg/ml)；
图7A:不同温度处理h-NbTNFα纳米抗体1h后对其活性影响；B:90℃经过不同时间处理对h-NbTNFα纳米抗体活性影响；
图8为h-NbTNFα纳米抗体对TNFα介导的细胞毒性中和效应。
具体实施方法
所述的抗TNFα纳米抗体原始序列来源于授权专利(名称：一种纳米抗体融合蛋白及其制备方法及应用，专利号：CN 103333253 A)
实施例1 NbTNFα纳米抗体关键氨基酸残基研究
1.抗TNFα纳米抗体FR区的确定
采用IMGT对抗TNFα纳米抗体FR区进行划分，进入http://www.imgt.org点击IMGT/Collier-de-Perles后，将NbTNFα纳米抗体氨基酸序列输入查找框中，网站上会自动根据IMGT编号对CDRs和FRs区进行划分，如表1。
表1抗TNFα纳米抗体FR区的划分结果
2.FR2骨架区第42，50以及52位关键氨基酸对NbTNFα纳米抗体结构的影响
1)使用定点突变试剂盒分别得到单点突变质粒以及组合优化共突变质粒(SEQ.ID.NO.1，3，5，7，9；Seq 1Nb TNFα42,Seq 3Nb TNFα50,Seq 5Nb TNFα52,Seq 7Nb TNFα50-52,Seq 9NbTNFα42-50-52)，所述Seq 1Nb TNFα42,指的是Seq 1Nb TNFα的42位氨基酸突变，其他命名规则同上。
2)分别将重组质粒载体进行线性化，将20μg质粒调整至44μL，后加入1μL Sac I酶切与5μL Buffer，37℃酶切5h，进行浓缩获得20μL线性化的质粒。
3)将10μl线性质粒DNA(10μg)加入80μL感受态细胞中，轻柔混匀，转移至冰上预冷的0.2cm电转杯中，放在冰上10min，按照Invitrogen提供的电转参数(25μF,200Ω,1.6kV,5ms)将电转杯置于电转仪中，关上盖子，电击。取300μL电转液涂布于YPDS(100μg/mLzeocin)，30℃培养箱中培养2天以上，至单克隆出现。挑取单克隆菌株经煮-冻-煮将菌株细胞壁裂解，进行阳性菌株基因组PCR鉴定
4)选取阳性酵母菌株，接种于20ml YPD培养基中小摇过夜，作为种子瓶。次日接种1％至100ml大培养瓶使酵母富集一天。随后开始每天加入1.5％甲醇诱导，诱导5天。诱导结束后，于高速冷冻离心机8000rpm、15min离心收集上清液。
5)镍离子亲和层析柱纯化蛋白：用结合缓冲液平衡柱子，待缓冲液流尽时，加入已用0.45μm微孔滤膜过滤后的上清液，待上清液即将流尽，再用结合缓冲液洗去未结合的杂蛋白。最后用含有100mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，即得到不同位点氨基酸突变的纳米抗体蛋白(SEQ.ID.NO.2，4，6，8，10；Seq 2Nb TNFα42,Seq 4Nb TNFα50,Seq 6Nb TNFα52,Seq8Nb TNFα50-52,Seq 10NbTNFα42-50-52)，几种突变体蛋白分子量约为15kD(图1)，收集洗脱液并用PBS透析，用0.22μm无菌滤器过滤后-80℃保存。
3.间接ELISA测定不同突变体及NbTNFα亲和力常数
分别用1μg/ml，2μg/ml浓度TNF-ɑ包被酶标板，37℃孵育2小时后用PBST洗涤5次。用3％BSA封闭液37℃孵育2小时后用PBST洗涤两次。将NbTNFα纳米抗体及不同的纳米抗体突变体，通过5倍倍比稀释至5ng/ml，随后加入酶标板各孔中，37℃孵育2小时后用PBST洗涤5次。将一抗(抗His标签兔抗)稀释1000倍，加入酶标板各孔中，37℃孵育2小时后用PBST洗涤5次。将二抗(羊抗兔)加入酶标板，37℃孵育1小时后用PBST洗涤5次。加入TMB显色液于37℃避光孵育30min，立即加入2M硫酸终止反应。酶标仪450nm波长读取吸光值，绘制曲线，根据亲和力常数公式Kaff＝(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)。NbTNFα42，NbTNFα50，NbTNFα52以及组合优化共突变体的亲和力常数测定图见图2及表2。
表2间接ELISA法测NbTNFα及单突变体亲和力
实施例2 NbTNFα纳米抗体氨基酸残基人源化研究
1.多重序列对比
使用NCBI数据库中的IgBLAST程序，从库中自动搜索出与抗TNFα纳米抗体同源性较高的人抗体胚系基因序列(人源VH基因III家族的抗体胚系基因)，并利用MEGA5.0软件对其进行多重序列比对，如图3。
2.人源化方案的制定
设计出对抗TNFα纳米抗体人源化改造的方案为：1)不能替换的氨基酸残基：第42位的F不能替换；CDR区外侧邻近的残基(一般为邻近的两个氨基酸残基)往往对CDR构象有较大的影响，包括第40位的G以及第54-55位的AR；2)不需要替换的残基：在人源抗体序列变化范围之内的残基可不用进行替换，如第1位的Q，第5位的L以及第86位的T；3)可以替换的残基：人源抗体序列独有的可以考虑进行替换，包含A15P、T24A、P45A、V87L、D92N、KP95-96RA、Q123L以及R50L和F52W(数字代表氨基酸位点，序列从VHH到VH)；4)需要考虑的残基：同时替换连续的几个残基可能对CDR构象有一定的影响，例如第68-70位的DEP和82-84位的KAQ，由于不确定FR3区第68-70位的DEP和82-84位的KAQ共同突变对CDR构象的影响，因此对抗TNFα纳米抗体进行人源化改造没有考虑这几个位点，如表3。
表3抗TNFα纳米抗体与人源抗体序列不同残基汇总
2.h-NbTNFα纳米抗体酵母表达载体的构建及表达，纯化
1)以金斯瑞公司合成的h-NbTNFα基因序列(SEQ.ID.NO.11)为模板，在引物h-NbTNFα
FP5’-CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTCAGGTGCAGCTGGTGGAG-3与
RP5’-GCTCTAGATCAATGATGATGATGATGATGAGAGGAGACGGTGACCAGG-3’的引导下进行PCR扩增，扩增条带出现在400bp左右，与预期目的条带413bp相一致(图4A)。内切酶Xho I、Xba I 37℃双酶切人源化抗NbTNFα的基因片段和pPICZαA质粒，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的产物，16℃连接16h进行转化DH5α并筛选阳性克隆进行菌液PCR(图4B)。
2)重组载体进行线性化后电转至酵母GS115感受态细胞中。取300μL电转液涂布于YPDS(100μg/mL zeocin)，30℃培养箱中培养2天以上，至单克隆出现。挑取单克隆菌株经煮-冻-煮将菌株细胞壁裂解，进行阳性菌株基因组PCR鉴定，目的条带应出现在970bp出，结果显示条带除8号与10号菌株未出现外，其余均出现在1000bp左右，与预期条带一致,说明重组载体已经整合进酵母基因组中，为阳性酵母菌株(图4C)，随后对8株阳性重组酵母菌株诱导5天的上清进行SDS-PAGE鉴定蛋白表达，发现在15kD处均有表达，且表达量差异不大(图5A)。
3)选取阳性酵母菌株，进行诱导表达及纯化，方法同实施例一的表达方法。即得到人源化抗NbTNFα纳米抗体(SEQ.ID.NO.12)，即蛋白分子量约为15kD(图5B)，收集洗脱液并用PBS透析，用0.22μm无菌滤器过滤后-80℃保存。
4)间接ELISA测定人源化改造前后抗TNFα纳米抗体亲和力常数
实验方法同实施例1，绘制抗体浓度—吸光度曲线(图6)，根据亲和力常数公式Kaff＝(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)，测的抗TNFα纳米抗体NbTNFα的亲和力常数为4.16nM，人源化纳米抗体h-NbTNFα的亲和力常数为87.1nM。如表4。
表4间接ELISA法测NbTNFα及人源化NbTNFα亲和力
实施例3人源化纳米抗体h-NbTNFα热稳定性试验
分别用PBS将英夫利昔单抗(阳性对照)，NbTNFα以及h-NbTNFα纳米抗体稀释到浓度为500μg/ml；将3种抗体分别在25℃、50℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃孵育1h，待温度降至室温25℃时，或在90℃分别孵育0、15、30、45、60、75、90min，待温度降至室温时；5000g离心5min，弃去沉淀，使用BCA试剂盒测上清中抗体浓度，并将三种抗体稀释至终浓度为2μg/ml；使用非竞争ELISA法测定不同条件处理过的英夫利昔单抗，NbTNFα，人源化h-NbTNFα纳米抗体的相对结合。随温度升高，英夫利昔单抗活性显著下降。原始TNFα抗体活性基本维持不变，人源化抗体活性在70℃以后开始有所下降，维持60％以上的活性(图7A)，h-NbTNFα纳米抗体在90℃加热90min后，还能保持70％的抗原结合能力(图7B)。
实例4人源化h-NbTNFα纳米抗体对hTNFα细胞毒性的抑制作用
取对数生长期的L929细胞，并制成细胞悬液，调整细胞密度至10×104个/ml接种于96孔板中，每孔100μl，于37℃、5％CO2条件下培养24h；TNFα抗原用含1μg/ml放线菌素D的DMEM完全培养基稀释至500pg/ml，分别取50μl 500pg/ml的TNFα与50μl不同的浓度的抗体混合后孵育30min。(NbTNFα从5nM对比稀释至4.88pM，英夫利昔从20nM对比稀释至9.77pM，h-NbTNFα从50nM对比稀释至48.82pM，以及IgG从200nM对比稀释至97.625pM)。同时设置细胞对照组，TNFα对照组(TNFα+培养基)以及空白对照组，置于37℃，100％相对湿度，5％CO2培养箱中孵育24h；每孔加入0.5％的MTT 20μl，继续培养4h；停止培养，吸去培养基，每孔加入100μlDMSO，于脱色摇床上振荡10分钟，使晶体状态的甲瓒溶解，在全波长酶标仪OD490nm处测吸光度；实验数据经Graphpad软件处理(图8)，NbTNFα纳米抗体与阳性药英夫利昔单抗能够明显的抑制TNFα抗原诱导的L929细胞毒性作用，h-NbTNFα的IC50 NbTNFα增大20.5倍，但同样具有较强结合hTNFα抗原的能力，存在剂量依赖性，且当h-NbTNFα浓度为6.25nM以上时，其细胞毒中和率可达90％以上，说明h-NbTNFα是一个比较理想的人源化纳米抗体。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一种人源化纳米抗体及其制备方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
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ccaggcaagg gccgtgagtt tgtcgctaga attagcggca ttgacggtac cacctactac 180
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<210> 2
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
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具体实施方式
图1为SDS-PAGE和WB对所纯化的蛋白进行分析(A：SDS-PAGE检测图，Lane1：NbTNFα纳米抗体目的蛋白；Lane2：NbTNFα42纳米抗体目的蛋白；Lane3：NbTNFα50纳米抗体目的蛋白；Lane4：NbTNFα52纳米抗体目的蛋白：M：蛋白Marker.B：WB鉴定图，Line1-4与图A Line1-4对应C：SDS-PAGE检测图：Lane1是NbTNFα50-52纳米抗体目的蛋白；Lane2是NbTNFα42-50-52纳米抗体目的蛋白；M：蛋白Marker.D：WB鉴定图：Line1-2与图C Line1-2相对应)
图2间接ELISA法测定NbTNFα蛋白及突变蛋白对TNFα抗原亲和力(A:NbTNFα，B:NbTNFα42，C:NbTNFα50，D:NbTNFα52，E:NbTNFα50-52，F:NbTNFα42-50-52；角标1代表TNFα包被浓度为1μg/ml，角标2代表TNFα包被浓度为2μg/ml)；
图3NbTNFα与人胚系基因V和J片段多序列对比图；
图4A:PCR法扩增h-NbTNFα基因序列结果图；B:h-NbTNFα纳米抗体菌液PCR结果；
C:PCR法鉴定线性化质粒电转化酵母获得阳性菌株；
图5为SDS-PAGE检测A:h-NbTNFα纳米抗体阳性酵母菌株蛋白表达情况；B:纯化后的h-NbTNFα纳米抗体蛋白电泳图；
图6间接ELISA法测定抗体蛋白对TNFα抗原亲和力A:NbTNFαB:h-NbTNFα(角标1代表TNFα包被浓度为1μg/ml，角标2代表TNFα包被浓度为2μg/ml)；
图7A:不同温度处理h-NbTNFα纳米抗体1h后对其活性影响；B:90℃经过不同时间处理对h-NbTNFα纳米抗体活性影响；
图8为h-NbTNFα纳米抗体对TNFα介导的细胞毒性中和效应。
具体实施方法
所述的抗TNFα纳米抗体原始序列来源于授权专利(名称：一种纳米抗体融合蛋白及其制备方法及应用，专利号：CN 103333253 A)
实施例1 NbTNFα纳米抗体关键氨基酸残基研究
1.抗TNFα纳米抗体FR区的确定
采用IMGT对抗TNFα纳米抗体FR区进行划分，进入http://www.imgt.org点击IMGT/Collier-de-Perles后，将NbTNFα纳米抗体氨基酸序列输入查找框中，网站上会自动根据IMGT编号对CDRs和FRs区进行划分，如表1。
表1抗TNFα纳米抗体FR区的划分结果
2.FR2骨架区第42，50以及52位关键氨基酸对NbTNFα纳米抗体结构的影响
1)使用定点突变试剂盒分别得到单点突变质粒以及组合优化共突变质粒(SEQ.ID.NO.1，3，5，7，9；Seq 1Nb TNFα42,Seq 3Nb TNFα50,Seq 5Nb TNFα52,Seq 7Nb TNFα50-52,Seq 9NbTNFα42-50-52)，所述Seq 1Nb TNFα42,指的是Seq 1Nb TNFα的42位氨基酸突变，其他命名规则同上。
2)分别将重组质粒载体进行线性化，将20μg质粒调整至44μL，后加入1μL Sac I酶切与5μL Buffer，37℃酶切5h，进行浓缩获得20μL线性化的质粒。
3)将10μl线性质粒DNA(10μg)加入80μL感受态细胞中，轻柔混匀，转移至冰上预冷的0.2cm电转杯中，放在冰上10min，按照Invitrogen提供的电转参数(25μF,200Ω,1.6kV,5ms)将电转杯置于电转仪中，关上盖子，电击。取300μL电转液涂布于YPDS(100μg/mLzeocin)，30℃培养箱中培养2天以上，至单克隆出现。挑取单克隆菌株经煮-冻-煮将菌株细胞壁裂解，进行阳性菌株基因组PCR鉴定
4)选取阳性酵母菌株，接种于20ml YPD培养基中小摇过夜，作为种子瓶。次日接种1％至100ml大培养瓶使酵母富集一天。随后开始每天加入1.5％甲醇诱导，诱导5天。诱导结束后，于高速冷冻离心机8000rpm、15min离心收集上清液。
5)镍离子亲和层析柱纯化蛋白：用结合缓冲液平衡柱子，待缓冲液流尽时，加入已用0.45μm微孔滤膜过滤后的上清液，待上清液即将流尽，再用结合缓冲液洗去未结合的杂蛋白。最后用含有100mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，即得到不同位点氨基酸突变的纳米抗体蛋白(SEQ.ID.NO.2，4，6，8，10；Seq 2Nb TNFα42,Seq 4Nb TNFα50,Seq 6Nb TNFα52,Seq8Nb TNFα50-52,Seq 10NbTNFα42-50-52)，几种突变体蛋白分子量约为15kD(图1)，收集洗脱液并用PBS透析，用0.22μm无菌滤器过滤后-80℃保存。
3.间接ELISA测定不同突变体及NbTNFα亲和力常数
分别用1μg/ml，2μg/ml浓度TNF-ɑ包被酶标板，37℃孵育2小时后用PBST洗涤5次。用3％BSA封闭液37℃孵育2小时后用PBST洗涤两次。将NbTNFα纳米抗体及不同的纳米抗体突变体，通过5倍倍比稀释至5ng/ml，随后加入酶标板各孔中，37℃孵育2小时后用PBST洗涤5次。将一抗(抗His标签兔抗)稀释1000倍，加入酶标板各孔中，37℃孵育2小时后用PBST洗涤5次。将二抗(羊抗兔)加入酶标板，37℃孵育1小时后用PBST洗涤5次。加入TMB显色液于37℃避光孵育30min，立即加入2M硫酸终止反应。酶标仪450nm波长读取吸光值，绘制曲线，根据亲和力常数公式Kaff＝(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)。NbTNFα42，NbTNFα50，NbTNFα52以及组合优化共突变体的亲和力常数测定图见图2及表2。
表2间接ELISA法测NbTNFα及单突变体亲和力
实施例2 NbTNFα纳米抗体氨基酸残基人源化研究
1.多重序列对比
使用NCBI数据库中的IgBLAST程序，从库中自动搜索出与抗TNFα纳米抗体同源性较高的人抗体胚系基因序列(人源VH基因III家族的抗体胚系基因)，并利用MEGA5.0软件对其进行多重序列比对，如图3。
2.人源化方案的制定
设计出对抗TNFα纳米抗体人源化改造的方案为：1)不能替换的氨基酸残基：第42位的F不能替换；CDR区外侧邻近的残基(一般为邻近的两个氨基酸残基)往往对CDR构象有较大的影响，包括第40位的G以及第54-55位的AR；2)不需要替换的残基：在人源抗体序列变化范围之内的残基可不用进行替换，如第1位的Q，第5位的L以及第86位的T；3)可以替换的残基：人源抗体序列独有的可以考虑进行替换，包含A15P、T24A、P45A、V87L、D92N、KP95-96RA、Q123L以及R50L和F52W(数字代表氨基酸位点，序列从VHH到VH)；4)需要考虑的残基：同时替换连续的几个残基可能对CDR构象有一定的影响，例如第68-70位的DEP和82-84位的KAQ，由于不确定FR3区第68-70位的DEP和82-84位的KAQ共同突变对CDR构象的影响，因此对抗TNFα纳米抗体进行人源化改造没有考虑这几个位点，如表3。
表3抗TNFα纳米抗体与人源抗体序列不同残基汇总
2.h-NbTNFα纳米抗体酵母表达载体的构建及表达，纯化
1)以金斯瑞公司合成的h-NbTNFα基因序列(SEQ.ID.NO.11)为模板，在引物h-NbTNFα
FP5’-CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTCAGGTGCAGCTGGTGGAG-3与
RP5’-GCTCTAGATCAATGATGATGATGATGATGAGAGGAGACGGTGACCAGG-3’的引导下进行PCR扩增，扩增条带出现在400bp左右，与预期目的条带413bp相一致(图4A)。内切酶Xho I、Xba I 37℃双酶切人源化抗NbTNFα的基因片段和pPICZαA质粒，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的产物，16℃连接16h进行转化DH5α并筛选阳性克隆进行菌液PCR(图4B)。
2)重组载体进行线性化后电转至酵母GS115感受态细胞中。取300μL电转液涂布于YPDS(100μg/mL zeocin)，30℃培养箱中培养2天以上，至单克隆出现。挑取单克隆菌株经煮-冻-煮将菌株细胞壁裂解，进行阳性菌株基因组PCR鉴定，目的条带应出现在970bp出，结果显示条带除8号与10号菌株未出现外，其余均出现在1000bp左右，与预期条带一致,说明重组载体已经整合进酵母基因组中，为阳性酵母菌株(图4C)，随后对8株阳性重组酵母菌株诱导5天的上清进行SDS-PAGE鉴定蛋白表达，发现在15kD处均有表达，且表达量差异不大(图5A)。
3)选取阳性酵母菌株，进行诱导表达及纯化，方法同实施例一的表达方法。即得到人源化抗NbTNFα纳米抗体(SEQ.ID.NO.12)，即蛋白分子量约为15kD(图5B)，收集洗脱液并用PBS透析，用0.22μm无菌滤器过滤后-80℃保存。
4)间接ELISA测定人源化改造前后抗TNFα纳米抗体亲和力常数
实验方法同实施例1，绘制抗体浓度—吸光度曲线(图6)，根据亲和力常数公式Kaff＝(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)，测的抗TNFα纳米抗体NbTNFα的亲和力常数为4.16nM，人源化纳米抗体h-NbTNFα的亲和力常数为87.1nM。如表4。
表4间接ELISA法测NbTNFα及人源化NbTNFα亲和力
实施例3人源化纳米抗体h-NbTNFα热稳定性试验
分别用PBS将英夫利昔单抗(阳性对照)，NbTNFα以及h-NbTNFα纳米抗体稀释到浓度为500μg/ml；将3种抗体分别在25℃、50℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃孵育1h，待温度降至室温25℃时，或在90℃分别孵育0、15、30、45、60、75、90min，待温度降至室温时；5000g离心5min，弃去沉淀，使用BCA试剂盒测上清中抗体浓度，并将三种抗体稀释至终浓度为2μg/ml；使用非竞争ELISA法测定不同条件处理过的英夫利昔单抗，NbTNFα，人源化h-NbTNFα纳米抗体的相对结合。随温度升高，英夫利昔单抗活性显著下降。原始TNFα抗体活性基本维持不变，人源化抗体活性在70℃以后开始有所下降，维持60％以上的活性(图7A)，h-NbTNFα纳米抗体在90℃加热90min后，还能保持70％的抗原结合能力(图7B)。
实例4人源化h-NbTNFα纳米抗体对hTNFα细胞毒性的抑制作用
取对数生长期的L929细胞，并制成细胞悬液，调整细胞密度至10×104个/ml接种于96孔板中，每孔100μl，于37℃、5％CO2条件下培养24h；TNFα抗原用含1μg/ml放线菌素D的DMEM完全培养基稀释至500pg/ml，分别取50μl 500pg/ml的TNFα与50μl不同的浓度的抗体混合后孵育30min。(NbTNFα从5nM对比稀释至4.88pM，英夫利昔从20nM对比稀释至9.77pM，h-NbTNFα从50nM对比稀释至48.82pM，以及IgG从200nM对比稀释至97.625pM)。同时设置细胞对照组，TNFα对照组(TNFα+培养基)以及空白对照组，置于37℃，100％相对湿度，5％CO2培养箱中孵育24h；每孔加入0.5％的MTT 20μl，继续培养4h；停止培养，吸去培养基，每孔加入100μlDMSO，于脱色摇床上振荡10分钟，使晶体状态的甲瓒溶解，在全波长酶标仪OD490nm处测吸光度；实验数据经Graphpad软件处理(图8)，NbTNFα纳米抗体与阳性药英夫利昔单抗能够明显的抑制TNFα抗原诱导的L929细胞毒性作用，h-NbTNFα的IC50 NbTNFα增大20.5倍，但同样具有较强结合hTNFα抗原的能力，存在剂量依赖性，且当h-NbTNFα浓度为6.25nM以上时，其细胞毒中和率可达90％以上，说明h-NbTNFα是一个比较理想的人源化纳米抗体。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一种人源化纳米抗体及其制备方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
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tatgccgatc aatggagcgc ctatgattat tggggccaag gcacccaagt caccgtctcc 360
tct 363
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gln Thr Ser Ser Thr Ala
20 25 30
Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Gln Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 11
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ccaggcaagg gcctggagtg ggtcgctaga attagcggca ttgacggtac cacctactac 180
gatgaaccgg tgaagggccg tttcaccatc tccagagaca aagcccaaaa caccctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtag aagccctcgt 300
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tct 363
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<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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