阅读说明：本技术 一种利用微生物发酵从虾壳中提取甲壳素的方法 (Method for extracting chitin from shrimp shells by utilizing microbial fermentation ) 是由 李永成 张巧 黄兴 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了利用微生物发酵从虾壳中提取甲壳素的方法。本发明以虾壳为原料,洗净干燥,研磨成粉,然后加入适当浓度的葡萄糖,灭菌后首先接种枯草芽孢杆菌,然后流加适当浓度乙醇并接种醋酸杆菌继续发酵。枯草芽孢杆菌生长产生的蛋白酶降解虾壳中的蛋白质。醋酸杆菌则以乙醇为碳源,上述被枯草芽孢杆菌降解的虾壳蛋白为氮源,生长产生醋酸,溶解虾壳中的矿物质使其变成可溶性的钙等金属离子。本发明公开的甲壳素制备方法将虾壳脱蛋白与脱盐两工艺过程耦合起来,合二为一,操作简单可行,脱蛋白和脱盐效果好,不仅实现了对虾壳的高值化利用,且简化了甲壳素的生产工艺,降低生产成本,减少对环境的污染。(The invention discloses a method for extracting chitin from shrimp shells by utilizing microbial fermentation. The invention takes shrimp shell as raw material, which is cleaned, dried, ground into powder, then added with glucose with proper concentration, firstly inoculated with bacillus subtilis after sterilization, and then fed with ethanol with proper concentration and inoculated with bacillus acetate for continuous fermentation. Protease produced by the growth of bacillus subtilis degrades proteins in shrimp shells. The acetobacter uses ethanol as a carbon source, the shrimp shell protein degraded by the bacillus subtilis is used as a nitrogen source, acetic acid is generated by growth, and mineral substances in the shrimp shells are dissolved to be changed into soluble metal ions such as calcium and the like. The chitin preparation method disclosed by the invention couples the two technological processes of shrimp shell deproteinization and desalination, is simple and feasible to operate, has good deproteinization and desalination effects, realizes high-value utilization of shrimp shells, simplifies the production technology of chitin, reduces the production cost and reduces the pollution to the environment.)

一种利用微生物发酵从虾壳中提取甲壳素的方法

技术领域

本发明属于食品工业技术领域，涉及一种提取甲壳素的方法，具体涉及一种利用微生物发酵除去虾壳中的蛋白质和矿物质来制备甲壳素的方法。

背景技术

目前虾加工以虾仁为主，加工时去头去壳，这些虾头、虾壳约占整虾体重的30％～40％。由于技术条件限制，这些加工废弃物难处理，弃之后不但占有土地，而且还造成环境污染。虾壳主要成分是甲壳素(又称几丁质)(10～20％)，蛋白质(20～40％)与无机盐(30～40％)。而甲壳素是一种有重要应用价值的生物大分子，经化学或生物脱蛋白质与无机盐后，虾壳可转化为具有高附加值的甲壳素及其衍生物。因此如何综合利用虾壳，既是虾加工行业面临的一紧迫环境保护问题，又是其实现产业升级的有效途径。

虾壳甲壳素的制备方法有化学法、酶法和发酵法。化学法是利用强酸强碱去除虾壳中的蛋白质和碳酸钙等成分后获得。由于应用强酸强碱，对环境污染较严重。目前研究的热点是利用微生物发酵产生有机酸和蛋白酶处理虾壳来生产甲壳素。相比而言，生物法制备甲壳素具有反应温和、环境污染小、对甲壳素结构破坏少、能保留甲壳素的生物特性等优点，是目前的主要生产方法。

传统发酵法虾壳甲壳素生产工艺采用两段发酵工艺，以芽孢杆菌为产蛋白酶微生物，以乳酸菌为产酸菌。第一阶段发酵中，首先培养乳酸菌发酵虾壳，产酸除盐，然后分离虾壳，更换培养基，再次灭菌并接种产蛋白酶的微生物，进行第二次发酵脱氮。由于该工艺中的脱盐与脱蛋白是分开的，第一发酵阶段脱盐完成后，需分离虾壳，并更换培养基，才能进行脱蛋白质的第二段发酵，因此，操作工艺流程复杂，生产成本较高。

发明内容

本发明的目的是提供了一种微生物发酵从虾壳中提取甲壳素的方法，该方法工艺简单、反应温和、成本低、将传统的虾壳两段微生物工艺合二为一，且脱矿物质和脱蛋白效果较好，得到的甲壳素质量高和甲壳素得率高。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种利用微生物发酵从虾壳中提取甲壳素的方法，包括以下步骤：

步骤S1：虾壳粉碎，得到虾壳粉；

步骤S2：在虾壳粉中添加葡萄糖、酵母膏和水，搅拌均匀后灭菌，得到虾壳培养基质；

步骤S3：在虾壳培养基质中接种枯草芽孢杆菌，35～38℃、160～200rpm条件下发酵48～52h以除去虾壳的蛋白质，得到枯草芽孢杆菌发酵基质；

步骤S4：待枯草芽孢杆菌发酵结束后，不更换培养基，直接在上述枯草芽孢杆菌发酵基质中流加浓度5％～7％(V/V)的无水乙醇，搅拌均匀，得到乙醇发酵基质；

步骤S5：上述枯草芽孢杆菌发酵基质流加乙醇后，不灭菌，接种醋酸杆菌，30～35℃、160～200rpm条件下发酵60～72h以除去矿物质，得到醋酸杆菌发酵液；

步骤S6：将醋酸杆菌发酵液进行固液分离，沉淀用水洗至中性，按照固液重量比1：10加入浓度10％的双氧水溶液进行脱色，室温条件下浸泡2h；

步骤S7：脱色后的固体物质经过洗净烘干，得到白色固体甲壳素。

较佳地，所述步骤S1具体为：将干燥(45～50℃)的虾壳原料进行研磨，过60～80目筛网，得到虾壳粉。

较佳地，所述步骤S2中，虾壳粉、葡萄糖、酵母膏的添加量分别为水体积的4％～6％、5％～8％、0.2％～0.5％。

较佳地，所述步骤S3中，枯草芽孢杆菌的接种量为虾壳培养基质体积的1％～3％(V/V)。

较佳地，所述步骤S5中，醋酸杆菌的接种量为乙醇发酵基质体积的3～5％(V/V)。

较佳地，枯草芽孢杆菌菌种的培养与制备：取2ml LB肉汤培养基(组成g/L：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl，pH 7.0)于10ml试管中，121℃灭菌15min，冷却后接入2～3环枯草芽孢杆菌试管斜面种，37℃、180rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.8备用。然后500ml三角瓶装入LB肉汤培养基100ml，121℃灭菌15min，冷却后接1ml上述菌种，37℃、180rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.8～1.0备用。

较佳地，醋酸杆菌菌种的培养与制备：醋酸杆菌培养基(w/v)：1％酵母膏，1％葡萄糖，pH值为5.5，使用前加入3％(v/v)无水乙醇。固体培养基加入2％琼脂，培养过程与条件同枯草芽孢杆菌，但培养温度为30℃。

本发明利用微生物发酵从虾壳中提取甲壳素的方法具有以下的有益效果：

本发明以枯草芽孢杆菌为产蛋白酶菌，以醋酸杆菌为产酸酸。首先枯草芽孢杆菌进行脱氮处理，然后流加乙醇，直接接种醋酸杆菌进行脱盐过程。其优点在于：首先醋酸脱盐能力要强于乳酸，其次醋酸杆菌发酵所需的碳源为乙醇，与枯草芽孢杆菌所需的葡萄糖不一致，两种菌不存在碳源的竞争与生长的干扰，同时流加乙醇后，可以抑制枯草芽孢杆菌生长，减少对醋酸菌生长的影响，这样可以实现将两种微生物的发酵合二为一，简化甲壳素的制备工艺，节约了生产成本；本发明可以使虾壳中的蛋白质脱除率达到93％～98％，矿物质脱除率达到95％～98％。

具体实施方式

实施例1

本发明利用微生物发酵从虾壳中提取甲壳素的方法，包括以下步骤：

(1)虾壳粉碎：取工厂对虾加工后的虾壳，洗净，然后50℃干燥，将干燥的虾壳原料进行研磨，过60目筛网，制成虾壳粉。

(2)虾壳培养基质的制备：虾壳粉4g，葡萄糖5g，0.2g酵母膏，水100ml，搅拌均匀后121℃、15min灭菌。

(3)微生物菌种的培养与制备

枯草芽孢杆菌菌种的培养与制备：取2ml LB肉汤培养基(组成g/L：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl，pH 7.0)于10ml试管中，121℃灭菌15min，冷却后接入2～3环枯草芽孢杆菌试管斜面种，37℃、180rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.8备用。然后500ml三角瓶装入LB肉汤培养基100ml，121℃灭菌15min，冷却后接1ml上述菌种，37℃、180rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.8备用。

醋酸杆菌菌种的培养与制备：醋酸杆菌培养基(w/v)：1％酵母膏，1％葡萄糖，pH值为5.5，使用前加入3％(v/v)无水乙醇。固体培养基加入2％琼脂，培养过程与条件同枯草芽孢杆菌，但培养温度30℃。

(4)枯草芽孢杆菌发酵：虾壳培养基质按上述(2)制备后，接种2％(V/V)按上述(3)项制备的枯草芽孢杆菌液体菌种，35℃、160rpm条件下发酵52h以除去虾壳的蛋白质。

(5)虾壳培养基质补料：待枯草芽孢杆菌发酵结束后，在发酵基质中直接流加5％(V/V)的无水乙醇，搅拌均匀。

(6)醋酸杆菌发酵：第(5)项完成后，在虾壳培养基质中接种3％(V/V)按(3)项方法制备的醋酸杆菌液体种子，30℃、160rpm发酵72h以除以矿物质。

(7)脱色：将发酵液(6)进行固液分离，沉淀用水洗至中性，按照固液比1：10加入浓度10％的双氧水溶液，室温条件下浸泡2h。

(8)甲壳素制备：脱色后的固体物质经过洗净烘干，得到的白色固体产品即为甲壳素。

实施例2

本发明利用微生物发酵从虾壳中提取甲壳素的方法，包括以下步骤：

(1)虾壳粉碎：取工厂对虾加工后的虾壳，洗净，然后45℃干燥，将干燥的虾壳原料进行研磨，过80目筛网，制成虾壳粉。

(2)虾壳培养基质的制备：虾壳粉5g，葡萄糖6g，0.3g酵母膏，水100ml，搅拌均匀后121℃、15min灭菌。

(3)微生物菌种的培养与制备

枯草芽孢杆菌菌种的培养与制备：取2ml LB肉汤培养基(组成g/L：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl，pH 7.0)于10ml试管中，121℃灭菌15min，冷却后接入2～3环枯草芽孢杆菌试管斜面种，37℃、180rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.8备用。然后500ml三角瓶装入LB肉汤培养基100ml，121℃灭菌15min，冷却后接1ml上述菌种，37℃、180rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.9备用。

醋酸杆菌菌种的培养与制备：醋酸杆菌培养基(w/v)：1％酵母膏，1％葡萄糖，pH值为5.5，使用前加入3％(v/v)无水乙醇。固体培养基加入2％琼脂，培养过程与条件同枯草芽孢杆菌，但培养温度30℃。

(4)枯草芽孢杆菌发酵：虾壳培养基质按上述(2)制备后，接种3％(V/V)按上述(3)项制备的枯草芽孢杆菌液体菌种，35℃、180rpm条件下发酵50h以除去虾壳的蛋白质。

(5)虾壳培养基质补料：待枯草芽孢杆菌发酵结束后，在发酵基质中直接流加6％(V/V)的无水乙醇，搅拌均匀。

(6)醋酸杆菌发酵：第(5)项完成后，在虾壳培养基质中接种4％(V/V)按(3)项方法制备的醋酸杆菌液体种子，32℃、180rpm发酵66h以除以矿物质。

(7)脱色：将发酵液(6)进行固液分离，沉淀用水洗至中性，按照固液比1：10加入浓度10％的双氧水溶液，室温条件下浸泡2h。

(8)甲壳素制备：脱色后的固体物质经过洗净烘干，得到的白色固体产品即为甲壳素。

实施例3

本发明利用微生物发酵从虾壳中提取甲壳素的方法，包括以下步骤：

(1)虾壳粉碎：取工厂对虾加工后的虾壳，洗净，然后48℃干燥，将干燥的虾壳原料进行研磨，过80目筛网，制成虾壳粉。

(2)虾壳培养基质的制备：虾壳粉6g，葡萄糖8g，0.5g酵母膏，水100ml，搅拌均匀后121℃、20min灭菌。

(3)微生物菌种的培养与制备

枯草芽孢杆菌菌种的培养与制备：取2ml LB肉汤培养基(组成g/L：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl，pH 7.0)于10ml试管中，121℃灭菌15min，冷却后接入2～3环枯草芽孢杆菌试管斜面种，37℃、180rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.8备用。然后500ml三角瓶装入LB肉汤培养基100ml，121℃灭菌15min，冷却后接1ml上述菌种，37℃、180rpm条件下培养至OD₆₀₀＝1.0备用。

醋酸杆菌菌种的培养与制备：醋酸杆菌培养基(w/v)：1％酵母膏，1％葡萄糖，pH值为5.5，使用前加入3％(v/v)无水乙醇。固体培养基加入2％琼脂，培养过程与条件同枯草芽孢杆菌，但培养温度30℃。

(4)枯草芽孢杆菌发酵：虾壳培养基质按上述(2)制备后，接种3％(V/V)按上述(3)项制备的枯草芽孢杆菌液体菌种，38℃、200rpm条件下发酵，48h以除去虾壳的蛋白质。

(5)虾壳培养基质补料：待枯草芽孢杆菌发酵结束后，在发酵基质中直接流加7％(V/V)的无水乙醇，搅拌均匀。

(6)醋酸杆菌发酵：第(5)项完成后，在虾壳培养基质中接种5％(V/V)按(3)项方法制备的醋酸杆菌液体种子，35℃、200rpm发酵60h以除以矿物质。

(7)脱色：将发酵液(6)进行固液分离，沉淀用水洗至中性，按照固液比1：10加入浓度10％的双氧水溶液，室温条件下浸泡2h。

(8)甲壳素制备：脱色后的固体物质经过洗净烘干，得到的白色固体产品即为甲壳素。

本发明由于采用醋酸为脱盐剂，其无机盐除去率比传统发酵法要高1～3％，由于简化了生产工艺，生产周期缩短1天左右，生产成本比传统发酵法低20％左右。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。