一种利用废弃香蕉进行光合生物制氢的方法
阅读说明：本技术 一种利用废弃香蕉进行光合生物制氢的方法 (Method for producing hydrogen by using waste bananas through photosynthetic organisms ) 是由 路朝阳 张全国 孙勇 李文哲 张寰 曲斌 张宁远 刘玲慧 杨旭东 于 2021-07-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用废弃香蕉进行光合生物制氢的方法,具体为：取1-5 g废弃香蕉,加入80-120 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液,然后按照0.1-0.3 mL/g的剂量加入纤维素酶；用碱液中和至中性,然后加入对数期后期的光合细菌和产氢培养基,在温度28-32℃、光照强度2500-3500 Lux的条件下进行产氢。该方法以厨余垃圾废弃香蕉为原料生产清洁的氢气能源,变废为宝,成本低,且产氢效率高。(The invention relates to a method for producing hydrogen by utilizing waste bananas through photosynthetic organisms, which comprises the following specific steps: taking 1-5 g of waste bananas, adding 80-120 mL of citric acid-sodium citrate buffer solution, and then adding cellulase according to the dosage of 0.1-0.3 mL/g; neutralizing with alkali liquor to neutrality, adding photosynthetic bacteria and hydrogen production culture medium at late logarithmic phase, and producing hydrogen at 28-32 deg.C under illumination intensity of 2500-. The method uses the kitchen waste bananas as the raw material to produce clean hydrogen energy, changes waste into valuable, and has low cost and high hydrogen production efficiency.)
技术领域
本发明属于光合制氢技术领域，具体涉及一种利用废弃香蕉进行光合生物制氢的方法。
背景技术
随着中国的快速崛起，中国已经开始十分重视生态环境安全对人民生活的影响。
基于中国上海市的一项研究发现，厨余垃圾占到垃圾总量的51.8%，这样不仅降低了后续垃圾处理方式（填埋、焚烧）的负担，降低了碳排放量，也可以将厨余垃圾进一步提取能量。到2025年，中国的厨余垃圾将会得到1.4×108 吨，这相当于1000万吨煤炭的发电量[8]。然而中国目前的处理能力只有0.098×108 吨，巨大的厨余垃圾处理缺口给社会和环境安全问题带了巨大的挑战。按照中国人的饮食习惯，餐余垃圾按照成分大致包括谷物类（面条、大米）、蔬菜类（白菜、土豆）、水果类（苹果、香蕉）、肉类（猪肉、鸡肉）。水果类的厨余垃圾含有大量的糖分，在资源化利用的过程中一般可以直接进行降解利用。Habibi等人利用苹果废弃物在土曲霉的作用下产生壳聚糖，并对工艺条件进行了优化。Mago等人发现添加20%-40%的香蕉废弃物可以提高蚯蚓牛粪的性能，并且能够促进蚯蚓的生成与繁殖。Mishra等人研究发现利用酸处理香蕉皮可以得到较高的脱木质素率在，在还原糖负荷较低时（20 g/L）可以得到更高的丁醇效价（butanol titers）（7.4 g/L），但是目前并未有利用废弃香蕉进行生物制氢的相关报道。
本发明利用废弃香蕉进行光合生物制氢可以产生清洁的氢气能源，并且其操作简单、成本低、效率高，是一种值得推广的资源利用方式。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种利用废弃香蕉进行光合生物制氢的方法。该方法以厨余垃圾废弃香蕉为原料生产清洁的氢气能源，变废为宝，成本低，且产氢效率高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用废弃香蕉进行光合生物制氢的方法，其具体为：取1-5 g废弃香蕉，加入80-120 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，然后按照0.1-0.3 mL/g的剂量加入纤维素酶；用碱液中和至中性，然后加入对数期后期的光合细菌和产氢培养基，在温度28-32 ℃、光照强度2500-3500 Lux的条件下进行产氢。
进一步的，为了提高产氢量，所述废弃香蕉优选经下述预处理获得：将废弃香蕉切成4-6 mm大小的方块、于70-80 ℃烘制48-72 h以去除水分。
进一步的，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为0.05 mol/L，pH为4.8。
进一步的，所述对数期后期的光合细菌经下述步骤获得：将HAU-M1光合产氢细菌接种于生长培养基中，放置在温度28-32 ℃、光照强度2500-3500 Lux的恒温培养箱中培养48 h即得。
具体的，所述生长培养基组成优选为：1 g/L酵母膏，1 g/L NH4Cl，0.2 g/LK2HPO4，2 g/L NaHCO3，4 g/L CH3COONa，2 g/L NaCl和0.2 g/L MgSO4。
具体的，所述产氢培养基组成优选为：0.1 g/L酵母膏，3.56 g/L谷氨酸钠，0.4 g/L NH4Cl，0.5 g/L K2HPO4，0.2 g/L MgCl2和2 g/L NaCl。
氢气作为新型能源中冉冉升起的新星，慢慢成为新能源领域极其重要的一份子，氢气作为能源有着干净，高效的特点，是目前新能源研究领域最有前景的研究对象之一，而且我国市农业生产和人口大国，每天都有大量的废弃生活垃圾和农业生产废弃物，腐烂水果更是数不胜数，这些都可以作为生物制氢的原材料，如何回收生活垃圾和农业生产废弃物使其变废为宝。同时提升制氢效率，使其普及到每个城市，这成为了一门重要课题。本发明着重研究了底物废弃香蕉浓度对产气量、产氢量、产气速率以及产氢速率的影响，从而得出腐烂香蕉制氢技术是否可行；同时研究了不同底物浓度时，各个产氢过程中发酵料液的pH值、OD540值、氧化还原电位以及还原糖含量的变化规律等。
本发明以厨余垃圾废弃香蕉为原料生产清洁的氢气能源，变废为宝，成本低，且产氢效率高。和现有技术相比，本发明方法具有如下有益效果：1）降解香蕉废弃物，避免环境污染；2）产生清洁的氢气能源；3）避免资源浪费。
附图说明
图1为不同底物浓度实验组对pH值的影响；
图2为不同底物浓度的实验组对还原糖质量浓度变化的影响；
图3为不同底物浓度反应液对累计产氢量的影响；
图4为不同底物浓度反应液对产氢速率的影响；
图5为不同底物浓度反应液对氧化还原电位的影响；
图6为不同底物浓度反应液对比产氢量的影响；
图7为不同底物浓度反应液对氢气浓度的影响。
具体实施方式
以下对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
实验材料
实验选用的原料（产氢基质）为厨房的废弃香蕉，并经过如下预处理：将废弃香蕉切成约5 mm大小的方块、于75 ℃烘制48h。
实验所用到的细菌、酶分别是光合细菌和纤维素酶。光合细菌来自河南农业大学的HAU-M1光合产氢细菌菌群，该细菌主要包括深红红螺菌、荚膜红假单胞菌、沼泽红假单胞菌、类球红细菌、荚膜红细菌等5种光合细菌，且质量分数分别为27%、25%、28%、9%、11%（见文献 HAU-M1光合产氢细菌的生理特征和产氢特性分析，太阳能学报，2015年2月第36卷第2期，p289-294）。纤维素酶（51 FPU/mL，Novozymes Biotechnology Co., Ltd, Denmark.）。
生长培养基组成为：1 g/L酵母膏，1 g/L NH4Cl，0.2 g/L K2HPO4，2 g/L NaHCO3，4g/L CH3COONa，2 g/L NaCl和0.2 g/L MgSO4。
产氢培养基组成优选为：0.1 g/L酵母膏，3.56 g/L谷氨酸钠，0.4 g/L NH4Cl，0.5g/L K2HPO4，0.2 g/L MgCl2和2 g/L NaCl。
缓冲液：pH4.8、浓度0.05 mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。
DNS试剂：称取6.3 g3-5二硝基水杨酸于500 mL大烧杯中,用少量的蒸馏水溶解后加入2 mol/L的NaOH溶液262 mL,进行混合后加入含有185 g酒石酸钾钠的热水溶液并且定容至500 mL,称取5 g无水硫酸钠和5 g结晶酚，加入其中并用玻璃棒充分搅拌至完全溶解。在冷却后移入1000 mL容量瓶内,定容至1000 mL后倒入棕色瓶中在温室暗中放置一个星期后就可以使用。
实验装置和仪器
实验装置：选用密封性良好的上方带有橡胶塞口的三角瓶作为实验进行的反应装置，在橡胶塞上连接密封气体采样袋（大连海得科技有限公司），作为本实验的氢气收集装置，把实验装置放入数显生化培养箱（姜堰市双城分析仪器有限公司）中进行实验。
生化培养箱：TF-100数显生化培养箱（姜堰市双城分析仪器有限公司）。
分光光度计：721型可见分光光度计（上海菁华科技有限公司生产）。波长的范围和重现性是190-1020nm 和<±0.02nm，准确度<±0.5nm，准确度±0.005A。
分析天平：赛多利斯F型分析天平。天平的分度值为0.1 mg,最大的称量值事200g。
高速离心机：TGL-16B高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。输入功率为250 VA。最大容量18 mL。最高转速为16500 r/min。
pH计：FE28型pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）。工作环境温度为5℃-40℃。
防干烧电热杯：HX-350A型防干烧电热杯（潮州市潮安区彩塘镇豪兴五金电器厂）。加热功率为350 W。
电热鼓风干燥箱：101-2A远型电热鼓风干燥箱（北京中兴伟业有限公司）。功率2.4KW。
气相色谱分析仪：GC-14B型气相色谱仪。用5A分子筛当做色谱柱的填料，使用氮气作为载气，流量45 mL/min，以纯度99.999%的高纯氢气作为标准气。色谱的条件：进样口温度为100℃，柱温为80℃，TCD检测器为150℃，进样量是500μL，保留时间为2 min。
实验步骤和方法
1.3.1 实验组配置
选取五个实验装置，将经过预处理的废弃香蕉（用作底物）分为五份，重量分别是1g、2 g、3 g、4 g、5 g，将废弃香蕉分别加入实验装置的三角瓶中，并在实验装置上依次标号为1、2、3、4、5。然后加入100 mL pH4.8、浓度0.05 mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，然后以0.2 mL/g香蕉的剂量分别向每个三角瓶中加入对应剂量的纤维素酶（液体）。
中和滴定过程
使用5 mol/L的KOH溶液和含有36%~38%的盐酸溶液进行中和滴定。在整个的过程中一定要一边滴入一边用玻璃棒搅拌,并且不断测量样品的pH值，直到每个样品的pH值为7止。
接种光合细菌
将HAU-M1光合产氢细菌接种于生长培养基中，放置在温度30 ℃、光照强度3000Lux的恒温培养箱中培养48 h，获得对数期后期的光合细菌。
在每个中性样品中加入50 mL对数期后期的光合细菌和50 mL产氢培养基。
开始实验
把处理好的五组实验装置放入培养箱中，将培养箱中的温度调整为30 ℃，设置光照强度为3000 Lux，放好后实验正式开始。以12 h为周期，每过一个周期测量一次实验数据。
实验数据的测定和记录
1.4.1 产气量和含量的测定
光合厌氧细菌产生氢气的能力可以根据产氢量和产氢速率来表示。测量时先用针管抽出每组实验装置产生的气体，然后进行标号。读出每个实验装置所产的气体体积并记录。最后使用6820GC-14B型气相色谱仪对每组实验装置生产的气体进行所含氢气量的测定。每隔一个周期12 h就要定时的抽取气体进行测定，测出后记录每组的峰值,然后用下面的公式(1)进行氢气含量的计算（可参照文献：路朝阳, 王毅, 荆艳艳, 等. 基于BBD模型的玉米秸秆光合生物制氢优化实验研究[J]. 2014, (8): 1511-1516. ），式中：S代表每组产生气体的峰面积。
Y=0.0012*S+0.9388 (1)
1.4.2 pH值的测定
用小针管从实验装置中抽取1 mL液体，放入塑料管中。选用pH值测试仪来进行测量,在测量前先用蒸馏水清洗电极，用纸擦干后将电极插入塑料试管中。等待测试仪反应后读出数据并记录。
540的测定
用小针管取少量液体放入小塑料管中，放入离心机中离心，离心结束后抽取上层清液，稀释后加入0.5 mL DNS试剂，100 ℃水浴加热5 min，放凉后倒入显色皿中。把分光光度计波长调整为540 nm,依次把每组液体放入分光光度计中测出相应的OD540值。
产氢速率的测定
将产氢量除以所间隔的时间即可测出每阶段的产氢速率。
氧化还原电位的测定
用小针管从实验装置中抽取1 mL液体，放入塑料管中。先清洗氧化还原电位笔，擦干后放入所需测试的溶液中，计时30 s等到氧化还原电位表电位值数据稳定后记录数据。
比产氢量的测定
将氢气量除以总的气体量，就可以得出比产氢量。
累计产氢量的测定
将每个阶段的产氢量加上之前产氢量的总和，就可以得到每个时刻的累计产氢量。
实验结果与分析
2.1 不同底物浓度的实验组产氢过程中pH值变化
在实验过程中，厌氧细菌进行呼吸作用会产生一部分酸性物质，这是代谢过程不可避免的，会造成pH值的下降，虽然有缓冲液的缓冲作用，但是也可以通过数据分析清晰地看到：下降的pH值对氢气生产效率的影响，根据数据显示pH值在到达5时基本不产生氢气了，这表明合适的pH值有利于产氢速率和产氢效率。
实验的过程中不同底物浓度实验组pH值的变化情况如图1所示，根据实验数据可以得到:随着细菌光合制氢过程的进行，pH值整体呈下降趋势，起初实验开始时，pH值都在6.5～7之间，慢慢的随着实验近行后四组的pH值已经下降到5.5～6之间。此时到达产氢高峰，根据上图可以得出随着细菌呼吸作用导致pH值在12h-24 h快速下降后，到达逐渐稳定的状态。24 h-48h是产氢高峰，pH值下降十分缓慢，氢气产生效率也最高。此时第一组的pH值甚至有点上升，48 h后值开始加速下降，直到72 h时才有小小的回升，但是此时已经基本不产生氢气。84h时再次下降。由此可以看出pH值的变化具有一定周期性。并不是一直直线下降。并且在pH值处于5.5～6时产氢效果最佳。
不同底物浓度的实验组产氢过程中还原糖质量浓度变
实验的过程中不同底物浓度实验组还原糖质量浓度变化情况如图2所示。根据实验数据可以得到：在实验过程中还原糖质量浓度呈下降趋势，因为细菌需要营养，在产氢过程中伴随着细菌消耗还原糖的呼吸作用，底物中的小分子单糖被不断分解，导致反应液中的糖类物质不断下降。由图2可知，细菌在12 h-36h不断进行呼吸作用消耗糖类，同时在36h到达产氢高峰，这个阶段细菌活性最强，生命活动最剧烈，所以产氢效率也最高。同时可以看出虽然不同底物浓度的实验组还原糖浓度变化趋势大致一样，但是底物浓度越大还原糖消耗速率越快，细菌活性越强。36 h-48 h还原糖质量浓度下降幅度变小，糖类物质已经基本消耗完，48 h之后部分实验组还原糖浓度基本不动，产氢也基本结束。
不同底物浓度对累计产氢量的影响
实验的过程中不同底物浓度实验组累计产氢量变化情况如图3所示。根据实验测定的产气量算出氢气量，通过把每个时间段产生的氢气与之前所产生的氢气加起来，就可以得到累计氢气量。根据实验数据可以得到：0 h-12 h基本不产生氢气，此时细菌生命活动不明显，体内的酶活性较低。对糖类的消耗也很少。12 h-24 h逐渐开始有氢气产生，但是上升速率较缓慢。24 h-36 h时累计产氢量快速上升，此时产氢速率最快，细菌活性最大，效率最高。36 h-48 h以后，上升缓慢，此时氢气产生速率变慢。底物逐渐被消耗殆尽。48 h以后累计氢气量基本不再变化。
不同底物浓度对产氢速率的影响
实验的过程中不同底物浓度实验组产氢速率变化情况如图4所示。根据实验数据可以得到：12 h-24 h时，产氢速率较为缓慢，细菌不够活跃。底物被用来进行细菌的呼吸作用。24 h-36 h时，产氢速率明显上升，且上升速率很快，逐渐在36小时达到产氢速率的峰值。36 h-48 h，此时底物被逐渐消耗，产氢速率逐渐下降，细菌生命活动逐渐受到限制。氢气生产速率慢慢在48 h达到低谷。48h以后基本不再产生氢气，底物也基本被消耗完。
不同底物浓度对氧化还原电位的影响
实验的过程中不同底物浓度实验组氧化还原电位变化情况如图5所示。根据实验数据可以得到：12 h-24 h时，氧化还原电位基本都为负值，且呈上升趋势，此时细菌不够活跃。24 h-36 h时，进入产气高峰期，氧化还原电位迅速下降，表示细菌开始进行光合作用。36 h-48 h时走势又开始上升但仍为负值，仍有氢气产生。48 h-60 h再次下降，60 h以后继续上升逐渐变为正值，此时表明细菌已经大量死亡，产氢过程也已经结束。
不同底物浓度对比产氢量的影响
实验的过程中不同底物浓度实验组比产氢量变化情况如图6所示。根据实验数据可以得到：12 h-24 h时，比产氢量缓慢上升。24 h-36 h时，进入产气高峰期，比产氢量迅速上升至36 h时达到最高峰。36 h-48 h时，比产氢量开始下降。48 h后基本不产生氢气，只有第一组实验组在72 h比产氢量达到峰值。分析原因为底物浓度太低导致细菌生存的营养不够，使细菌生命活动进行缓慢。
不同底物浓度对氢气浓度的影响
实验的过程中不同底物浓度实验组氢气浓度变化情况如图7所示。根据实验数据可以得到：12 h-36 h时，氢气浓度稳步上升，并且在36 h时有三组实验组氢气浓度达到峰值，36 h后第三组实验组氢气浓度继续上升，在48 h达到峰值，而第一实验组在72 h才达到峰值。除第一组实验组以外所有实验组在36 h-84 h基本都呈下降趋势，且在48 h后氢气浓度下降到零。
结论：通过对实验数据的分析可以得出以下结论：底物浓度对光合生物制氢的影响较为明显，浓度太高或者太低都会影响厌氧细菌和酶的活性。
1）不同底物浓度对pH值的变化趋势影响不大，但底物浓度越大pH值的下降速率越快，因为细胞的生命活动会产生酸性物质。
2）底物浓度的不同对还原糖质量浓度的变化趋势基本没有影响，但是底物浓度越大，还原糖质量浓度的起点就越高，下降速率也会变快。这是因为底物中含有大量的有机物多糖分子。
3）底物浓度对累计产氢量的影响较大，底物浓度太少自然细菌光合作用的原料就少产氢量会下降，但是底物浓度过高也不利于氢气的产生，合适的底物浓度会使产氢效率更高。
4）底物浓度对产氢速率的影响也很明显，浓度太低会导致产氢过程进行得很缓慢，浓度太高也不利于细菌充分利用。所以中间试验组的产氢速率是最高的。
5）不同底物浓度对氢气浓度也有一定的影响，浓度适中的中间组氢气浓度最高，由此可见浓度太高或者太低对产氢效率都不好。
综合以上数据分析可以得出，废弃香蕉光合生物制氢最合适的pH值是5.5左右，最合适的底物浓度是15 g/L，最大累计产氢量达到了118.52 mL，产氢过程在36 h达到产氢速率的峰值，在48 h基本产氢结束。