阅读说明：本技术 鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法及其提取物和应用 (Extraction method of fish skin collagen polypeptide, extract and application thereof ) 是由 王代军 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法及其提取物和应用,涉及蛋白多肽生产技术领域。该提取方法包括使用微生物水解经过预处理的鱼皮,然后使用酶膜耦合法纯化经微生物水解的鱼皮；所述预处理包括使用酶制剂酶解鱼皮。该提取方法无需酸性或碱性条件便可完成水解鱼皮,减少了酶的用量和整体的水解时间,能够使鱼皮水解彻底,提高胶原蛋白多肽的提取率,提取得到的提取物中小分子鱼皮胶原蛋白多肽含量高,分子量均一,经济价值高。(The invention provides an extraction method of fish skin collagen polypeptide, an extract and application thereof, and relates to the technical field of protein polypeptide production. The extraction method comprises hydrolyzing pretreated fish skin with microorganism, and purifying the fish skin hydrolyzed with microorganism by enzyme membrane coupling method; the pretreatment comprises enzymolysis of the fish skin by using an enzyme preparation. The extraction method can hydrolyze the fish skin without acid or alkaline conditions, reduces the dosage of enzyme and the whole hydrolysis time, can hydrolyze the fish skin thoroughly, improves the extraction rate of collagen polypeptide, and obtains the extract with high content of small-molecular fish skin collagen polypeptide, uniform molecular weight and high economic value.)

鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法及其提取物和应用

技术领域

本发明涉及蛋白多肽生产技术领域，尤其是涉及一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法及其提取物和应用。

背景技术

胶原蛋白多肽作为天然可降解聚合物，具有生物活性高、生物相容性好、降解速度适宜等优势，并且易加工生产，是目前理想的生物医学材料之一，分子量在1000以内的鱼皮胶原蛋白多肽有极好的亲和性，易于被人体吸收，能够很好的发挥其渗透、保湿、修复等功能。我国的鱼类资源非常丰富，水产业加工过程中产生了大量的下脚料，如鱼皮、鱼头、鱼骨、鱼鳞等，而这些废弃物约占鱼体总重的45％～70％，基本上被直接丢弃，如何将水产品加工过程中产生的大量下脚料变废为宝，充分利用生物资源是科研工作者亟待解决的问题之一，这不仅能产生可观的经济效益，更对保护生态环境具有重大意义。

目前，鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法可分为5类：酸法、碱法、酶法、盐法和热水浸提法。在实际提取过程中，其中热水浸提法提取的胶原蛋白大多变性为明胶，需对温度严格控制；盐提取方法会影响胶原蛋白构象的稳定性，生物活性降低；碱法提取会破坏胶原蛋白的氨基酸序列并且产生有毒的物质；酸法提取的胶原蛋白可保留三股螺旋结构，但提取时间长，提取率低；酶法提取虽然水解条件相对温和，但水解不够彻底。为了在保持胶原三螺旋结构的基础上提高胶原得率，不同的提取方法往往相互结合。目前常采用酸、酶的结合使用的提取方法，但仍然存在酶用量大、水解时间长、对反应酸碱度要求严格和产率低的问题，所得胶原蛋白分子量分布范围大，结构破坏程度高，同时工业生产带来较多强酸强碱性废水，废水处理成本高。因此，一种改进的鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法是目前需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，该方法生产效率和提取效率高。

本发明的第二目的在于提供一种上述鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法制备得到的提取物。

本发明的第三目的在于提供一种上述鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法或上述提取物的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，包括使用微生物水解经过预处理的鱼皮，然后使用酶膜耦合法纯化经微生物水解的鱼皮；所述预处理包括使用酶制剂酶解鱼皮。

优选地，所述微生物包括巴氏醋杆菌、双歧杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、戊糖片球菌、干酪乳杆菌、毛霉、副干酪乳杆菌、球形芽孢杆菌、短杆菌、产碱杆菌、柠檬酸杆菌、假单胞菌、节杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌；

优选地，按照重量份数计，所述微生物包括巴氏醋杆菌1～5份、双歧杆菌1～5份、植物乳杆菌1～5份、酿酒酵母1～5份、黑曲霉1～5份、戊糖片球菌1～5份、干酪乳杆菌1～5份、毛霉1～5份、副干酪乳杆菌1～2份、球形芽孢杆菌1～2份、短杆菌1～2份、产碱杆菌1～2份、柠檬酸杆菌1～2份、假单胞菌1～2份、节杆菌1～2份和嗜麦芽寡养单胞菌1～2份；

优选地，所述酶制剂包括中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶中的至少一种。

优选地，所述鱼皮来源于鱿鱼、草鱼、鲤鱼、鳕鱼和罗非鱼中的至少一种。

优选地，所述酶膜耦合法中，使用的滤膜使分子量不超过1000Dal的多肽通过；

优选地，所述酶膜耦合法包括多级酶膜耦合法；

优选地，所述酶膜耦合法的pH条件为2.5～10；

优选地，所述酶膜耦合法的温度条件为15～60℃；

优选地，所述酶膜耦合法中蛋白酶的载量为0.1-50mg/g；

优选地，洗脱缓冲液的pH为4～8；

优选地，采用三级梯度洗脱。

优选地，所述预处理还包括将打浆后的鱼皮和水混合制成鱼皮浆，然后再使用酶制剂酶解鱼皮浆；其中打浆后的鱼皮和水的质量比为1：(5～15)；

优选地，打浆后的鱼皮先过200～400目筛，再和水混合。

优选地，所述使用酶制剂酶解鱼皮中，酶制剂的用量为鱼皮浆质量的0.1％～3％；

优选地，当鱼皮来源于金枪鱼时，所述酶制剂包括胃蛋白酶；所述酶制剂的用量为鱼皮浆质量的1％～2％；

优选地，当鱼皮来源于鱿鱼时，所述酶制剂包括碱性蛋白酶和胃蛋白酶；所述酶制剂的用量为鱼皮浆质量的0.5％～3％；

优选地，碱性蛋白酶与胃蛋白酶用量比为1：1～3：1；

优选地，当鱼皮来源于鲤鱼时，所述酶制剂包括胰蛋白酶和中性蛋白酶；所述酶制剂的用量为鱼皮浆质量的0.5％～3％；

优选地，胰蛋白酶与中性蛋白酶用量比为1：1-1：5；

优选地，酶解温度为45～60℃，酶解时间为2～4h；

优选地，边搅拌边酶解。

优选地，所述使用微生物水解经过预处理的鱼皮中，微生物的用量为鱼皮浆质量的1％～5％；

优选地，水解温度为35～45℃，水解时间为2～6h；

优选地，边搅拌边水解。

优选地，将经过微生物水解的鱼皮浆固液分离，将分离液纯化后得到鱼皮胶原蛋白多肽；

优选地，所述固液分离包括先将经过微生物水解的鱼皮浆经第一次固液分离得到第一分离液，然后使用水浸提沉淀，再固液分离得到第二分离液，然后将第一分离液和第二分离液合并；

优选地，所述使用水浸提沉淀中，水的用量是沉淀质量的5～15倍；

优选地，所述固液分离包括离心；

优选地，离心的转速为8000-10000rpm；

优选地，在纯化前先浓缩待纯化的分离液；优选浓缩至分离液中的固形物含量为15～20％；

优选地，浓缩分离液包括使用减压蒸发的方式浓缩待浓缩的分离液；优选使用减压真空单效蒸发器对分离液进行浓缩；

优选地，所述减压蒸发的温度为55～65℃；

优选地，所述减压蒸发的真空度为0.07～0.095MPa；

优选地，纯化前对分离液进行脱色处理；优选使用活性炭脱色；

优选地，活性炭的粒径为50～100目；

优选地，活性炭的用量为分离液质量的1％～3％；

优选地，在40～60℃的条件下使用静态吸附法吸附蛋白；

优选地，所述提取方法还包括纯化后将鱼皮胶原蛋白多肽制成鱼皮蛋白多肽粉末；

优选地，采用喷雾干燥的方法制备鱼皮蛋白多肽粉末；

优选地，喷雾干燥设备进料口温度160～180℃；

优选地，喷雾干燥设备出料口温度75～80℃；

优选地，喷雾干燥所得干粉中辅料比重占0-20％。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了采用上述提取方法制备得到的提取物。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法或采用上述提取方法制备得到的提取物在如下(x1)～(x4)中的应用；

(x1)制备化妆品；

(x2)制备医用材料；

(x3)制备食品；

(x4)制备药物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，先使用酶制剂酶解鱼皮，再使用微生物水解鱼皮。联合使用酶制剂和微生物水解鱼皮，无需酸性或碱性条件便可完成水解鱼皮；并且由于联合使用了微生物，减少了酶的用量和整体的水解时间；联合使用酶制剂和微生物水解鱼皮能够使鱼皮水解彻底，提高鱼皮胶原蛋白多肽的提取率。然后通过酶膜耦合法纯化经微生物水解的鱼皮，使提取得到的鱼皮胶原蛋白多肽分子量均一可控，其中分子量大小700-1000Dal的多肽占比高，经济价值高。采用上述提取方法制备得到的提取物中鱼皮胶原蛋白多肽含量高，分子量均一。本发明提供的上述鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法或采用上述提取方法制备得到的提取物，能够应用于制备化妆品、医用材料、食品和药物等多个领域。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，该提取方法包括使用微生物水解经过预处理的鱼皮，然后使用酶膜耦合法纯化经微生物水解的鱼皮；所述预处理包括使用酶制剂酶解鱼皮。

本发明联合使用酶制剂和微生物水解鱼皮，无需酸性或碱性条件便可完成水解鱼皮；并且由于联合使用了微生物，减少了酶的用量和整体的水解时间；联合使用酶制剂和微生物水解鱼皮能够使鱼皮水解彻底，提高胶原蛋白多肽的提取率；通过酶膜耦合法纯化经微生物水解的鱼皮，使提取得到的鱼皮胶原蛋白多肽分子量均已可控，其中分子量大小700-1000Dal的多肽占比高，经济价值高。

需要说明的是，本发明不限制鱼皮的鱼的种类，本领域常规的可用于提取鱼皮胶原蛋白的鱼类均可，例如包括但不限于鱿鱼、草鱼、鲤鱼、鳕鱼和罗非鱼中的至少一种。可以理解的是，在提取时可以只使用一种鱼皮作为原料，例如鱼皮来源于鱿鱼、草鱼、鲤鱼、鳕鱼或罗非鱼，也可以使用几种鱼皮的混合物，例如以鱿鱼的鱼皮和草鱼的鱼皮作为提取原料；例如以鲤鱼的鱼皮和鳕鱼的鱼皮作为提取原料；又例如以鱿鱼的鱼皮、草鱼的鱼皮、鲤鱼的鱼皮、鳕鱼的鱼皮和罗非鱼的鱼皮的混合物作为提取原料，本发明对此不作限制。

在一些优选的实施方式中，所述微生物包括如下微生物时，水解经酶解的鱼皮效果更佳：巴氏醋杆菌、双歧杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、戊糖片球菌、干酪乳杆菌、毛霉、副干酪乳杆菌、球形芽孢杆菌、短杆菌、产碱杆菌、柠檬酸杆菌、假单胞菌、节杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌。

在一些优选的实施方式中，按照重量份数计，所述微生物包括巴氏醋杆菌1～5份，例如可以为但不限于为1份、2份、3份、4份或5份；双歧杆菌1～5份，例如可以为但不限于为1份、2份、3份、4份或5份；植物乳杆菌1～5份，例如可以为但不限于为1份、2份、3份、4份或5份；酿酒酵母1～5份，例如可以为但不限于为1份、2份、3份、4份或5份；黑曲霉1～5份，例如可以为但不限于为1份、2份、3份、4份或5份；戊糖片球菌1～5份，例如可以为但不限于为1份、2份、3份、4份或5份；干酪乳杆菌1～5份，例如可以为但不限于为1份、2份、3份、4份或5份；毛霉1～5份，例如可以为但不限于为1份、2份、3份、4份或5份；副干酪乳杆菌1～2份，例如可以为但不限于为1份、1.2份、1.5份、1.8份或2份；球形芽孢杆菌1～2份，例如可以为但不限于为1份、1.2份、1.5份、1.8份或2份；短杆菌1～2份，例如可以为但不限于为1份、1.2份、1.5份、1.8份或2份；产碱杆菌1～2份，例如可以为但不限于为1份、1.2份、1.5份、1.8份或2份；柠檬酸杆菌1～2份，例如可以为但不限于为1份、1.2份、1.5份、1.8份或2份；假单胞菌1～2份，例如可以为但不限于为1份、1.2份、1.5份、1.8份或2份；节杆菌1～2份，例如可以为但不限于为1份、1.2份、1.5份、1.8份或2份；和嗜麦芽寡养单胞菌1～2份，例如可以为但不限于为1份、1.2份、1.5份、1.8份或2份。

在一些优选的实施方式中，所述酶制剂包括中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶中的至少一种；在一些可选的实施方式中，使用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶或胃蛋白酶中的一种作为酶制剂水解鱼皮；在另一些可选的实施方式中，使用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶中的几种联合使用作为酶制剂水解鱼皮。酶制剂中酶的种类可以根据鱼皮的来源进行调整：在一些优选的实施方式中，优选以胃蛋白酶水解金枪鱼的鱼皮；优选以碱性蛋白酶和胃蛋白酶酶解鱿鱼的鱼皮；优选以胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解鲤鱼的鱼皮。

酶膜耦合法是依靠酶的专一性、催化性及膜特有的功能,在生物反应过程中实现反应与反应的耦合、产物的原位分离浓缩和酶的回收利用于一体,在此基础上，将酶用柱子固定，经酶解反应和膜过滤后未通过膜的大分子组分重新进入酶解体系，经降解后通过膜过滤，直到大分子物质几乎完全降解为可通过膜的目标大小物质，多级酶膜耦合技术可极大强化反应过程，控制反应过程，调控产物组成，减少副产物生成、提高原料转化率，使产物多肽富集纯化。在一些优选的实施方式中，所述酶膜耦合法包括多级酶膜耦合法，优选使用使分子量不超过1000Dal的多肽通过的滤膜。采用该方法纯化经微生物水解的鱼皮，得到的鱼皮胶原蛋白多肽分子量分布大小范围在0-1000Dal，其中分子量大小700-1000Dal的多肽占比98％，能够实现多肽产品分子量均一可控，提高得到的提取物的经济价值。上述酶膜耦合法中，pH条件优选为2.5～10，例如可以但不限于2.5、5、7、8或10；温度条件优选为15～60℃，例如可以但不限于15℃、20℃、30℃、40℃、50℃或60℃；蛋白酶载量优选0.1-50mg/g，例如可以但不限于0.1mg/g、0.5mg/g、1mg/g、2mg/g、5mg/g、10mg/g、15mg/g、20mg/g、30mg/g、40mg/g、50mg/g或60mg/g。

在一些优选的实施方式中，所述预处理还包括将打浆后的鱼皮和水混合制成鱼皮浆，然后再使用酶制剂酶解鱼皮浆；将鱼皮和水混合制成鱼皮浆便于酶和微生物与底物反应。其中优选将打浆后的鱼皮和水以质量比为1：(5～15)的比例混合，例如可以为但不限于为1:5、1:8、1:10、1:12或1:15。优选地，将打浆后的鱼皮先过200～400目筛，例如可以为但不限于为200目、260目、300目、325目或400目，以过滤出原料中的杂质。

在一些优选的实施方式中，所述使用酶制剂酶解鱼皮中，酶制剂的用量为鱼皮浆质量的0.1％～3％时，水解效果较佳，例如可以为但不限于为0.1％、0.2％、0.5％、0.8％、1％、1.5％、2％、2.5％或3％。当鱼皮来源于不同的鱼的种类时，调整酶制剂中酶的配比和用量，能够优化提取效果。优选地，当鱼皮来源于金枪鱼时，所述酶制剂包括胃蛋白酶；所述酶制剂的用量为鱼皮浆质量的1％～2％；优选地，当鱼皮来源于鱿鱼时，所述酶制剂包括碱性蛋白酶和胃蛋白酶；所述酶制剂的用量为鱼皮浆质量的0.5％～3％，其中碱性蛋白酶与胃蛋白酶用量比优选为1：1～3：1；优选地，当鱼皮来源于鲤鱼时，所述酶制剂包括胰蛋白酶和中性蛋白酶；酶制剂的用量为鱼皮浆质量的0.5％～3％；其中，胰蛋白酶与中性蛋白酶用量比优选为1：1-1：5。

在一些优选的实施方式中，如下酶解条件较佳：酶解温度为45～60℃，例如可以为但不限于为45℃、48℃、50℃、55℃、58℃或60℃；酶解时间为2～4h，例如可以为但不限于为2h、2.5h、3h、3.5h或4h。优选地，在酶解时采用边搅拌边酶解的方式可以促进酶与底物充分接触，以提高酶解效率。

在一些优选的实施方式中，所述使用微生物水解经过预处理的鱼皮中，当微生物的用量为鱼皮浆质量的1％～5％时，水解效率较佳，所述微生物的用量，即菌株的用量，若微生物以菌剂的形式存在，指的是菌剂中微生物的用量；微生物的用量例如可以为但不限于为1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。

在一些优选的实施方式中，如下水解条件较佳：水解温度为35～45℃，例如可以为但不限于为35℃、38℃、40℃、42℃或45℃；水解时间为2～6h，例如可以为但不限于为2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h或6h；优选地，在水解时采用边搅拌边水解的方式可以促进微生物与鱼皮充分接触，以提高水解效率。

在一些优选的实施方式中，将经过微生物水解的鱼皮浆固液分离，将分离液纯化后得到鱼皮胶原蛋白多肽。

在一些优选的实施方式中，所述固液分离包括先将经过微生物水解的鱼皮浆经第一次固液分离得到第一分离液，然后使用水浸提沉淀，以更充分的提取出鱼皮中的胶原蛋白，再固液分离得到第二分离液，然后将第一分离液和第二分离液合并。优选地，在使用水浸提沉淀时，水的用量是沉淀质量的5～15倍，例如可以为但不限于为5倍、8倍、10倍、12倍或15倍。

在一些优选的实施方式中，所述固液分离包括离心，可以理解的是，在上述两步固液分离的操作中，可以均采用离心的方式，也可以在其中任意一步的固液分离的操作中，采用离心的方式。其中离心的转速优选为8000～10000rpm，例如可以为但不限于为8000rpm、8500rpm、9000rpm、9500rpm或10000rpm。

在一些优选的实施方式中，在纯化前先浓缩待纯化的分离液；优选浓缩至分离液中的固形物含量为15～20％，例如可以为但不限于为15％、16％、17％、18％、19％或20％，有利于后续的纯化操作。

在一些优选的实施方式中，浓缩分离液包括使用减压蒸发的方式浓缩待浓缩的分离液。减压蒸发能够使液体的沸点降低，防止分离液中的胶原蛋白变性和分解，也能增大传热温差，强化蒸发操作，降低热源的要求，优选使用减压真空单效蒸发器对分离液进行浓缩。减压蒸发的温度优选为55～65℃，例如可以为但不限于为55℃、58℃、60℃、62℃或65℃；减压蒸发的真空度优选为0.07～0.095MPa，例如可以为但不限于为0.07MPa、0.075MPa、0.08MPa、0.085MPa、0.09MPa或0.095MPa。

在一些优选的实施方式中，纯化前对分离液进行脱色处理；优选使用无毒害作用且吸附效果佳的活性炭脱色。活性炭的粒径优选为50～100目，例如可以为但不限于为50目、60目、70目、80目、90目或100目；活性炭的用量优选为分离液质量的1％～3％，例如可以为但不限于为1％、1.5％、2％、2.5％或3％；优选在40～60℃的条件下使用静态吸附法吸附蛋白，吸附温度例如可以为但不限于为40℃、45℃、50℃、55℃或60℃。

在一些优选的实施方式中，所述提取方法还包括纯化后将鱼皮胶原蛋白多肽制成鱼皮蛋白多肽粉末，优选采用喷雾干燥的方法制备鱼皮蛋白多肽粉末。喷雾干燥设备进料口温度优选160～180℃，例如可以为但不限于为160℃、165℃、170℃、175℃或180℃；喷雾干燥设备出料口温度优选75～80℃，例如可以为但不限于为75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃；喷雾干燥所得干粉中辅料比重占0～20％，例如可以为但不限于为0％、5％、10％、15％、20％，其中0％表示不含有辅料。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了采用上述提取方法制备得到的提取物。采用上述提取方法制备得到的提取物，鱼皮胶原蛋白多肽含量高，并且分子量均一。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法或采用上述提取方法制备得到的提取物的应用。胶原蛋白多肽具有较好的保湿、锁水和美白的功效，可以用于化妆品领域；胶原蛋白多肽还可以用于制备人工皮肤、人工食道和人工气管等生物材料，还可以用于细胞培养和制备缓释药物等；胶原蛋白多肽对胃黏膜和肝能起到修复作用，能够促进钙的吸收、降血压和抗氧化的作用。综上本发明提供的鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法或采用上述提取方法制备得到的提取物可以用于制备化妆品、医用材料、食品和药物等多个领域。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例1

本实施例提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，本实施例以金枪鱼皮作为原料，该提取方法包括如下步骤：

(a)取500份金枪鱼皮刮去鱼鳞，浸泡清洗后，匀浆机打浆，过300目筛，将滤液转入反应釜中。

(b)向滤液中加入质量10倍的工艺水，混合均匀后得到鱼皮浆，再加入鱼皮浆总质量2％的胃蛋白酶，保持温度55℃，搅拌，酶解3h。

(c)向反应釜中加入3％的复合微生物菌剂，所述复合微生菌剂按照重量份数计包括：巴氏醋杆菌3份、双歧杆菌3份、植物乳杆菌3份、酿酒酵母3份、黑曲霉3份、戊糖片球菌3份、干酪乳杆菌3份、毛霉3份、副干酪乳杆菌1.5份、球形芽孢杆菌1.5份、短杆菌1.5份、产碱杆菌1.5份、柠檬酸杆菌1.5份、假单胞菌1.5份、节杆菌1.5份和嗜麦芽寡养单胞菌1.5份；水解条件为：温度40℃，边搅拌边水解4h。

(d)将步骤(c)得到的水解液采用管式离心机离心，离心速率10000rpm。

(e)将离心沉淀使用质量10倍的水浸提，再次离心，离心速率10000rpm。

(f)弃去步骤(e)离心后的下层杂质，合并步骤(d)和步骤(e)两次的离心液。

(g)离心液采用减压真空单效蒸发器进行浓缩处理，真空度控制在0.07～0.095MPa，所得浓缩物浓度中固形物含量为20％。

(h)使用粒径为50～100目的活性炭，采用静态吸附法吸附，吸附温度50℃，活性炭用量为步骤(g)得到的浓缩液质量的2％，浓缩液经活性炭脱色后，得到颜色清亮多肽溶液。

(i)采用多级酶膜耦合技术，调节步骤(h)得到的多肽溶液至pH为7～8，温度为40℃；蛋白酶载量为30mg/L，陶瓷膜通过的分子肽的分子量范围为0-1000Dal，缓冲液洗脱pH为5～6，三级梯度洗脱，得到分子量均一多肽溶液。

(j)上述溶液经浓缩、脱色后，喷雾干燥，喷雾干燥设备进料口温度170℃，出料口温度80℃，得到分子量均一鱼皮多肽粉末。

实施例2

本实施例提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，本实施例与实施例1的区别在于，复合微生菌剂按照重量份数计包括：巴氏醋杆菌5份、双歧杆菌1份、植物乳杆菌5份、酿酒酵母1份、黑曲霉5份、戊糖片球菌1份、干酪乳杆菌5份、毛霉1份、副干酪乳杆菌1份、球形芽孢杆菌2份、短杆菌1份、产碱杆菌2份、柠檬酸杆菌1份、假单胞菌2份、节杆菌1份和嗜麦芽寡养单胞菌2份。

实施例3

本实施例提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，本实施例与实施例1的区别在于，复合微生菌剂按照重量份数计包括：巴氏醋杆菌1份、双歧杆菌5份、植物乳杆菌1份、酿酒酵母5份、黑曲霉1份、戊糖片球菌5份、干酪乳杆菌1份、毛霉5份、副干酪乳杆菌2份、球形芽孢杆菌1份、短杆菌2份、产碱杆菌1份、柠檬酸杆菌2份、假单胞菌1份、节杆菌2份和嗜麦芽寡养单胞菌1份。

实施例4

本实施例提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，本实施例与实施例1的区别在于，复合微生菌剂按照重量份数计包括：巴氏醋杆菌1份、双歧杆菌8份、植物乳杆菌1份、酿酒酵母10份、黑曲霉1份、戊糖片球菌10份、干酪乳杆菌0.5份、毛霉5份、副干酪乳杆菌5份、球形芽孢杆菌1份、短杆菌5份、产碱杆菌5份、柠檬酸杆菌0.5份、假单胞菌10份、节杆菌0.5份和嗜麦芽寡养单胞菌5份。

实施例5

本实施例提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，本实施例与实施例1的区别在于，复合微生菌剂中不含有双歧杆菌、戊糖片球菌和副干酪乳杆菌。

实施例6

本实施例提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，本实施例与实施例1的区别在于，复合微生菌剂中不含有巴氏醋杆菌、黑曲霉、产碱杆菌和柠檬酸杆菌。

实施例7

本实施例提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，本实施例与实施例1的区别在于，复合微生菌剂中不含有副干酪乳杆菌、假单胞菌、节杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌。

实施例8

本实施例提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，本实施例以金枪鱼皮作为原料，该提取方法包括如下步骤：

(a)取500份金枪鱼皮刮去鱼鳞，浸泡清洗后，匀浆机打浆，过300目筛，将滤液转入反应釜中。

(b)向滤液中加入质量15倍的工艺水，混合均匀后得到鱼皮浆，再加入鱼皮浆总质量1％的胃蛋白酶，保持温度45℃，搅拌，酶解4h。

(c)向反应釜中加入5％的复合微生物菌剂，复合微生物菌剂的配方同实施例1，保持温度45℃，搅拌水解2h。

步骤(d)-(j)同实施例1。

实施例9

本实施例提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，本实施例以金枪鱼皮作为原料，该提取方法包括如下步骤：

(a)取500份金枪鱼皮刮去鱼鳞，浸泡清洗后，匀浆机打浆，过300目筛，将滤液转入反应釜中。

(b)向滤液中加入质量5倍的工艺水，混合均匀后得到鱼皮浆，再加入鱼皮浆总质量3％的胃蛋白酶，保持温度60℃，搅拌，酶解2h。

(c)向反应釜中加入1％的复合微生物菌剂，复合微生物菌剂的配方同实施例1，保持温度35℃，搅拌水解6h。

步骤(d)-(j)同实施例1。

实施例10

本实施例提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，本实施例以鱿鱼鱼皮作为原料，该实施例中以鱼皮浆质量2％的碱性蛋白酶和胃蛋白酶酶解鱼皮浆，其中碱性蛋白酶和胃蛋白酶的用量为1:1，其余步骤均和实施例1相同。

实施例11

本实施例提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，本实施例以鲤鱼鱼皮作为原料，该实施例中以鱼皮浆质量2％的胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解鱼皮浆，其中胰蛋白酶和中性蛋白酶的用量为1:1，其余步骤均和实施例1相同。

对比例1

本对比例提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，与实施例1的区别在于，不含有步骤(b)，即本对比例中不使用酶制剂酶解鱼皮浆，直接使用复合微生物菌剂水解鱼皮浆。

对比例2

本对比例提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，与实施例1的区别在于，不含有步骤(c)，即本对比例中不使用复合微生物菌剂水解鱼皮浆，只使用酶制剂酶解鱼皮浆。

对比例3

本实施例提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，本实施例与实施例1的区别在于，本实施例不采用多级酶膜耦合技术纯化浓缩液，而采用等电点沉淀法纯化提取所得蛋白多肽，然后过陶瓷膜，陶瓷膜通过的分子肽的分子量不超过1000Dal。

对比例4

本实施例提供了一种鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法，本实施例以金枪鱼鱼皮作为原料，该实施例中以鱼皮浆用pH为11.0碱液浸泡6h，水提两次，水提步骤同实施例1，提取浓缩液用酸沉淀，所得蛋白用PH4.0柠檬酸钠溶液溶解，然后过陶瓷膜，陶瓷膜通过的分子肽的分子量不超过1000Dal。

效果例

比较实施例1～12，和对比例1～3提供的鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法提取得到的0-1000Dal多肽所占比例，结果如表1所示：

表1

组别	收率％
		实施例1	94
实施例2	97.8
		实施例3	90
实施例4	86
		实施例5	78
实施例6	82
		实施例7	82
实施例8	94
		实施例9	95
实施例10	92
		实施例11	94
对比例1	62
		对比例2	56
对比例3	64
		对比例4	68

从上述实施例1和实施例5-7的对比可以看出，选择合适的微生物种类，有利于提高小分子多肽的收率；从实施例1和实施例2-4的对比可以看出，优化微生物的配比，也能够提高小分子多肽的收率；从实施例1和实施例8-9对比可以看出，优化工艺参数能够提高小分子多肽的收率；从实施例1和实施例11-12可以看出，本发明提供的提取方法，小分子多肽的收率更高，产物分子量均一可控；从实施例1和对比例对比可以看出，联用酶解、微生物水解和酶膜耦合法得到的鱼皮胶原蛋白多肽收率更高。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。