阅读说明：本技术 一种兔血抗氧化肽的发酵制备方法 (Fermentation preparation method of rabbit blood antioxidant peptide ) 是由 肖岚 辛松林 董平 李燮昕 安攀宇 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种兔血抗氧化肽的发酵制备方法,其包括步骤：(1)、分别制备枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液；按体积比3:1:1的比例,将枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液混合,得到混合种子液；(2)、以灭菌后的兔血作为培养底物,将混合种子液接种至培养底物中,接种量为2.5～6.5％；(3)、在30～40℃、120-150r/min转速下,培养2-4天,对所得培养液进行离心、抽滤和超滤之后,即得抗氧化肽。本发明所得抗氧化肽对ABTS+、·OH和·O<Sub>2</Sub>-自由基具有优异的清除能力,本发明方法所得多肽含量可达到3.42mg/ml。(The invention provides a fermentation preparation method of rabbit blood antioxidant peptide, which comprises the following steps: (1) respectively preparing a bacillus subtilis seed culture solution, a bacillus coagulans seed culture solution and a lactobacillus plantarum seed culture solution; mixing a bacillus subtilis seed culture solution, a bacillus coagulans seed culture solution and a lactobacillus plantarum seed culture solution according to the volume ratio of 3:1:1 to obtain a mixed seed solution; (2) inoculating the mixed seed liquid to culture medium by taking sterilized rabbit blood as culture substrateIn the substrate, the inoculation amount is 2.5-6.5%; (3) culturing for 2-4 days at 30-40 ℃ and 120-150r/min, and centrifuging, filtering and ultrafiltering the obtained culture solution to obtain the antioxidant peptide. The antioxidant peptide pair ABTS +,. OH and. O obtained by the invention 2 The free radicals have excellent scavenging capacity, and the content of the polypeptide obtained by the method can reach 3.42 mg/ml.)

一种兔血抗氧化肽的发酵制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种兔血抗氧化肽的发酵制备方法。

背景技术

我国是产兔大国，也是世界第一兔产品出口大国[9]，兔血资源非常丰富。健康家兔的血量大约是55-65ml/kg,但由于其血腥味重、适口性差、难消化等原因，导致大量的兔血都被直接丢弃，并未得到充分利用。

兔按照经济用途主体划分为三个方向：肉用、毛用和皮用，而未涉及对兔血的回收利用，在屠宰过程中均被废弃。但各类研究证明，兔血有非常大的作用，有学者曾从兔血中分离出治疗失眠的物质。而从兔血中提取抗氧化肽的研究，至今还未见报道。

肽是由两个或两个以上氨基酸组成的结构简单、生理活性强的物质，具有调节人体新陈代谢、增强机体免疫力、预防疾病等功能。抗氧化肽是生物活性肽的一种，可以通过它的主要功能特性对其进行定义为：可以维持机体自由基平衡、提高机体抗衰老、抑制脂质过氧化和清除自由基、抗疾病功能的一类生物活性肽，统称为抗氧化肽。此外，抗氧化肽还有抗癌、抗应激、抗血压等作用。目前，按不同的分类，抗氧化肽可分为多种，如动物源抗氧化肽，植物源抗氧化肽，微生物性抗氧化肽，内源性与外源性抗氧化肽。

动物源抗氧化肽来源于动物蛋白质，可分为内源性与外源性两种，是从动物自身组织器官产生的或体内蛋白质水解物中获得的具有抑制大分子过氧化或清除体内自由基作用的物质。目前，用于制备动物源抗氧化肽的来源主要为各种海源、乳源、血源、禽蛋源等。动物蛋白源抗氧化肽在食品和生物体中表现出了有效的抗氧化活性(如清除自由基、抑制油脂氧化和螯合金属离子等)。

目前，在本领域中，一个亟待解决的问题是如何利用发酵法从兔血中高效的提取出抗氧化肽。

发明内容

针对现有技术的不足及需求，本发明的目的在于提供一种利用发酵法高效的从兔血中提取出抗氧化肽，使得所得抗氧化肽具有优异的ABTS自由基清除率。

为了实现上述目的，本发明提供的方案如下：

一种兔血抗氧化肽的发酵制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)、分别制备枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液；按体积比3:1:1的比例，将枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液混合，得到混合种子液；

(2)、以灭菌后的兔血作为培养底物，将混合种子液接种至培养底物中，接种量为2.5～6.5％；

(3)、对步骤(2)所得物，在30～40℃、120-150r/min转速下，培养2-4天，然后对所得培养液进行离心、抽滤和超滤之后，即得抗氧化肽。

作为本发明一个可选实施方案，所述枯草芽孢杆菌种子培养液是将活化好的枯草芽孢杆菌斜面菌种单菌落接种入灭菌后的种子液体培养基中，于35℃，转速135r/min的恒温振荡培养箱中培养12h，所述种子培养液体培养基的配方为：葡萄糖10g/L、牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，pH＝7.0。

作为本发明一个可选实施方案，所述凝结芽孢杆菌种子培养液是将活化好的凝结芽孢杆菌斜面菌种单菌落接种入灭菌后的种子液体培养基中，于35℃，转速135r/min的恒温振荡培养箱中培养12h，所述种子培养液体培养基的配方为：葡萄糖6g/L、牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、磷酸一氢钾2g/L、七水硫酸锰1g/L，pH＝7.0。

作为本发明一个可选实施方案，所述植物乳杆菌种子培养液是将活化好的植物乳杆菌斜面菌种单菌落接种入灭菌后的种子液体培养基中，于35℃，转速135r/min的恒温振荡培养箱中培养12h，所述种子培养液体培养基的配方为：葡萄糖20g/L、牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、磷酸一氢钾2g/L、七水硫酸锰0.25g/L、柠檬酸三钠3g/L，pH＝7.0。

所述兔血的浓度为6-14g/mL。

作为本发明一个优选方案，所述兔血的浓度为10g/mL。

作为本发明一个优选方案，所述混合种子液的接种量为4.5％。

作为本发明一个优选方案，步骤(3)中，对步骤(2)所得物，在37℃、135r/min转速下，培养3.5天。

作为本发明一个优选方案，步骤(3)中，进行离心时，用高速冷冻离心机进行离心，离心参数为：温度为4℃、转速为6000r/min、时间20min。

作为本发明一个优选方案，步骤(3)中，进行抽滤时，利用0.45μm滤膜过滤；进行超滤时，利用5KD滤膜于离心机进行，离心参数为：温度4℃，转速4000r/min，时间10min。

在本发明之前，有《枯草芽孢杆菌发酵牦牛血制备抗氧化肽工艺优化》、《牦牛血抗氧化肽制备方法对比及分离纯化研究》曾利用枯草芽孢杆菌从牦牛血中提取抗氧化肽，并取得了良好的结果。本发明在上述报道技术的基础上，对兔血进行了相应的实验，也获得了一定的效果，但总体而言，所得抗氧化肽对于ABTS+的清除率仍未能尽如人意，多肽含量较低。

在利用枯草芽孢杆菌作为发酵菌的基础上，本发明发明人将凝结芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌进行混菌发酵，但是对于所得抗氧化肽的ABTS+清除率和多肽含量并没有明显提升。经过大量的摸索，发明人发现将枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌三者混合进行混菌发酵，可以大幅度的提升发酵所得抗氧化肽对于ABTS+的清除率和多肽含量。除此之外，发明人还发现，本发明的混菌发酵所得抗氧化肽还可以大幅度的提升对于·OH和·O₂-自由基的清除。因此，本发明对于本领域的贡献在于提供了一种可以利用兔血制备具有高抗氧化性的抗氧化肽的方法。在获得上述实验结果的基础上，本发明的发明人利用枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌进行混菌发酵，发现所得抗氧化肽的对于ABTS的清除率相对于利用枯草芽孢杆菌进行单菌发酵所得的抗氧化肽并没有提升。因此，可以确定，枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌活菌和植物乳杆菌在进行发酵时，对于所得抗氧化肽的抗氧化性和多肽含量起到了协调增效的作用。

本发明的有益效果：

1、本发明所得的抗氧化肽对于ABTS自由基的清除率可达到94％，具有优异的ABTS自由基清除效果。

2、本发明制备方法制备得到的多肽含量高，多肽含量可达到3.42mg/ml。

3、本发明所得抗氧化肽对于·OH自由基的清除率可达到89.31％、对于·O₂-自由基的清除率可达到91.27％。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1.1实验材料枯草芽孢杆菌：SICC.197.四川省微生物资源平台菌种保藏中心凝结芽孢杆菌：CGMCC No.6729中国普通微生物菌种保藏管理中心植物乳杆菌：CGMCC No.5105中国普通微生物菌种保藏管理中心

1.2实验试剂

lowry法蛋白浓度试剂盒：北京索莱宝科技有限公司国产化学分析纯：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、氯化钠、葡萄糖、琼脂、ABTS、K2S2O8、三氯乙酸(TCA)、磷酸一氢钾、七水硫酸锰、磷酸二氢钠、柠檬酸三钠。

1.3仪器与设备

XW-80A型漩涡混合器：上海驰塘电子有限公司；

GZ-150-S型生化培养箱：韶关市广智科技设备有限公司；

移液枪：德国Brand公司；

超滤管(5kDa、1kDa)：德国Sartorius公司、美国Pall公司FALL04N型电子天平：常州市衡正电子仪器有限公司；

UV Power型紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科仪器有限公司；

XHF-D型高速分散器(内切式匀浆机)：宁波新芝生物科技股份有限公司；

GM-0.33型隔膜真空泵：天津市津腾实验设备有限公司；

WP-UP-UV-20型超纯水机：四川沃特尔科技发展有限公司；

JJ-CJ-2FD型洁净工作台：苏州市金净净化设备科技发展有限公司；

HHS-8S型电子恒温不锈钢水浴锅：上海光地仪器设备有限公司；

H2050R台式高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机有限公司；

QYC-2102C型恒温振荡培养箱：上海福玛实验设备有限公司。

1.4混合种子液的制备

将活化后的枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌，分别挑取适量接入装有50mL各自液体培养基的锥形瓶中，放在温度为35℃，转速135r/min的恒温振荡培养箱中培养12h，分别得到各自的种子培养液(1×10⁹cfu/mL)。试验用用培养基配制参数如下表1：

表1种子培养基的配制

其中，种子培养基1为枯草芽孢杆菌种子培养液体培养基，所述种子培养基2为凝结芽孢杆菌种子培养液体培养基，所述种子培养基3为植物乳杆菌种子培养液体培养基；调至合适pH后，高压蒸汽灭菌锅灭菌20分钟，冷却备用。

1.5抗氧化肽的发酵制备

发酵液制备：按体积比3:1:1的比例，将枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液混合，得到混合种子液；以灭菌后的兔血作为培养底物，将混合种子液接种至培养底物中，接种量为4.5％；在37℃、135r/min转速下，培养3.5天。

离心：将培养后的发酵液称取相同重量于离心管中，对称放置在高速冷冻离心机，设置离心参数为：温度为4℃、转速为6000r/min、时间20min。结束后用移液枪吸取上清液，低温下保存。

抽滤：将离心后的兔血粗提液在抽滤装置中经0.45μm滤膜过滤，去除菌体和残渣得到过滤液体，低温保存。

超滤：选用5KD的滤膜，称取等量过滤液，对称放置于离心机内，设置参数为：温度4℃，转速4000r/min，时间10min，用移液枪吸取离心管内液体，得到纯度较高的兔血抗氧化低聚肽。

1.6抗氧化活性的测定

1.6.1抗氧化肽的ABTS+清除率测定

取适量ABTS粉末溶于一定量蒸馏水中，配置成浓度为7mmol/L的ABTS溶液，加入等体积2.45mmol/L的K2S2O8溶液混合均匀，混合液在室温避光条件下静止12-16h，以磷酸盐缓冲液(0.2mol/l,pH7.4)稀释，使其在734nm时吸光度达到0.70±0.02形成墨绿色ABTS+测定液。

取4.0mL的ABTS+测定液，加入兔血抗氧化活性肽样品溶液100μL，准确振荡30s，测定反应体系在734nm处的吸光值。空白管用磷酸盐缓冲液代替样品，对照管用磷酸盐缓冲液代替ABTS+测定液。ABTS+清除率计算公式如下：

ABTS自由基清除率(％)＝[A0-(A1-A2)]/A0×100％

式中：A0—空白管的吸光度；A1—测定样品的吸光度；A2—对照管的吸光度。

1.6.2抗氧化肽的·OH清除率测定

参考张凤英的学位论文《猪血红蛋白的酶解及其产物抗氧化活性研究》中的方法进行测定，具体为：各试管中加入1mL待测样品溶液，分别加入1mL9mmol/L水杨酸—乙醇溶液与1mL 9mmol/L FeSO₄混合均匀，最后加入1mL8.8 mmol/L H₂O₂混匀，静置于37℃水浴锅保温30min，采用紫外-可见分光光度计测OD510nm。空白组以超纯水代替样品溶液，对照组以超纯水代替除样品以外3种溶液。样品对羟基自由基的清除率的计算方式如下：

ABTS自由基清除率(％)＝[1-(A1-A2)]/A0×100％

式中：A0—空白管的吸光度；A1—测定样品的吸光度；A2—对照管的吸光度。

1.6.3抗氧化肽的·O₂-清除率测定

取200μL大豆卵磷脂溶液(20mg卵磷脂，溶于5mL 0.05mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液)，和1mL不同浓度的样品溶液混合均匀，加入50μL 50mmol/L FeSO4，并以0.1mmol/L pH7.4磷酸缓冲液补足至体系总体积为3mL，37℃水浴40min，分别加入0.8mL 15g/L TCA和1mL0.8g/L TBA，沸水浴15min后冷却，6 000r/min离心10min，取上清液用紫外-可见分光光度计在532nm波长下测定其吸光度。空白组用磷酸缓冲液代替样品溶液。脂质过氧化清除率的的计算方式如下：

脂质过氧化清除率(％)＝(1－A1/A0)×100％

式中，A0为空白组的吸光度；A1为实验组的吸光度。

1.7多肽含量的测定

取4mL多肽样品加入同等体积15％(w/v)的三氯乙酸(TCA)均匀混合，静止使大分子蛋白沉淀，设置参数为6000r/min在高速离心机中离心15min，再用Lowry法测定上清液蛋白含量,计为上清液多肽含量。

即取适量Folin酚甲试剂A和B按50：1混合(混合后有效期24小时，过期失效)，根据所需量，将BSA标准品用PBS稀释10倍至浓度0.5mg/ml，取5ml离心管，标号，加入200ul适当稀释的多肽，加入2ml Folin酚甲试剂，混匀后室温放置10分钟。再加入200ul Folin酚乙试剂，混匀，37℃恒温放置30分钟，用紫外-可见分光光度计测定，设定波长为650nm，以所得吸光度计算上清液蛋白浓度，计为上清液中多肽含量。

1.8实验结果

本发明所得抗氧化肽对于ABTS+、·O₂-和·OH的清除率结果和本发明制备方法所得的多肽含量结果如表2所示：

表2

ABTS+清除率(％)	·O<sub>2</sub>-清除率(％)	·OH清除率(％)	多肽含量(mg/ml)
				94.00	89.31	91.27	3.42

对比实施例1

除了种子培养液中的菌仅含枯草芽孢杆菌之外，其余与实施例1一致。所得抗氧化肽的ABTS+清除率为84.64％、·O2-清除率为77.35％、·OH清除率为79.66％、多肽含量为2.84mg/ml。

对比实施例2

除了混合种子液是枯草芽孢杆菌种子培养液和凝结芽孢杆菌种子培养液按照3:1的比例混合而得之外，其余与实施例1一致。所得抗氧化肽的ABTS+清除率为86.13％、·O2-清除率为78.22％、·OH清除率为80.17％、多肽含量为2.80mg/ml。