阅读说明：本技术 24-羟基胆固醇在制备诊断或早期诊断精神***症的产品中的用途 (Use of 24-hydroxycholesterol in the manufacture of a product for the diagnosis or early diagnosis of schizophrenia ) 是由 李人 孙作厘 王传跃 于 2019-09-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供了24-羟基胆固醇或检测24-羟基胆固醇的试剂在制备用于诊断精神分裂症的试剂或试剂盒中的用途,以及在制备用于精神分裂症一级亲属或精神分裂症临床超高危者早期诊断精神分裂症的试剂或试剂盒中的用途。24-羟基胆固醇可以作为诊断精神分裂症的生物标志物,对精神分裂症诊断有较高的灵敏度和特异性。同时,通过对高危或超高危患者的外周血24-羟基胆固醇浓度的分析,对精神分裂症进行早期诊断,从而指导早期干预、早期预防,进而改善预后。(The invention provides an application of 24-hydroxycholesterol or a reagent for detecting 24-hydroxycholesterol in preparing a reagent or a kit for diagnosing schizophrenia and an application in preparing a reagent or a kit for early diagnosing schizophrenia in first-class relatives of schizophrenia or clinical super-high risk people of schizophrenia. The 24-hydroxycholesterol can be used as a biomarker for diagnosing schizophrenia, and has higher sensitivity and specificity for schizophrenia diagnosis. Meanwhile, the schizophrenia is diagnosed at an early stage by analyzing the concentration of 24-hydroxycholesterol in peripheral blood of high-risk or ultra-high-risk patients, so that early intervention and early prevention are guided, and the prognosis is improved.)

24-羟基胆固醇在制备诊断或早期诊断精神***症的产品中 的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脑胆固醇代谢物24-羟基胆固醇(24OHC)在精神***症诊断和早期诊断中的应用，以及制备相应的试剂的应用。

背景技术

精神***症是一种常见的精神疾病，是影响经济社会发展的重大公共卫生问题。精神***症病因不明，预后差，致残率高，是最严重、最复杂的神经精神疾病之一，其临床症状主要有幻觉、妄想、神经生理功能障碍和神经认知功能障碍等。近年来，神经影像学、基因组学、蛋白组学、免疫组化学等学科技术的发展为在基因和细胞层面了解精神***症的病因提供了重要工具，但精神***症的病理生理机制至今仍不明确。

目前，大部分精神疾病，尤其是精神***症，缺乏特异的病理诊断指标，临床诊断只能依靠症状描述及持续时间并排除其他疾病后才能凭临床经验判断，而诊断延迟或误诊对疾病的预后非常不利。因此，寻找一种具有高度稳定性、特异性和敏感性的生物标记物已成为精神***症基础研究及临床研究的重要方向。

长久以来，多数实验研究集中于神经元和大脑灰质的研究，然而，一些研究证据表明一些神经发育类疾病同样可以发生于白质，尤其是少突胶质细胞和其构成的髓鞘。髓鞘结构的形成起始于出生后，完成于成年早期，精神***症的发病恰巧在成年早期高发。另外，大量的实验研究对少突胶质细胞在细胞数量、空间、形态及髓鞘形成方面的异常的研究，为发现精神***症患者存在少突胶质细胞/髓鞘异常提供了直接证据。胆固醇是髓鞘的主要构成成分，脑中大约70％的胆固醇储存于髓鞘。精神***症患者髓鞘异常可导致胆固醇增加，从而影响胆固醇代谢。这些都提示精神***症患者可能存在脑中胆固醇代谢紊乱，为精神***症生物标记物提供了新的方向。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，目前尚无血液生物标记物在精神***症诊断及早期诊断方面得到一致认可，也就是说，现有技术中缺乏客观判断精神***症的诊断方法和早期诊断方法。

为了解决上述技术问题，需要筛选精神***症相关生物标志物，从而有助于揭示其潜在的病理生理机制，开发出客观的诊断及早期诊断的方法。有研究者认为外周血总胆固醇在精神***症患者及治疗后出现异常变化，可以作为生物标志物，但是不同研究者的结论并不一致，因此还是难以作为精神***症诊断和早期诊断的客观生物标志物。

本发明人发现，脑胆固醇主要代谢产物是24-羟基胆固醇(24-hydroxycholesterol，24OHC)，且外周血24OHC 90％以上来源于脑，这为外周血检测中枢病变提供了便利条件。因此，外周血中脑胆固醇代谢产物24OHC具有作为精神***症相关的生物标记物的潜能。

本发明人进一步研究发现，相对于健康人群，精神***症患者外周血血浆中24OHC浓度明显增加，精神***症患者临床症状与羟基胆固醇水平明显相关。同时，通过对精神***症患者的一级亲属和临床超高危人群的24OHC浓度检测发现，相对于健康人群，一级亲属及临床超高危人群血浆24OHC浓度均明显增加。因此血浆24OHC水平不仅可以作为精神***症患者诊断的生物标记物，还可用于高危或超高危人群早期诊断筛查的生物标记物。

基于上述研究发现，本发明提出了如下技术方案：

一方面，本发明提供了24-羟基胆固醇或检测24-羟基胆固醇的试剂在制备用于诊断或早期诊断精神***症的试剂或试剂盒中的用途。

另一方面，本发明提供了24-羟基胆固醇或检测24-羟基胆固醇的试剂在制备用于精神***症一级亲属或精神***症临床超高危者早期诊断精神***症的试剂或试剂盒中的用途。

优选地，上述的用途，其中所述试剂盒选自生化诊断试剂盒、免疫诊断试剂盒或分子诊断试剂盒；优选地，所述试剂盒选自Western印迹试剂盒、酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、放射免疫测定(RIA)试剂盒、放射免疫扩散试剂盒、二维双相免疫扩散试剂盒、火箭免疫电泳试剂盒、免疫组织化学染色试剂盒、免疫沉淀测定试剂盒、补体结合测定试剂盒、荧光激活细胞分选(FACS)试剂盒、适体芯片试剂盒、微阵列试剂盒和蛋白质芯片试剂盒中的一种或两种以上。

优选地，上述的用途，其中所述试剂盒包含精神***症评价量表；优选地，所述精神***症评价量表选自卡尔加里精神***症抑郁量表(CDSS)、阳性症状量表、阴性症状量表(SANS)、简明阴性症状量表(BNSS)、一般精神病形状量表和阳性与阴性症状量表(PANSS)中的一种或两种以上；更优选地，所述精神***症评价量表为阳性与阴性症状量表(PANSS)。

优选地，上述的用途，其中，所述诊断神***症包括如下步骤：

步骤1：测定受试者外周血中24-羟基胆固醇的浓度；

步骤2：将步骤1测得的24-羟基胆固醇的浓度与标准浓度进行比较；和

步骤3：判断受试者患有神***症的风险；

优选地，步骤2中，所述标准浓度为正常人群中的外周血中24-羟基胆固醇的浓度。

优选地，上述的用途，其中，所述早期诊断神***症包括如下步骤：

步骤1：测定受试者外周血中24-羟基胆固醇的浓度；

步骤2：将步骤1测得的24-羟基胆固醇的浓度与标准浓度进行比较；和

步骤3：判断受试者患有神***症的风险；

优选地，步骤2中，所述标准浓度为正常人群中的外周血中24-羟基胆固醇的浓度。

另一方面，本发明提供了用于诊断或早期诊断精神***症的试剂盒，所述试剂盒包含24-羟基胆固醇和精神***症评价量表；优选地，所述精神***症评价量表选自卡尔加里精神***症抑郁量表(CDSS)、阳性症状量表、阴性症状量表(SANS)、简明阴性症状量表(BNSS)、一般精神病形状量表和阳性与阴性症状量表(PANSS)中的一种或两种以上；更优选地，所述精神***症评价量表为阳性与阴性症状量表(PANSS)。

另一方面，本发明提供了用于诊断或早期诊断精神***症的试剂盒，所述试剂盒包含检测24-羟基胆固醇的试剂和精神***症评价量表；优选地，所述精神***症评价量表选自卡尔加里精神***症抑郁量表(CDSS)、阳性症状量表、阴性症状量表(SANS)、简明阴性症状量表(BNSS)、一般精神病形状量表和阳性与阴性症状量表(PANSS)中的一种或两种以上；更优选地，所述精神***症评价量表为阳性与阴性症状量表(PANSS)。

优选地，上述的用途或上述的试剂盒，其中所述检测24-羟基胆固醇的试剂选自24-羟基胆固醇配体或24-羟基胆固醇配体的抗体、24-羟基胆固醇的抗体、显色试剂、发光标志物、染料、荧光标志物、标准品、衍生化试剂、内标物和外标物中的一种或两种以上；优选地，所述标准品选自血清白蛋白；进一步优选的是，碱性水解试剂选自丁基羟基甲苯、氢氧化钾、乙二胺四乙酸、乙醇中的一种或以上；进一步优选地，所述衍生化试剂选自N’-二异丙基碳酰亚胺、烟酰胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或两种以上；进一步优选地，所述内标物选自D5氘胆固醇和/或D7氘胆固醇；进一步优选地，所述外标物选自D5氘胆固醇和/或D7氘胆固醇。

优选的，上述的用途或上述的试剂盒，其中所述试剂盒还含有检测27-羟基胆固醇的试剂。

本发明的有益效果包括：

本发明通过检测24-羟基胆固醇的水平作为精神***症诊断和早期诊断的依据，并提供了相应的诊断和早期诊断的试剂，其相较于传统的依靠症状描述及持续时间并排除其他疾病后才能凭临床经验判断的诊断方法，不但对精神***症诊断有较高的灵敏度和特异性，还能在发病前期预测精神***症，进行早期干预，达到早预防、早治疗的目的，从而明显的改善预后。

另一方面，24-羟基胆固醇生物标记为属于外周血指标，可方便获取，同时只需测定所述外周血24-羟基胆固醇水平一个指标，即可进行诊断和预测，方便将来推广使用。同时，所述以24-羟基胆固醇生物标记物作为诊断和早期诊断的方法，还可以联合其它检测方式得出更可靠的结果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面对所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1：健康对照和精神***症患者血浆24OHC浓度。

图2-1：精神***症患者阳性症状评分与血浆24OHC浓度的相关性。

图2-2：精神***症患者阴性症状评分与血浆24OHC浓度的相关性。

图2-3：精神***症患者一般精神病症状评分与血浆24OHC浓度的相关性。

图2-4：精神***症患者阳性与阴性症状量表评分(PANSS评分)与血浆24OHC浓度的相关性。

图3：24OHC作为精神***症诊断指标的ROC曲线。

图4：健康对照、一级亲属、临床超高危人群和精神***症患者血浆27OHC浓度。

图5-1：精神***症患者阳性症状评分与血浆27OHC浓度的相关性。

图5-2：精神***症患者阴性症状评分与血浆27OHC浓度的相关性。

图5-3：精神***症患者一般精神病症状评分与血浆27OHC浓度的相关性。

图5-4：精神***症患者阳性与阴性症状量表评分(PANSS评分)与血浆27OHC浓度的相关性。

图6：27OHC作为精神***症诊断指标的ROC曲线。

图7-1：健康对照和一级亲属人群血浆24OHC浓度。

图7-2：健康对照和临床超高危人群血浆24OHC浓度。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的方案，下面将结合本发明附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的一个实施方式中，以24-羟基胆固醇作为生物标记物，用于诊断精神***症的试剂或试剂盒中，或者用于精神***症早期诊断的试剂或试剂盒中。通过运用上述试剂或者试剂盒检测待测对象的外周血中24OHC浓度，来诊断精神***症或者早期诊断精神***症。具体的，可以抽取待测对象的外周血，分离血浆并测定24OHC浓度，抽血时间可以在接受治疗前，以对对象的患病状态进行诊断，同时，抽血时间也可以伴随治疗过程中或治疗结束后进行，以监督治疗效果。

本文中，术语“精神***症”是一种以有幻觉、妄想、神经生理功能障碍和神经认知功能障碍为主要临床特征的精神疾病。

术语“诊断”是指症状出现之后，检测和/或识别受试者的病理状态，鉴别和/或确定受试者是否患有给定的疾病或紊乱的过程，估计或者确定受试者未来的临床进展的方法。

术语“早期诊断”是指特异或非特异的症状前，对受试者进行的病理状态的检测和识别的方法。

本文中，术语“24-羟基胆固醇”(24-hydroxycholesterol，24OHC)是脑胆固醇主要代谢产物，其结构式如下：

脑内胆固醇清除途径主要有2种：一种是经由载脂蛋白E(ApoE)通过脑脊液转运出脑；另一种更为主要的途径是氧化代谢方式：每日约有6-7mg的胆固醇以24-羟基胆固醇的形式通过血脑屏障进入血液循环，此过程由脑内神经元所独有的胆固醇-24羟化酶(CYP46)——一种细胞色素氧化酶P450催化完成。24-羟基胆固醇与胆固醇在脑内的分布基本一致，主要存在于髓鞘中。

在本发明的一个具体实施例中，所述用于诊断精神***症的试剂、所述用于早期诊断精神***症的试剂被制备成试剂盒，所述试剂盒可以为生化诊断试剂盒、免疫诊断试剂盒、或分子诊断试剂盒等，优选制备成所述免疫诊断试剂盒。

所述诊断试剂盒是指采用免疫学、微生物学、分子生物学等原理或方法制备的、在体外用于对人类疾病的诊断、检测及流行病学调查等的试剂盒。

所述诊断试剂盒可以为本领域公知的类型，包括但不限于Western印迹试剂盒、酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、放射免疫测定(RIA)试剂盒、放射免疫扩散试剂盒、ouchterlony免疫扩散试剂盒、火箭免疫电泳试剂盒、免疫组织化学染色试剂盒、免疫沉淀测定试剂盒、补体结合测定试剂盒、荧光激活细胞分选(FACS)试剂盒、适体芯片试剂盒、微阵列试剂盒、蛋白质芯片试剂盒等。

所述试剂盒中，包括所述检测24OHC的试剂，所述试剂指能够特异性测定24OHC浓度的分子，包括但不限于可以特异性结合于24OHC的核酸分子、蛋白质、化合物等。

在本发明的一个具体实施例中，可以选择能够特异性结合24OHC的蛋白质作为所述检测24OHC的试剂，在本发明的另一个具体实施例中，优选抗体作为所述检测24OHC的试剂，所述抗体可以是可特异性结合到标志物蛋白的抗体，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体及其抗原结合片段，只要其保留了抗原结合功能即可。

在本发明中，所述检测24OHC的试剂上可以连接有能够被检测的标记分子。

下面，参考具体实施例更详细地描述本发明，然而，实施例仅用于说明目的，对于本发明不具有限制作用。

以下实施例中所用到各试剂和仪器来源如下表1所示，本文未记载的试剂或仪器或操作步骤均是本领域普通技术人员可常规确定的内容：

表1实施例所用试剂和仪器

试剂/仪器	型号/规格	厂家
			醋酸铵	500g含量≥98％	国药集团化学试剂
甲酸	50ml	Fluka
			甲基叔丁基醚	1L含量≥99.9％	Merck
N’-二异丙基碳酰亚胺	D125407 25g含量≥99％	Merck
			烟酰胺	72340 100g含量≥99％	Merck
4-二甲氨基吡啶	107700 25g含量≥99％	Merck
			甲醇	34860 4L含量≥99.9％	Merck
高效液相色谱仪	安捷伦G1312B	安捷伦
			质谱仪	AB Sciex Qtrap 6500	美国ABI公司

实施例

实施例1：外周血的采集以及测定外周血24OHC的浓度的方法

1.根据已通过的伦理审查实验方案以及诊断标准，筛选出健康对照人群(HC)、精神***症遗传高危(患者的一级亲属，FDR)、临床超高危(UHR)及精神***症患者(SCZ)4组共312人。各组的入排标准如下：

健康对照：采用美国精神疾病诊断与统计手册第四版(Structured ClinicalInterview for DSM Disorders-Fourth Edition，DSM-IV)临床定式访谈(StructuredClinical Interview for DSM-IV Axis I disorders-Patient Edition，SCID-I/P)及SIPS进行筛查显示无精神疾病，无精神病家族史人群。

精神***症患者入组标准：符合美国精神疾病诊断与统计手册四版诊断标准(DSM-IV)，无明确诊断的除精神***症外的其他精神疾病、神经系统和其他严重躯体疾病病史；无神经系统疾病家族史。排除极度兴奋、冲动、不合作者；三个月内参加过其他科研治疗或接受过MECT治疗的患者。患者的一级亲属排除神经、精神疾病及其他严重躯体疾病可入组遗传高危组。

临床高危经精神病风险综合征定式访谈(SIPS)筛查符合精神病风险综合征标准三种情况中的一种或多种。

所有受试者均为14-55岁，排除妊娠或哺乳期妇女，有食物药物过敏史者，因其他躯体疾病不能中断使用药物者，酒精和药物滥用史，头部外伤史人群。

使用DSM-Ⅳ临床定式访谈(Structured Clinical Interview for DSMDisorders,SCID)筛查患者和正常被试，使用阳性和阴性量表(PANSS)评定患者的临床精神病理症状。同时抽取外周血5毫升于EDTA抗凝管内，3000转/分离心10分钟，分离上层血浆，并即刻分装，储藏与-80℃超低温冰箱，备用。

2.将血浆经过萃取后经高效液相色谱-质谱方法检测24OHC含量，具体方法如下：

(1)用5％的牛血清白蛋白溶液配制24OHC的浓度为1-2000ng/ml的标准品溶液，用5％的牛血清白蛋白溶液作为空白样品。

(2)在1.5ml EP管中加入50μl标准品/空白样品/待测血浆，然后加入50μl内标(D5氘胆固醇+D7氘胆固醇50ng/ml)，之后加入200μl酸性缓冲液(50mM醋酸铵，1％甲酸)和1ml甲基叔丁基醚。

(3)经充分混合均匀后，把样品放在-80℃冰箱中，待其中的水相冷却结晶后，把0.5ml甲基叔丁基醚相(上清液)转移到1.5ml离心管中。

(4)把甲基叔丁基醚在35℃氮气吹干。

(5)在每个EP管中加入50μl的衍生化试剂(63mg N,N’-二异丙基碳酰亚胺，62mg烟酰胺和61mg 4-二甲氨基吡啶溶于5ml氯仿中)，于35℃加热混合2小时。

(6)用35℃氮气吹干二氯甲烷。

(7)100μl甲醇复溶后进样检测。

之后的实施例中，均采用本实施例记载的方法采集外周血以及测定外周血24OHC的浓度。

实施例2：外周血24OHC或27OHC作为生物标记物用于精神***症诊断

1.本研究纳入性别匹配的受试者共312人，各组的基本人口资料及患者症状评估见表2。

表2：受试者基本人口情况及患者临床症状评估

注：HC：健康对照；FDR：精神***症一级亲属；UHR：精神***症临床超高危；SCZ：精神***症患者；SIPs：精神病风险综合征定式访谈；PANSS：阳性和阴性症状量表；P：阳性症状；N：阴性症状；G：一般精神病性症状：T：总分；NA：缺失值。

经过血浆24OHC检测，发现与健康对照组相比，精神***症患者血浆24OHC明显增加(图1，p<0.05)，这提示患者脑中胆固醇代谢明显上升，可能成为精神***症诊断的潜在生物标记物。相关分析结果显示，精神***症患者临床症状与羟基胆固醇水平明显相关(图2-1至图2-4)，其中，24OHC与阴性症状及PANSS总分成正相关，进一步证明了羟基胆固醇水平的变化与疾病发生发展的关系。结合受试者家族史指标，24OHC的浓度作为诊断指标做接受者操作特性曲线(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲线(图3)，曲线下面积为0.703，诊断灵敏度和特异度分别为71.6％和61.1％。

经过血浆27OHC检测，发现与健康对照组相比，精神***症患者血浆27OHC水平明显降低(图4，p<0.0001)，这提示患者胆固醇代谢明显降低，可能成为精神***症诊断的潜在生物标记物。相关分析结果显示，精神***症患者临床症状与27OHC水平明显相关(图5-1至图5-4)，其中，27OHC与阳性症状成负相关(图5-1)，进一步证明了27OHC水平的变化与疾病发生发展的关系。结合受试者家族史指标和27OHC作为诊断指标做接受者操作特性曲线(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲线(图6)，曲线下面积为0.741，诊断灵敏度和特异度分别为48.0％和88.9％。

实施例3：外周血24OHC或27OHC作为生物标记物用于精神***症早期诊断

为了进一步了解24OHC或27OHC能否作为早期诊断标记物，其水平变化是否早于症状的出现，下一步对精神***症一级亲属及临床超高危人群进行检测。

结果显示，与正常对照相比，一级亲属及临床超高危人群血浆24OHC水平均明显增加(图7-1和图7-2，p<0.05)。这提示脑胆固醇代谢的变化早于症状出现，可以作为早期筛查的客观标记物。但是一级亲属及临床超高危人群与健康对照组相比，27OHC水平没有明显变化(图4)，表明27OHC在精神***症中的降低不是发病前出现的。

通过以上实施例2和实施例3可以看出，本发明通过选择外周血24OHC或27OHC作为生物标记物对精神***症患者的病情进行诊断，实现了对于精神***症的客观诊断方法，对精神***症诊断有较高的灵敏度和特异性。同时，另一方面，通过对高危或超高危患者对外周血24OHC浓度的分析，发现外周血24OHC还可以作为精神***症早期诊断的指标，从而指导早期干预、早期预防，进而改善预后。