阅读说明：本技术 用于测定高密度脂蛋白胆固醇的方法 (Method for measuring high density lipoprotein cholesterol ) 是由 叶学松 梁波 自强 于 2019-09-17 设计创作，主要内容包括：用于测定高密度脂蛋白胆固醇的方法,包括以下操作：获得10微升体液样本,将体液样本加入上述试纸的加样区,等待反应,用荧光免疫分析仪测量试纸上的量子点线条的荧光强度,比对荧光强度-胆固醇浓度曲线获得高密度脂蛋白胆固醇含量。本发明利用双氧水淬灭量子点的方式来检测高密度脂蛋白的含量,精度高,所需样本量少的优点。(method for determining high density lipoprotein cholesterol comprising the following operations: and (3) obtaining a 10 microliter body fluid sample, adding the body fluid sample into the sample adding area of the test paper, waiting for reaction, measuring the fluorescence intensity of a quantum dot line on the test paper by using a fluorescence immunoassay analyzer, and comparing the fluorescence intensity with a cholesterol concentration curve to obtain the content of the high-density lipoprotein cholesterol. The method provided by the invention has the advantages of high precision and less required sample amount by detecting the content of the high-density lipoprotein in a hydrogen peroxide quenching quantum dot mode.)

用于测定高密度脂蛋白胆固醇的方法

技术领域

本发明涉及高密度脂蛋白胆固醇测定方法，具体涉及一种用于高密度脂蛋白胆固醇测定的试纸条及其制备方法。

背景技术

POCT，即时检验(point-of-care testing)，指在病人旁边进行的临床检测及床边检测(bedside testing)，通常不一定是临床检验师来进行。是在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，快速得到检验结果的一类新方法。随着人们生活水平的提高，人们的健康意识正在加强，POCT诊断设产品也越来越受到人们的青睐。由于POCT诊断产品具有体积小，操作简单，不需要操作人员有较强的专业性便可得到准确的结果，这使得人们在家庭完成检验成为可能。，

胆固醇可与血清中的脱辅蛋白质配合形成脂蛋白，脂蛋白分为乳糜微粒、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白。从流行病学上看，HDL胆固醇的水平与动脉硬化性疾病发生频率成反相关，其检测广泛用于预防或诊断缺血性心脏病。传统的用于检测HDL胆固醇的方法多首先使用离心或电泳将HDL分离，然后再进行后续操作，这些方法往往过程繁琐，需要具有专业技能的人才能完成相关操作，因此这些方法不适用于家庭使用。

目前已经有相关专利报道了可对高密度脂蛋白胆固醇快速检测的产品，例如专利(CN 1258601 C)公开了一种高密度脂蛋白(HDL)胆固醇测定用试件，方法使用两种表面活性剂实现高密度脂蛋白(HDL)与非高密度脂蛋白的分离，所述试件结构简单，检测方便快捷。专利(US 7374719 B2)通过将经不同的试剂处理的功能层固定于设计好的试纸卡壳中实现了同时对总胆固醇，高密度脂蛋白胆固醇及甘油三酯的检测，并通过计算，间接给出非高密度脂蛋白胆固醇的量，方法快捷方便，需要35μL的样本量。

尽管上述所报道的产品均适合用于家庭快速诊断，但由于以上产品均是基于显色原理，例如专利(US 7374719 B2)通过光反射检测生成产物的颜色变化，进而得知样本中被测物的量。由于显色本身需要反应层生成较多的产物以使颜色达到一定的深度变化才能被检测，这使得这些产品进行检测时需要较高的样本量，同时，显色本身涉及到酶反应，这增加了产品涉及的酶的种类及用量。再者，酶反应受样本基质影响很大，因而上述产品面临更大的“基质效应”，从而给检测结果带来更大的不确定性。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种利用双氧水淬灭量子点的方式来检测高密度脂蛋白的检测装置。这种检测装置能够分离出体液样本中的高密度脂蛋白，使将分离出来的高密度脂蛋白进行氧化反应产生双氧水，扩散到量子点线条，发生碳量子点荧光淬灭反应，碳量子点荧光淬灭反应表征高密度脂蛋白含量，从而实现高密度脂蛋白含量测试的目的。

本发明的第一方面，在于提供一种高密度脂蛋白胆固醇测定试纸，该试纸包括分离层，反应层和检测层；分离层接受样本并将高密度脂蛋白从样本中分离，分离获得的高密度脂蛋白渗透到反应层，反应层的产物包括双氧水；双氧水渗透到检测层，检测层包括扩散部和量子点线条，双氧水先渗透到扩散部，再从扩散部扩散到量子点线条。

优选的，分离层在反应层之上，反应层在检测层之上。样本在重力的作用下逐层向下渗透。

优选的，在仰视方向，反应层完全覆盖分离层；在俯视方向上，反应层部分覆盖检测层的扩散部，量子点线条位于未被反应层覆盖的部分。反应层生成的双氧水先渗透到扩散部，再从扩散部扩散到量子点线条。使量子点线条在反应层和分离层之外，便于量子点线条直接被观测和检验。当然，量子点线条被覆盖在反应层和分离层下方也可以，只要荧光免疫分析仪能够检测到量子点线条即可。

在一些优选的方式中，试纸包括过滤层，样本从过滤层加入，过滤后的样本渗透到分离层。过滤层的目的在于过滤血细胞，使试纸能够适用于全血样本。试纸不设置过滤层也可以，适用于除全血以外的体液样本，比如血浆等。

在一些优选的方式中，检测层采用硝酸纤维素膜(Millipore 135)，在硝酸纤维素膜上划上量子点线条。优选的，量子点线条至少1条。优选的，量子点线条为3条。

优选的，过滤层处理试剂配方：蔗糖：50.0g/L，表面活性剂S9：2.0g/L，吐温-20：1.0g/L，聚乙烯吡咯烷酮K30：5.0g/L，乙二胺四乙酸二钾0.10g/L，使用 0.01mol/L PBS(pH7.4)配制。

在一些优选的方式中，血液过滤层处理试剂配方包括：蔗糖：50.0g/L，

表面活性剂S9：2.0g/L；

吐温-20：1.0g/L；

聚乙烯吡咯烷酮K 30：5.0g/L；

乙二胺四乙酸二钾：0.1g/L；

使用0.01mol/L PBS(pH 7.4)配制

在一些优选的方式中，高密度脂蛋白分离层处理试剂配方：

硫酸镁：5.0g/L；

磷钨酸：50.0g/L；

山梨醇：10.0g/L；

蔗糖：50.0g/L，

使用0.01mol/L PBS(pH 6.5)配制

在一些优选的方式中，高密度脂蛋白反应层处理试剂配方：

曲拉通X-100：3.0g/L；

牛血清白蛋白：1.0g/L；

Gantrez AN139：10.0g/L；

蔗糖：50.0g/L；

胆固醇氧化酶：70.00KU/L；

胆固醇酯酶：180.00KU/L；

聚乙烯吡咯烷酮-K30：5.0g/L；

乙二胺四乙酸二钠：10.0g/L；

Proclin300 1.0g/L；

使用0.01mol/L PBS(pH 5.5)配制。

在一些优选的方式中，检测层之下设有不透水的基板，检测层固定于基板上。优选的，反应层、分离层和过滤层逐层置于检测层之上，各层被面盖压紧固定。压紧固定是指各层在压力的作用下相互贴紧，且在使用和保存或运输等过程中，各层之间不发生相互位移。面盖和基板的连接可以采用现有的试纸产品的面盖和基板的连接方式，只需要在面盖上设置压紧反应层、分离层和过滤层的部位即可，比如用柱子压紧各层的四角，或者用凸条压紧各层的边缘。优选的，面盖上设有加样孔和显示窗，量子点线条位于显示窗，过滤层接受样品的部位外露于加样孔。也就是说，试纸可以是完全外露于加样孔，也可以是只有部分外露于加样孔。当量子点线条被反应层覆盖时，在基板之下设置使量子点线条外露的孔，或者是试纸检测完成后，将面盖拆开，取出检测层(或检测层与基板一起)，露出量子点线条，进行荧光检测。

本发明结合了层析和量子点淬灭原理，具有血液过滤层，高密度脂蛋白分离层，高密度脂蛋白反应层，划有量子点线条的检测层。试纸条以PVC胶板为基板作支撑体，其中划有量子点线条的检测层粘贴于PVC胶板支撑体上，其他各层按设定顺序自然堆积于划有量子点线条的检测层上，并于检测层上的检测区间隔开设定距离。各层之间靠面盖提供的压力紧密接触，其中卡壳可直接使用荧光免疫层析卡壳。由于采用了荧光淬灭原理，所述试纸条仅需少量样本，可用于全血，血清及可能含有高密度脂蛋白的体液样本。

本发明的第二方面，目的在于提供一种制作上述试纸的方法。该方法包括以下步骤：制作检测层：配置检测层试剂，将检测层试剂加到检测层上、使检测层湿润，将具有检测层试剂的检测层烘干；在烘干后的检测层上划量子点线条；制作分离层：配置分离层试剂，将分离层试剂加到分离层上、使分离层湿润，将具有分离层试剂的分离层烘干；制作反应层，将反应层试剂加到反应层上、使反应层湿润，将具有反应层试剂的反应层烘干；检测层、反应层、分离层可以同时制作或者先后制作；将反应层放在检测层之上，量子点线条位于反应层覆盖的区域之外；分离层与反应层重叠，并位于反应层之上；将分离层、反应层和检测层压紧，并且露出加样部位和量子点线条。

优选的，制作过滤层，将过滤层试剂加到过滤层上、使过滤层湿润，将具有过滤层试剂的过滤层烘干；将过滤层叠在分离层之上，再将过滤层、分离层、反应层和检测层压紧。

优选的，检测层为硝酸纤维素膜。优选的，分离层为芯硅谷定性滤纸。优选的，反应层为玻璃纤维膜。

在一些优选的方式中，制作面盖和基板，检测层、反应层和分离层，和、或过滤层被压紧于面盖和基板之间。

本发明的第三个方面，目的在于提供一种上述试纸的用于测定高密度脂蛋白胆固醇的方法。

用于测定高密度脂蛋白胆固醇的方法，包括以下操作：获得10微升体液样本，将体液样本加入上述试纸的加样区，等待反应，用荧光免疫分析仪测量试纸上的量子点线条的荧光强度，比对荧光强度-胆固醇浓度曲线获得高密度脂蛋白胆固醇含量。

优选的，同一批次的试纸是由同一次配置的试剂生产获得，随机抽取多个试纸，对已知浓度的高密度脂蛋白胆固醇标准品进行测试，用荧光免疫分析仪测量各试纸上的荧光强度，以胆固醇浓度和荧光强度分别作为坐标绘制图谱，将胆固醇浓度-荧光强度对应点对应在图谱上，将所有对应点拟合成标准曲线，并计算标准曲线对应的关系公式；实际使用时，将荧光强度通过标准曲线或者关系公式获得胆固醇浓度。

优选的，试纸上有多条量子点线条，以所有量子点线条的荧光强度均值作为当前试纸的荧光强度。

本发明改变显色的检测原理，使用一种可被高密度脂蛋白胆固醇的氧化产物，即双氧水淬灭的量子点来检测被测物中高密度脂蛋白胆固醇的量。由于极微量的双氧水便可引起量子点淬灭，因此可使用较少的样本量对目标物质实现灵敏检测。同时由于去除了显色用的酶，也使得试纸受样本基质影响的可能性变小。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

(1)所述试纸使用较小的样本量10μL,操作方便快捷，不需要操作人员具有较高的专业水平便可对高密度脂蛋白胆固醇实现快速准确检测，同时由于避免了使用显色用酶，降低了由于样本基质差异对检测结果的影响。

(2)所述试纸使用现有的荧光免疫层析卡壳便可完成组装，不需要灵性设计。

(3)所述试纸使用现有的荧光免疫分析仪便可完成快速检测

(4)所述试纸条反应区经不同功能酶处理后，原则上可用于所有经酶处理后，可产生双氧水的物质检测，例如甘油三脂，总胆固醇，肌酐等。

附图说明：

图1：实施例1制备试纸条标准曲线。

图2：实施例2制备试纸条标准曲线。

图3：实施例3制备试纸条标准曲线。

图4：实施例4制备试纸条标准曲线。

图5：实施例4制备试纸条与贝克曼生化仪检测结果比对。

图6：试纸条结构图。

图中标识：1：过滤层；2：分离层；3：反应层；4：检测层；5：基板；6：量子点线条

具体实施方式

结合附图，详细说明本发明：

如图6所示，高密度脂蛋白胆固醇测定试纸，该试纸包括分离层2，反应层3 和检测层4；分离层2接受样本并将高密度脂蛋白从样本中分离，分离获得的高密度脂蛋白渗透到反应层3，反应层3的产物包括双氧水；双氧水渗透到检测层 4，检测层4包括扩散部和量子点线条6，双氧水先渗透到扩散部，再从扩散部扩散到量子点线条6。

分离层2在反应层3之上，反应层3在检测层4之上。样本在重力的作用下逐层向下渗透。

在一些实施例中，在仰视方向，反应层3完全覆盖分离层2；在俯视方向上，反应层3部分覆盖检测层4的扩散部，量子点线条6位于未被反应层3覆盖的部分。反应层3生成的双氧水先渗透到扩散部，再从扩散部扩散到量子点线条。使量子点线条6在反应层3和分离层2之外，便于量子点线条6直接被观测和检验。当然，量子点线条6被覆盖在反应层3和分离层2下方也可以，只要荧光免疫分析仪能够检测到量子点线条6即可。

在一些优选的方式中，试纸包括过滤层1，样本从过滤层1加入，过滤后的样本渗透到分离层2。过滤层1的目的在于过滤血细胞，使试纸能够适用于全血样本。试纸不设置过滤层1也可以，适用于除全血以外的体液样本，比如血浆等。

在一些优选的方式中，检测层4采用硝酸纤维素膜(Millipore 135)，在硝酸纤维素膜上划上量子点线条6。优选的，量子点线条6至少1条。优选的，量子点线条6为3条。

在一些优选的方式中，检测层4之下设有不透水的基板5，检测层4固定于基板5上。优选的，反应层3、分离层2和过滤层1逐层置于检测层4之上，各层被面盖压紧固定。压紧固定是指各层在压力的作用下相互贴紧，且在使用和保存或运输等过程中，各层之间不发生相互位移。面盖和基板5的连接可以采用现有的试纸产品的面盖和基板5的连接方式，只需要在面盖上设置压紧反应层3、分离层2和过滤层1的部位即可，比如用柱子压紧各层的四角，或者用凸条压紧各层的边缘。优选的，面盖上设有加样孔和显示窗，量子点线条6位于显示窗，过滤层1接受样品的部位外露于加样孔。也就是说，试纸可以是完全外露于加样孔，也可以是只有部分外露于加样孔。当量子点线条6被反应层3覆盖时，在基板5 之下设置使量子点线条6外露的孔，或者是试纸检测完成后，将面盖拆开，取出检测层4(或检测层4与基板5一起)，露出量子点线条6，进行荧光检测。

实施例1

检测层处理试剂配方：

曲拉通X-100：3.0g/L；

使用0.01mol/L PBS(pH 7.4)配制

血液过滤层处理试剂配方：

蔗糖：50.0g/L；

表面活性剂S9：2.0g/L；

吐温-20：1.0g/L；

聚乙烯吡咯烷酮K 30：5.0g/L；

乙二胺四乙酸二钾0.1g/L；

使用0.01mol/L PBS(pH 7.4)配制

高密度脂蛋白分离层处理试剂配方：

硫酸镁：5.0g/L；

磷钨酸：50.0g/L；

山梨醇：10.0g/L；

蔗糖：50.0g/L；

使用0.01mol/L PBS(pH 6.5)配制

高密度脂蛋白反应层处理试剂配方：

Triton X-100：3.0g/L；

BSA：1.0g/L；

Gantrez AN139：10.0g/L；

蔗糖：50.0g/L；

胆固醇氧化酶：70.00KU/L

胆固醇酯酶：180.00KU/L

PVP K-30：5.0g/L；

乙二胺四乙酸二钠：10.0g/L；

Proclin300 1.0g/L；

使用0.01mol/L PBS(pH 5.5)配制

第一步：检测层采用硝酸纤维素膜(Millipore 135)，使用相应试剂处理后将其在37℃下进行干燥24h后，使用划膜机将量子点划于检测层上干燥备用；

第二步：使用相应配制试剂分别处理血液过滤层(金标玻纤SB08)，高密度脂蛋白分离层(Q5777定量滤纸)，高密度脂蛋白反应层(Ahlstrom 8964)，37℃下干燥24h后备用；

第三步：将干燥后各层按照各自位置和顺序放置(如图6)，使用面盖和基板夹紧。

如图1所示，通过荧光强度和胆固醇浓度对应点拟合出线性的关系，关系式为： y＝-65.24x+11349.33，R²＝0.998，当前批次试纸为合格品。

实施例2

第一步：检测层采用硝酸纤维素膜(赛多利斯140)，使用相应试剂(见实施例1)处理后将其在37℃下进行干燥24h后，使用划膜机将量子点划于检测层上干燥备用；

第二步：使用相应配制试剂(见实施例1)分别处理血液过滤层(金标玻纤 SB08)，高密度脂蛋白分离层(Q5777定量滤纸)，高密度脂蛋白反应层(Q5777定量滤纸)，37℃下干燥24h后备用；

第三步：同实施例1第三步。

本实施例中试剂的配方与实施例1相同。但是每一次配置试剂时，由于实际操作中不可避免的误差，使不同批次的试纸的关系曲线会略有差异。不同批次配置的试剂，荧光强度-胆固醇浓度曲线的拟合结果会不一样，拟合效果看R值，R 值越接近于1越好。

如图2所示，通过荧光强度和胆固醇浓度对应点拟合出线性的关系，关系式为： y＝-55.381x+10747.09，R²＝0.997，当前批次试纸为合格品。

实施例3

第一步：检测层采用硝酸纤维素膜(赛多利斯140)，直接使用划膜机将量子点划于检测层上干燥备用；

第二步：使用相应配制试剂分别处理血液过滤层(金标玻纤SB08)，高密度脂蛋白分离层(Q5777定量滤纸)，高密度脂蛋白反应层(Ahlstrom 8964)，37℃下干燥24h后备用；

第三步：同实施例1第三步。

如图3所示，通过荧光强度和胆固醇浓度对应点拟合出线性的关系，关系式为： y＝-42.185x+10179.31，R²＝0.9994，当前批次试纸为合格品。

实施例4

检测层处理试剂配方：

Triton X-100：3.0g/L；

使用0.01mol/LBBS(pH 7.4)配制

第一步：检测层采用硝酸纤维素膜(Millipore 135)，直接使用划膜机将量子点划于检测层上干燥备用；

第二步：使用相应配制试剂分别处理血液过滤层(金标玻纤SB08)，高密度脂蛋白分离层(Q5777定量滤纸)，高密度脂蛋白反应层(Ahlstrom 8964)，37℃下干燥24h后备用；

第三步：同实施例1第三步。

如图4所示，通过荧光强度和胆固醇浓度对应点拟合出线性的关系，关系式为： y＝-52.66x+10657，R²＝0.999，当前批次试纸为合格品。

检测

血液稀释液

吐温-20 1.0g/L；

乙二胺四乙酸二钠 0.1g/L；

Proclin300 1.0g/L；

聚乙烯吡咯烷酮K30 5.0g/L；

牛血清白蛋白 10.0g/L；

表面活性剂S9 2.0g/L；

使用0.01mol/L PBS(pH 7.4)配制

1：取10μL血液与500μL的血液稀释液中，摇匀备用。

2：取100μL稀释后样本与血液过滤层，待5～10min，使用荧光免疫分析仪检测，取三条量子点线条荧光强度峰值平均值作信号值。

结果

图1～4四分别为实施例1～4的标准曲线，从拟合曲线可以看出本发明所制备的试纸条在HDL-C浓度范围0～100ng/mL内具有很好的线性，各实施例的线性相关系数均在0.99以上，说明本试纸条在HDL-C分析中具有很大的潜力。从各实施例的标准曲线还可以看出，在HDL-C浓度较低时，各实施例均表现出较差的线性，这可能是因为在HDL-C浓度较低时，所产生的双氧水较少，此时量子点对双氧水表现的不够灵敏所致。图5是实施例3所制备的试纸条同Beckman的检测结果的比对图，表现出较好的相关性。