阅读说明：本技术 一种用3个血清生化指标诊断/预警围产期脂肪肝奶牛的方法 (Method for diagnosing/early warning perinatal fatty liver dairy cows by using 3 serum biochemical indexes ) 是由 师科荣 胡成长 张璇 张乐天 王中华 闫振贵 王生轩 李冉冉 徐忠金 杜红霞 于 2019-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一组可用于诊断/预警围产期脂肪肝奶牛的血清生化指标,所述血清生化指标组合由AST、GLU和TCHO组成。采用本发明的血清生化指标组合可以准确可靠的诊断脂肪肝奶牛的发病程度以及在牛群中的发病比例,可为奶牛的养殖生产提供有价值的参考,提高养殖效益,增产增效。(The invention discloses a group of serum biochemical indicators for diagnosing/early warning perinatal fatty liver cows, wherein the serum biochemical indicator combination consists of AST, GLU and TCHO. The serum biochemical index combination can accurately and reliably diagnose the morbidity degree of the fatty liver dairy cows and the morbidity proportion of the fatty liver dairy cows in a herd, can provide valuable reference for the breeding production of the dairy cows, improves the breeding benefit, and increases the yield and the efficiency.)

一种用3个血清生化指标诊断/预警围产期脂肪肝奶牛的方法

技术领域

本发明涉及分析化学及临床医学技术领域，具体涉及一种利用3个血清生化指标诊断/预警围产期脂肪肝奶牛的方法。

背景技术

脂肪肝发生在奶牛的产犊早期，高产奶牛更容易发生脂肪肝。脂肪肝病发生时，常常伴随着***炎、胎衣不下、皱胃变位和子宫炎等。胎衣不下和子宫炎的奶牛在再次接种受孕时受孕率低，产生死胎的可能性增加；患有***炎的奶牛产奶量下降，而且所产奶因不及卫生标准而弃用。各种迹象都表明脂肪肝会严重影响到奶牛养殖业的发展。另外，脂肪肝发病早期没有明显临床症状，一经发现便已经是中度甚至重度脂肪肝，要完全治愈需要花费大量的人力和财力。因此，及时的诊断和有效的预防措施可以预防或及早诊断脂肪肝的发生，及时调整养殖措施，避免造成经济损失。

为实现对奶牛脂肪肝发生的及早诊断，有研究尝试通过血液中一些指标来对脂肪肝的发生进行预测。Emmanouil Kalaitzakis等人(2010)研究认为在一定条件下可以通过血液中鸟氨酸氨甲酰基转移酶和谷氨酸脱氢酶活性以及NEFA与胆固醇脂比例预测脂肪肝。Horea等人(2009)的研究则声称干奶期甲状腺机能减退可能是产后脂肪肝的早期指标。Hachenberg等(2007)人的研究认为血清NEFA、IGF-1的变化可以作为脂肪肝诊断的血清学指标。Shen等(2018)的研究认为血清FGF-21和总血红蛋白是奶牛脂肪肝的潜在标记物。但是这些研究都没有提出一个脂肪肝程度与血清指标的量化关系，而且对脂肪肝诊断的准确性不能确定，因此不适用生产上指导脂肪肝的诊断。

Reid计算了各血清指标脂肪含量的相关性，找到NEFA、GLU、AST和Bilirubin与肝脏脂肪含量是显著相关的。其中Bilirubin与NEFA、GLU和AST都具有相关性，而NEFA与GLU和AST三个指标之间不存在相关性。所以Ried利用NEFA、GLU和AST三个指标与脂肪含量建立方程Y＝-0.51-0.0032NEFA+2.84GLU-0.0528AST(Reid et al,1983)，当Y≥0时可判断奶牛患轻度脂肪肝(<20％，fat)，当Y<0时可判断奶牛患中度或重度脂肪肝(>20％fat)。Reid提出的方程可以在一定范围初步判断疑似脂肪肝奶牛和正常奶牛。但该方案中只测定了8个血清指标，其他一些与脂肪肝发生密切相关的指标没有测定；而且该方程经肝活检验证，该方程的诊断结果存在较大偏差。在各个牛场中对于判断奶牛是否患有脂肪肝的实用性不强，用于临床诊断的准确性低，容易出现判断偏差的情况。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一组可用于诊断/预警围产期脂肪肝奶牛的血清生化指标。采用本发明的血清生化指标组合可以准确可靠的诊断脂肪肝奶牛的发病程度以及在牛群中的发病比例，可为奶牛的养殖生产提供有价值的参考，提高养殖效益，增产增效。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供血清生化指标组合在制备诊断/预警围产期脂肪肝奶牛的试剂或试剂盒中的用途；

所述血清生化指标组合由门冬氨酸氨基转移酶(AST)、葡萄糖(GLU)和总胆固醇(TCHO)组成。

本发明的第二方面，提供测定血清生化指标AST、GLU和TCHO的试剂在制备奶牛脂肪肝病的诊断试剂盒中的用途。

上述用途中，所述诊断试剂盒能够判断脂肪肝的发病程度。

上述用途中，血清生化指标AST、GLU和TCHO与奶牛脂肪肝病密切相关，利用所述3个血清生化指标建立脂肪肝奶牛诊断的线性方程，根据线性方程判断脂肪肝的发病程度。

所述线性方程为：C＝1.68772-0.00008523AST-0.40724GLU-0.05079TCHO。

上述线性方程中，AST、GLU、TCHO分别表示这三种血清生化指标在血清中的含量；其单位分别是：AST(IU/L)、GLU(mmol/L)、TCHO(μmol/L)。

上述3个血清生化指标均可以利用全自动生化仪进行测定。

根据线性方程判断脂肪肝发病程度的方法为：当C≤0.05时为正常奶牛；0.05<C≤0.20时为轻度脂肪肝奶牛；0.20<C<0.85时为中度脂肪肝奶牛；当C≥0.85时，为重度脂肪肝奶牛。

本发明的第三方面，提供一种用于判定奶牛脂肪肝发病程度的系统，该系统包括：

数据获取模块：用于获取奶牛血清中生化指标的含量数据，所述生化指标包括：AST、GLU和TCHO；

数据处理模块：用于接收数据获取模块所获取的含量数据，并将含量数据代入预设的线性方程进行处理；

结果判定模块：用于接收数据处理模块处理后获得的数值，并根据数值对奶牛脂肪肝的发病程度进行判定。

所述预设的线性方程为：C＝1.68772-0.00008523AST-0.40724GLU-0.05079TCHO。

上述线性方程中，AST、GLU、TCHO分别表示这三种血清生化指标在血清中的含量；其单位分别是：AST(IU/L)、GLU(mmol/L)、TCHO(μmol/L)。

上述3个血清生化指标含量数据的获取均可以利用全自动生化仪进行测定。

优选的，根据数值对奶牛脂肪肝的发病程度进行判定的方法为：当C≤0.05时为正常奶牛；0.05<C≤0.20时为轻度脂肪肝奶牛；0.20<C<0.85时为中度脂肪肝奶牛；当C≥0.85时，为重度脂肪肝奶牛。

本发明的有益效果：

(1)本发明建立了利用3个血清生化指标(门冬氨酸氨基转移酶AST、葡萄糖GLU和总胆固醇TCHO)进行脂肪肝奶牛诊断的线性方程C，根据线性方程计算得到的C值，可以判断脂肪肝的发病程度，能够实现在生产中尽早发现和诊断潜在的脂肪肝患病奶牛。

(2)基于本发明所建立的线性方程C，本发明还设计了一种用于判定奶牛脂肪肝发病程度的系统，利用该系统可以实现诊断脂肪肝奶牛的发病程度以及在牛群中的发病比例，可为奶牛的养殖生产提供有价值的参考，提高养殖效益，增产增效。

附图说明

图1：肝组织油红O染色结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，在奶牛的养殖生产中，围产期奶牛常常出现代谢紊乱性疾病，其中脂肪肝是最常见的一种。据报道，60％以上的奶牛在干奶期向泌乳期过度期间(即围产期)罹患脂肪肝，其中5-10％的奶牛患有重度脂肪肝，严重影响奶牛的产奶性能以及生产寿命及繁殖性能。为了在生产中尽早发现和诊断潜在的脂肪肝患病奶牛，有研究利用血清指标对脂肪肝的发生进行预测。Reid提出了通过血糖、游离脂肪酸和谷草转氨酶在血液中的浓度来预测脂肪肝严重程度的公式，这个公式作为一个脂肪肝的血清学诊断方法具有操作简单方便等优点，但是其准确性相对于肝脏活体采样较差，容易出现偏差；而且测定NEFA指标不仅代价较高，而且NEFA的测定操作不便，步骤繁琐，历时较长。

基于此，本发明建立了利用3个血清生化指标(门冬氨酸氨基转移酶AST、葡萄糖GLU和总胆固醇TCHO)进行脂肪肝奶牛诊断的线性方程C：C＝1.68772-0.00008523AST-0.40724GLU-0.05079TCHO。

根据线性方程计算得到C值，可以判断脂肪肝的发病程度。当C≤0.05时为正常奶牛(fat≤5％)；当0.05<C≤0.20时为轻度脂肪肝奶牛(5％<fat≤20％)；当0.20<C<0.85时为中度脂肪肝奶牛(20％<fat<75％)；当C≥0.85时，为重度脂肪肝奶牛(fat≥75％)。在493头的奶牛群体中验证的结果表明该方程可准确可靠诊断脂肪肝奶牛在牛群的发病程度与比例。可为奶牛的养殖生产提供有价值的参考，提高养殖效益，增产增效。

为方便对奶牛群体大样本数据进行处理，本发明还建立了一种用于判定奶牛脂肪肝发病程度的系统，该系统包括：

数据获取模块：用于获取奶牛血清中生化指标的含量数据，所述生化指标包括：AST、GLU和TCHO；上述含量数据的获取可以通过全自动生化仪进行测定获取。

数据处理模块：用于接收数据获取模块所获取的生化指标的含量数据，并将所获取的生化指标的含量数据代入预设的线性方程进行处理；所述预设的线性方程为：C＝1.68772-0.00008523AST-0.40724GLU-0.05079TCHO。

结果判定模块：用于接收经数据处理模块处理后获得的数值C，并根据数值C对奶牛脂肪肝的发病程度进行判定；当C≤0.05时为正常奶牛；0.05<C≤0.20时为轻度脂肪肝奶牛；0.20<C<0.85时为中度脂肪肝奶牛；当C≥0.85时，为重度脂肪肝奶牛。

采用本发明的系统可以实现批量采集获取奶牛群体中的血清生化指标的含量数据，并对含量数据进行数据处理，对处理结果进行判定，从而获得奶牛群体中脂肪肝的发病程度以及脂肪肝奶牛所占的比例，以便及早进行诊断、预警和治疗。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1.方程C的建立，用于诊断围产期罹患脂肪肝的奶牛

本试验样品采集地点在山东枣庄某规模化奶牛养殖场。

试验对象：挑选2-3胎次的成母牛。

血液采集：在母牛产犊一周后晨饲前于尾根静脉采集20mL血液。共采集了180头奶牛血液。血液经过离心后取上清液血清，将血清置于液氮中保存，直到用于生化检测。血清共检测11个生化指标(表1)，利用Reid提出的方程Y＝-0.51-0.0032NEFA+2.84GLU-0.0528AST对这180头奶牛进行初步分类筛选(正常奶牛和疑似脂肪肝组)。根据计算得到的Y值选取了24头疑似脂肪肝病牛(Y<-2)和疑似正常奶牛(Y>2)。对筛选的奶牛在一周内进行肝脏组织的活体采集。

表1. 180头奶牛的11个血清指标分布情况

肝脏采集：奶牛产后1-2周内完成肝脏的活体采集。手术前一天将挑选的奶牛从大群中挑出。手术时将奶牛赶到修蹄架上绑定，在右侧10-11肋间与肱骨中段到髋骨结节的交叉点上大概5cm x 5cm的范围进行剃毛消毒。消毒后用0.5％的普鲁卡因注射500mg进行局部麻醉(布洛芬和普鲁卡因)，用手术刀切割5-10cm的纵向伤口。使用肝脏活检针进行穿刺采肝。缝合后进行杀菌、消炎处理，加强护理，密切关注牛只情况，必要的时候注射青霉素。将采集后的肝脏组织用生理盐水清洗干净，用手术镊子将肝脏分为大小大致相等的5块，每块黄豆粒大小。其中一块肝组织放入5％的多聚甲醛中固定，用于之后的油红O染色实验。此肝脏采集的方法可保证所有采集的肝组织在肝脏的位置相对保持一致。

肝脏的油红O染色：将5％多聚甲醛的肝脏组织切片贴于载玻片上；用60％的异丙醇清洗载玻片后用油红O染色10-15min；用60％的异丙醇清洗染色后的载玻片，再用去离子水清洗；用苏木素染色细胞核2min；去离子水清洗后显微镜观察(脂类物质显红色，细胞核显蓝色)，可获得每头牛肝组织内油红O脂滴的面积百分比(图1)，用于指示24头围产期奶牛肝内脂肪的相对含量(表2)。百分比的具体计算方法是应用Image-Pro Plus 6.0软件(Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA)选取相同的红色作为判断所有照片脂滴的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片红色脂滴占整个组织面积的比率即脂滴的面积百分比(％)。

表2.肝活检奶牛(24头)的血清指标情况

利用血清指标和脂肪含量建立线性回归方程：用油红O染色后的脂肪含量百分比的正弦值做线性回归的因变量dependent，其它血清指标分别做说明变量explanatory，计算出各血清指标与脂肪含量百分比的正弦值的相关系数R2和相关性P值，结果如表3所示。由表3我们看到与脂肪肝发病程度密切相关的生化指标依次有GLU、TCHO、AST和NEFA等。其中，血清指标GLU和TCHO是与脂肪含量呈显著相关。而AST和NEFA与脂肪含量存在相关性关系，但相关性不高。

各生化指标之间的相关性分析：通过计算各指标之间的相关性发现，AST和NEFA均与GLU存在部分相关。结果如表4所示：可以看出NEFA与AST都与GLU之间存在相关性，但NEFA与AST之间不存在相关性。

方程的拟合：用显著相关的4个指标的组合进行方程的模拟。我们先用相关性最高的GLU做确定使用的指标，之后再逐步加入相关性高的指标。当方程由AST、GLU和TCHO 3个指标模拟建立时，方程是极显著的，且方程的R2达到了0.65(表5)。在AST、GLU、和TCHO的基础上再加入NEFA方程也是极显著的，P值只增加了一点，但方程的R²也只增加了0.007(表5)。考虑到如下2个方面的原因，我们最终决定使用由AST、GLU和TCHO 3个指标模拟建立的方程用于生产实践：(1)生产中多测定1个NEFA指标不仅代价较高，而且NEFA的测定操作不便，步骤繁琐，而且历时较长；(2)由表4可知，NEFA与GLU的相关性是极显著的，而GLU与肝内脂肪的含量相关性较高。所以弃用NEFA。这也是为什么在3个指标的基础上加入NEFA得到的方程R²值增加范围非常小的原因。

表3.血清指标与脂肪含量的相关性

表4.各血清指标之间的相关性

表5.生化指标逐渐加入拟合的线性方程比较

最终我们建立方程：C＝1.68772-0.00008523AST-0.40724GLU-0.05079TCHO。根据线性方程计算得到C值，可以判断脂肪肝的发病程度。当C≤0.05时为正常奶牛(fat≤5％)；当0.05<C≤0.20时为轻度脂肪肝奶牛(5％<fat≤20％)；当0.20<C<0.85时为中度脂肪肝奶牛(20％<fat<75％)；当C≥0.85时，为重度脂肪肝奶牛(fat≥75％)。

该线性方程的优点：方程建立前期的试验步骤、试验方法和测定方法先进且严谨准确(如肝脏采集部位均为一致；肝脏脂肪含量和血清指标测定技术更加完善，检测的结果也更加精确)。而且，方程的拟合思路明确且科学合理。

实施例2.方程C的大群验证

本试验样品采集地点在山东东营某规模化奶牛养殖场。

试验对象：随机采样。采集对象是2-3胎次的围产期成母牛，在1个月(当年9月份)内完成样品采集和指标测定。

血液采集：在母牛产犊一周后晨饲前于尾根静脉采集20mL血液。共采集了180头奶牛血液。血液经过离心后取上清液血清，将血清置于液氮中保存，直到用于11个生化指标的测定。测定方法同实施例1(测定结果略)。

验证结果：利用方程C可以将423头奶牛构成的群体根据脂肪肝的发病程度进行分级和比例分析，结果显示(表6)：423头中有重度脂肪肝牛26头，占5％；正常或轻度的奶牛占34％，中度的占61％。抽样进行肝活检验证的结果与根据C值判断的结果完全吻合。

表6.方程C在423头奶牛群中验证结果

实施例3.方程C和方程Y的诊断准确性比较

比较1：方程Y的诊断结果与肝活检的诊断结果不一致，吻合度差(表7)。

经21头牛经肝活检后诊断结果显示：6头为正常奶牛(fat％<20％)，其余的15头为中度或重度脂肪肝奶牛(fat％>30％)。但是，根据Y值判断有6头的诊断结果与肝活检结果不一致。表现在：(1)由表7可以看出在脂肪含量低于20％的正常奶牛中14116和15155这两头牛，其Y值分别是-2.59和-2.13。根据方程Y的判断标准，14116和15155这两头牛应该是中度或重度脂肪肝奶牛，这不符合肝活检检测的结果。(2)肝活检证明患中度或重度的脂肪肝奶牛(脂肪含量超过20％的脂肪肝奶牛)中存在Y值是正值的情况。根据方程Y的判断标准，Y>0为正常奶牛。例如5833、12164两头牛肝内脂肪含量高达60.13％和76.79％，但根据Y值判断的结果为正常奶牛。

表7.牛肝活测定肝内脂肪含量(21头)判断的患病诊断结果与方程Y的判断结果对比

*根据该值(Y值)判断的结果与肝活检诊断的结果不符。

比较2：本试验测定的生化指标与方程Y中的Y值之间相关性不高。

根据本试验测定的血清指标和方程Y计算得到Y值，计算之间的相关性，结果如表8所示。可见，只有AST这一个指标与Y值呈现显著相关。其他指标都与Y值相关性差。由此间接说明方程Y片面性。方程Y在判断奶牛是否患有脂肪肝上可能会出现误差。

表8.血清指标与方程Y中Y值的相关性

比较3：使用方程Y和方程C对产后初期奶牛群中脂肪肝患病情况分析对比。

理论上，若方程C和方程Y的判断结果一致，表明二者对于脂肪肝的诊断准确度相当。利用实施例2的大群(423头牛)方程对Y的准确性进行评价，方程C可将群体分成3类(重度脂肪肝牛26头，占5％；正常或轻度的奶牛占34％，中度的奶牛占61％)。而方程Y的分群情况如表9所示，结果可分成2大类：一类为正常或轻度脂肪肝牛，占77％，另一类是中度和重度脂肪肝牛，占23％。这与实际肝活检验证的所获得的分布比例不符。显然，方程C的分布比例更符合奶牛生产实践中脂肪肝的发病情况，比方程Y更为准确。

表9.经方程Y判断423头牛群的脂肪肝患病情况

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。