具体实施方式

本发明涉及有关非酒精性脂肪性肝病的组织学严重程度诊断或预后测量的信息提供方法，其包括测量步骤，测量从标本分离的生物学试样中的鞘磷脂的含量。

本发明的实施方式

以下，通过下述实施例更详细地说明本发明。但这些实施例仅用于例示本发明，并且本发明的范围不限于这些实施例。

【实施例1：研究参与者的基本特性】

如表1及表2所示，根据身体质量指数将受试者分为非肥胖(＜25)和肥胖(≥25)((DM(diabetes mellitus，糖尿病)、MS(metabolic syndrome，代谢综合征)、hsCRP(highsensitivity C-reactive protein，高敏感性C-反应蛋白)、FPG(fasting plasmaglucose，空腹血糖)、TC(total cholesterol，总胆固醇)、HDL-C(high densitylipoprotein cholesterol，高密度脂蛋白胆固醇))。

表1

表2

从表1及表2中可以确认，在非肥胖组和肥胖组中，血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶及γ-谷氨酰转肽酶的含量都根据非酒精性脂肪性肝病的组织学严重程度而逐步增加。

活检结果，在总共361名(平均年龄53±14岁，男性占48.5％)中，295名为非酒精性脂肪性肝病，66名为代谢健康的对照组(非-非酒精性脂肪性肝病组)。非-非酒精性脂肪性肝病组没有脂肪肝的临床、生化学、放射线学或组织学证据。在非肥胖患者中，82名为非酒精性脂肪性肝病，48名为对照组。在肥胖组中，213名为非酒精性脂肪性肝病，18名为对照组。

根据身体质量指数和肝组织学建议(非-非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪肝以及非酒精性非脂肪性肝炎)，将研究对象分为以下六个组：非肥胖/非-非酒精性脂肪性肝病；非肥胖/非酒精性脂肪肝；非肥胖/非酒精性非脂肪性肝炎；肥胖/非-非酒精性脂肪性肝病；肥胖/非酒精性脂肪肝以及肥胖/非酒精性非脂肪性肝炎。非酒精性脂肪性肝病的组织学严重程度越增加，在非肥胖组及肥胖组中，身体质量指数、腰围、内脏脂肪面积(内脏脂肪量)、脂肪组织胰岛素抵抗指数、胰岛素抵抗指数、糖化血红素、空腹血糖、甘油三酯(中性脂肪)、高密度脂蛋白胆固醇、糖尿病发病率及代谢综合征的频度越增加(表1)。

【实施例2：基于超高效液相色谱与串联四极杆飞行时间质谱仪联用技术(UPLC/QTOF-MS)的血清脂质谱】

将通过活检确诊为非酒精性脂肪性肝病并且身体质量指数小于25kg/m²的受试者(Boramae医院的非酒精性脂肪性肝病人群(NCT 02206841))定义为非肥胖非酒精性脂肪性肝病受试者。对根据腹部影像学，通过评价活体供体肝移植过程中的肝脏活检怀疑为肝腺瘤或局灶性结节性增生的实性肝肿块进行特性分析，从而确定对照组没有非酒精性脂肪性肝病。

非酒精性脂肪性肝病以通过组织学检查确认存在5％以上的大泡性脂肪变性来定义。非酒精性脂肪性肝炎以非酒精性脂肪性肝炎临床研究网络(NASH-CRN(clinicalresearch network))的组织学基准为基础进行诊断。将由脂肪变性、小叶炎症、气球样变或纤维化组成的组织学肝损伤的整体模式根据非酒精性脂肪性肝病活性评分系统来指定等级。

为了内脏脂肪量的定量，测量内脏脂肪组织面积(visceral adipose tissuearea；VAT)。利用稳态模型(HOMA-B)来评价全身胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)，并且计算脂肪组织胰岛素抵抗指数(adipo-IR)。代谢综合征根据国际胆固醇教育计划成人治疗组第3次报告(NCEP-ATP III)的标准来定义。

使用超高效液相色谱与串联四极杆飞行时间质谱仪联用技术对361名研究对象的血清进行了全球脂质图谱，并使用多种标准物质和诸如人类代谢组数据库(HMDB，HumanMetabolome Database，www.hmdb.ca)、METLIN(metlin.scripps.edu))以及脂质代谢物和代谢途径研究策略(LIPID MAPS(www.lipidmaps.org))之类的线上数据库对224种脂质代谢产物进行确认。

用于超高效液相色谱与串联四极杆飞行时间质谱仪联用技术(UPLC-MS，ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight massspectrometry)分析的高效液相色谱(HPLC，High-performance liquid chromatography)的-鞘磷脂-等级溶剂是从赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马塞诸塞州，美国)购入的。乙酸铵及脂质标准物质是从Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密苏里州，美国)购入的。

所有脂质等级的脂质学图谱中包括：游离脂肪酸(free fatty acids，FFA)、甘油脂质(甘油二酯以及甘油三酯)、磷脂(溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid；LPA)、溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine；LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine；LPE)、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine；PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine；PE)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol；PI))以及鞘脂(神经酰胺(ceramide；Cer)以及鞘磷脂)。有关非肥胖及肥胖患者的非酒精性脂肪肝/非-非酒精性脂肪性肝病以及非酒精性脂肪性肝炎/非酒精性脂肪肝的脂质种类的倍数变化(fold changes)如图1所示。

从图1中可以确认，在非肥胖及肥胖成年非酒精性脂肪性肝病患者中，根据非酒精性脂肪性肝病的组织学严重程度，诸如甘油二酯、甘油三酯、鞘磷脂之类的若干脂质种类表现出了特征性的变化图形。

尤其，虽然相比于非肥胖组，在肥胖组中，非酒精性脂肪肝与正常肝(非-非酒精性脂肪性肝病)的血中甘油脂质的含量(浓度)比显著增高，但非酒精性脂肪性肝炎与非酒精性脂肪肝的血中甘油脂质的含量比却没有显著差异。相反，在一部分特定饱和鞘磷脂的情况下，非酒精性脂肪肝与正常肝(非-非酒精性脂肪性肝病)的血中鞘磷脂的含量比和非酒精性脂肪性肝炎与非酒精性脂肪肝的鞘磷脂含量比只在非肥胖组中显著增高，而在肥胖组中未表现出统计学上的差异。

由此可以确认，虽然在肥胖组中，血液中甘油脂质在非酒精性脂肪肝的发生中起到了重要作用，但在发展为非酒精性脂肪性肝炎方面没有起到太大的作用，或者，反而在甘油三酯的情况下，起到预防性保护作用。

相反，在非肥胖组中，饱和鞘磷脂不仅在非酒精性脂肪肝的发生中起到很大作用，还在发展为非酒精性脂肪性肝炎方面起到了非常大的作用，但在肥胖组中没能确认到这种现象。

【实施例3：基于非酒精性脂肪性肝病严重程度的甘油二酯及甘油三酯的变化】

将50μL的每种血清样本与500μL的三氯甲烷/甲醇(2∶1，v/v)进行混合。在4℃的温度下，以13000rpm的转速离心分离20分钟后，收集300μL更低的脂质相，在室温下，在温和的氮气流下去除溶剂。使用250μL的异丙醇/乙腈/水的混合物(2∶1∶1，v/v/v)对干燥提取物进行重构。之后，在4℃的温度下，以13000rpm的转速离心分离10分钟后，为了脂质分析，使用与四级杆飞行时间高分辨质谱仪(QTOF-MS，quadrupole time-of-flight massspectrometry)结合的高效液相色谱(ACQUITY^TMUPLC系统，Waters公司，曼彻斯特，英国)将上层液移到小瓶后，可利用四级杆飞行时间高分辨质谱仪进行测量。

柱温箱和自动采样器的温度分别保持为40℃和4℃。使用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1μm×1.7mm粒子，Waters公司)洗脱及分离样品。液相色谱(LC)流动相通过在乙腈/水混合物(4∶6，v/v)中加入10mM乙酸铵的溶剂(溶剂A)及在乙腈/异丙醇混合物(1∶9，v/v)中加入10mM的乙酸铵的溶剂(溶剂B)来组成。梯度洗脱从40％的B开始，5分钟后增加至65％的B，之后继续增加直到10分钟后B成分达到99％。

将组合物在99％的B中保持2分钟。17分钟后恢复到初始状态并保持3分钟直至成为平衡状态。流速设定为350μL/min。将5微升的脂质提取物注入高效液相色谱/四级杆飞行时间高分辨质谱仪系统中。

以相同的量收集所有的样品来生成质控(QC)样品。为了评价分析再现性，溶剂空白及质控样品的注入在12个样品之间进行。使用安装有混合四极杆飞行时间串联质谱(QTOF)设备和DuoSpray离子源的Triple TOF 5600(AB Sciex公司，Concord，加拿大)将所有阳离子和阴离子适用于每个样品。质量范围设定为m/z50-1500。

使用以下参数进行操作：离子喷雾电压为5500V，离子源温度为500℃，喷雾器压力为50psi，干燥气体压力为60psi，气帘气为30psi，去簇电压为90V，而且，为了获得有关离子的MS/MS光谱，使用了信息依赖性采集(Information-dependent acquisition；IDA)。

为了获得MS/MS光谱，分别将碰撞能量和碰撞能量扩散调整为40V和15V。质量正确度由DuoSpray离子源和界面化的自动校准传递系统(AB Sciex公司)来维持。脂质代谢产物根据线上数据库(DB、HMDB、METLIN、LIPID MAPS)以及能够与标准化合物的数据一致的可使用的信息(正确的质量、碎片离子和/或滞留时间)来确认。

在非肥胖及肥胖组中都观察到包括甘油二酯及甘油三酯种类的甘油脂质的显著增加，从非酒精性脂肪肝到非酒精性非脂肪性肝炎逐步增加。使用气泡图对酰基链长度、不饱和程度、倍数变化及具有p值的甘油二酯及甘油三酯含量的差异进行可视化。

气泡图通过比较组织学的子类组来显示酰基链长度、不饱和程度、倍数变化及甘油二酯及甘油三酯的p值之间的关系。y轴表示不饱和程度，与x轴相关的气泡的位置相当于酰基链的长度。气泡的颜色表示倍数变化，而气泡的大小表示使用邦费罗尼(Bonferroni)校正在曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U-test)中得到的p值。

从图2a中可以确认，甘油二酯含量的变化表现出多种组织学子类组之间的特异图形。与肥胖无关地，具有相对短的链及低的不饱和度的甘油二酯的含量在非酒精性脂肪肝/非酒精性脂肪性肝病中在统计学上增加。作为对照，在肥胖组的非酒精性脂肪性肝炎/非酒精性脂肪肝中，具有长链及高度饱和程度的甘油二酯含量显著减少。

从图2b中可以确认，甘油三酯含量的变化表现出与甘油二酯含量的变化相似的倾向。虽然统计学显著性及倍数变化减弱，但链长度和饱和程度略有些变化。

包含甘油二酯及甘油三酯种类的甘油脂质表现出受到酰基链的长度及不饱和度的影响的特有的变化图形。并且，基于组织学严重程度的甘油脂质的变化图形在非肥胖组和肥胖组中没有差异。最终，比起非肥胖非酒精性脂肪性肝病患者，在肥胖非酒精性脂肪性肝病患者中，根据组织学严重程度分类的循环甘油二酯及甘油三酯的倍率变化更大。

尤其，虽然相比于非肥胖组，在肥胖组中，非酒精性脂肪肝与正常肝(非-非酒精性脂肪性肝病)的血中甘油脂质的含量(浓度)比显著增高，但非酒精性脂肪性肝炎与非酒精性脂肪肝的血中甘油脂质的含量比却没有显著差异。

由此可以确认，虽然在非肥胖组中甘油脂质在非酒精性脂肪肝的发生中起到了重要作用，但在发展为非酒精性脂肪性肝炎方面没有起到太大的作用，或者，反而在作为生物学非活性物质的甘油三酯的情况下，其为起到预防性保护作用的无害脂质。

【实施例4：根据非酒精性脂肪性肝病的严重程度引起的代谢综合征的变化与肝组织和肝组织学的关联性】

在非肥胖组和肥胖组中，都表现出了根据非酒精性脂肪性肝病的组织学严重程度引起的代谢综合征的强度差异。在柱状图中显著差异点以*号(*表示适用邦费罗尼(Bonproni)校正的曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U-test)，*p＜0.05、**p＜0.01以及***p＜0.001)表示。

从图3中可以确认，有趣的是，在非肥胖组的非酒精性脂肪肝/非-非酒精性脂肪性肝病组中，包括SM d36:0、SM d38:0以及SM d40:0的饱和状态的鞘磷脂的含量显著增加至1.3倍以上。作为对照，与肥胖无关地，在非酒精性脂肪肝/非-非酒精性脂肪性肝病组中，含有42个碳原子以上的长链的鞘磷脂的含量减少。

在肥胖组中，虽然在非酒精性脂肪性肝炎/非酒精性脂肪肝组中，诸如SM d34:0、SM d36:0、SM d38:0以及SM d40:0之类的饱和鞘磷脂的含量显著增加，但在非酒精性脂肪肝/非-非酒精性脂肪性肝病组中却没有显著增加。

与非酒精性脂肪性肝病的严重程度及肥胖相关的饱和状态的鞘磷脂含量的差异，在代谢危险因子与肝组织学之间的相关关系中也得到了确认。斯皮尔曼相关关系热图表现出非肥胖及肥胖组的代谢综合征危险因子或肝组织学与鞘磷脂之间的相关关系。统计学显著性通过*号(*p＜0.05、**p＜0.01以及***p＜0.001)表示(VAT表示内脏脂肪组织(visceral adipose tissue)；HbA1c表示糖化血红蛋白；脂肪组织-红外线表示脂肪组织的胰岛素耐性；HOMA-IR表示胰岛素抵抗性的恒常性模型评价；HOMA-β表示胰岛β细胞功能的恒常性模型评价；LI表示小叶炎症)。

从图4中可以确认，在非肥胖组中，SM d36:0、SM d38:0以及SM d40:0的含量表现出与内脏脂肪组织区域、脂肪组织胰岛素抵抗指数及胰岛素抵抗指数之间的显著的量的相关关系，在肥胖组中，表现出与脂肪组织胰岛素抵抗指数及胰岛素抵抗指数之间的量的相关关系。尤其在非肥胖组中，饱和状态鞘磷脂的含量表现出与脂肪变性、气球样变及小叶炎症的严重程度之间的很强的相关关系。但在肥胖组中，只有脂肪变性表现出与饱和脂肪浓度之间的量的相关关系。

然后，确认包括SM d36:0、SM d38:0以及SM d40:0在内的饱和鞘磷脂种类的含量是否变更为脂肪变性、小叶炎症及气球样变的存在及严重程度。在脂肪变性(A；0-3)、小叶炎症(B；0-3)、气球样变(C；0-2)以及非肥胖受试者中，SM d36:0、SM d38:0以及SM d40:0的强度没有纤维化(D；0-4)。数据以平均值±标准偏差来表示。显著差异以*号(J-T检验(Jonckheere-Terpstra test)，*p＜0.05、**p＜0.01以及***p＜0.001)来表示。

从图5中可以确认，与热图所示相同，根据各个等级的脂肪变性、小叶炎症、气球样变及纤维化的严重程度，尤其在非肥胖患者中饱和状态鞘磷脂的含量显著增加。相反，除测量脂肪变性等级的情况外，肥胖患者的饱和状态鞘磷脂的含量未与非酒精性脂肪性肝病的组织学严重程度的测量相关地逐步增加。与肥胖无关地，纤维化阶段也同样与饱和鞘磷脂含量无逐步关联性。

相比于肥胖患者的非酒精性脂肪肝及非酒精性脂肪性肝炎，饱和鞘磷脂的含量在提高非肥胖患者的非酒精性脂肪肝及非酒精性脂肪性肝炎的诊断性能中更有用，可以预防非肥胖成年非酒精性脂肪性肝病患者不必要的检查，尤其是肝活检。

【实施例5：利用循环饱和鞘磷脂含量的非肥胖非酒精性脂肪性肝病的预测】

为了通过评价上述饱和鞘磷脂的含量(SM d36:0、SM d38:0以及SM d40:0)的组合的诊断性能来预测非酒精性脂肪性肝病的组织学严重程度，将具有95％置信区间(95％CI)的接收者操作特征曲线下面积(AUROC)分为非肥胖组和肥胖组并示于表3及图6中。

表3

从图6a中可以确认，在非肥胖组中，脂肪变性1、脂肪变性2及脂肪变性3(S1-S3)的接收者操作特征曲线下面积分别为0.720、0.768以及0.804。在肥胖组中，S1、S2及S3的接收者操作特征曲线下面积分别为0.722、0.656以及0.733。

从图6b中可以确认，在小叶炎症的情况下，在非肥胖组中，小叶炎症的接收者操作特征曲线下面积为0.613(分数1)及0.821(分数2)，在肥胖组中，接收者操作特征曲线下面积为0.541及0.614。

从图6c中可以确认，在气球样变的情况下，在非肥胖组中，小叶炎症的接收者操作特征曲线下面积为0.709(分数1)及0.784(分数2)。在肥胖组中，分数1和分数2的接收者操作特征曲线下面积分别为0.567及0.551。

整体上，基于非肥胖组的组织学严重程度的接收者操作特征曲线表现出显著高于肥胖组的接收者操作特征曲线下面积。

从图7中可以确认，为了在没有非酒精性脂肪性肝病的患者中有效地区别患有非酒精性脂肪性肝炎或非酒精性脂肪肝的对象，将接收者操作特征曲线下面积调整为谷草转氨酶、谷丙转氨酶及γ-谷氨酰转肽酶的含量(模型1)或饱和鞘磷脂(SM d36:0、SM d38:0以及SM d40:0)与谷草转氨酶、谷丙转氨酶及γ-谷氨酰转肽酶的含量(模型2)的组合。使用DeLong测试来提供用于接收者操作特征曲线下面积的配对(pairwise)比较的p值。

表4

从表4中可以确认，在非肥胖组中，比较非酒精性脂肪性肝病与非酒精性脂肪肝的模型1及模型2的接收者操作特征曲线下面积为0.720及0.833(比较接收者操作特征曲线下面积时，p＝0.011)。在将血清饱和鞘磷脂追加到血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶及γ-谷氨酰转肽酶的组合时，在非肥胖组中区别非酒精性脂肪肝与非酒精性脂肪性肝炎的诊断性能得到了显著提高。

比较非酒精性脂肪性肝病与非酒精性脂肪性肝炎的模型1及模型2的接收者操作特征曲线下面积为0.823及0.914(比较接收者操作特征曲线下面积时，p＝0.033)。在肥胖组中，比较非酒精性脂肪性肝病与非酒精性脂肪肝的模型1及模型2的接收者操作特征曲线下面积为0.785及0.781(比较接收者操作特征曲线下面积时，p＝0.866)。比较非酒精性脂肪性肝病与非酒精性脂肪性肝炎的模型1及模型2的接收者操作特征曲线下面积为0.928及0.960(比较接收者操作特征曲线下面积时，p＝0.059)

【产业上的可利用性】

本发明涉及有关非酒精性脂肪性肝病的组织学严重程度诊断或预后测量的信息提供方法，更详细地，涉及如下方法：通过测量饱和鞘磷脂的含量来确认与非酒精性脂肪性肝病的严重程度相关的危险度是否增加。