具体实施方式

在本申请中，对来自酒精性肝炎(AH)患者的血浆样品研究如通过NMR光谱所确定的LP-Z之间的关系，并跟踪AH患者的死亡率。本文描述了使用NMR光谱法基于生物样品中LP-Z的量准确地预测AH患者的死亡率的新方法。本发明可以多种方式体现。

在一些实施方案中，方法和系统包括确定受试者或患者中的LP-Z。在一些实施方案中，方法可预测患者对疗法的反应或患者在90天内的死亡可能性。

在一些实施方案中，预测患有AH的受试者的死亡率的方法包括以下步骤：获取自受试者获得的血浆或血清样品的NMR光谱，和基于样品的NMR光谱程序化地确定样品中LP-Z和含apoB脂蛋白的存在，其中样品的NMR光谱包括LP-X和LP-Z。在一些实施方案中，样品的NMR光谱还包括LP-Y。在某些实施方案中，方法还包括计算Z指数得分。在一些情况下，大于0.6的Z指数可与90天或更短时间内的AH死亡率相关。

脂蛋白Z (LP-Z)是低密度脂蛋白(LDL)样颗粒。作为LDL，LP-Z携带一个拷贝的载脂蛋白B (apoB)，其表面上具有两亲性脂质，且在颗粒核中具有疏水性脂质。本文中称为LP-Z的种类先前已被描述为“高度富含甘油三酯的LDL”(Kostner GM等，Biochem J. 1976;157: 401-407)。脂蛋白X (LP-X)是富含磷脂和未酯化胆固醇的异常多层囊泡颗粒，其可通过核磁共振(NMR)光谱法定量。常规的脂质组(lipid panel)可能检测不到LP-X或LP-Z的存在。

术语和定义

相同的数字始终指相同的元件。在附图中，为了清楚起见，可能夸大了某些线、层、组件、元件或特征的厚度。除非另外指明，否则虚线示出可选的特征或操作。

本文使用的术语仅用于描述特定实施方案目的，并非旨在限制本发明。如本文所用，除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”也旨在包括复数形式。还应该理解，当在本说明书中使用时，术语“包含”和/或“包括”指明存在所陈述的特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或其组的存在或增加。如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关所列项目的任何和所有组合。如本文所用，短语如“在X和Y之间”和“在约X和Y之间”应解释为包括X和Y。如本文所用，短语如“在约X和Y之间”是指“在约X和约V之间”，如本文所用，短语如“约X至Y”是指“约X至约Y”。

除非另有定义，否则本文使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。应进一步理解，术语，如常用字典中定义的那些，应当被解释为具有与它们在本说明书和相关领域的背景下的含义一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的含义进行解释，除非本文中明确如此定义。为了简洁和/或清楚，可能没有详细描述众所周知的功能或结构。

术语“程序化地”意指使用计算机程序和/或软件、处理器或ASIC引导的操作来执行。术语“电子”及其派生词是指使用具有电路和/或模块的装置而不是经由思维步骤来进行的自动或半自动操作，并且通常是指以程序化方式进行的操作。术语“自动化”和“自动化的”意指操作可在最少或没有手工劳动或输入的情况下进行。术语“半自动化”是指允许操作者进行一些输入或激活，但是计算和信号获取以及一种或多种离子化成分浓度的计算经电子学方法(通常是程序化地)完成，而不需要手动输入。术语“约”是指+/-10%(均值或平均值)的特定值或数字。

术语“生物样品”是指人或动物的体外血液、血浆、血清、CSF、唾液、灌洗液、痰、尿或组织样品。本发明的实施方案可特别适合评价人血浆或血清生物样品。血浆或血清样品可为禁食的或非禁食的。

术语“患者”或“受试者”被广泛使用，并且是指提供用于测试或分析的生物样品的个体。

术语“临床疾病状态”意指处于危险中的医学状况，其可指示医学干预、疗法、疗法调整或排除某种疗法(例如，药物)和/或监测是适当的。临床疾病状态的可能性的鉴定可允许临床医生相应地治疗病况、延迟或抑制病况的发作。临床疾病状态的实例包括但不限于CHD、CVD、中风、2型糖尿病、前驱糖尿病、痴呆、阿尔茨海默氏病、癌症、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、肾病、肝病、肺病、COPD (慢性阻塞性肺病)、外周血管病、充血性心力衰竭、器官移植反应和/或与免疫缺陷、蛋白质分选、免疫和受体识别、炎症、致病性、转移和其他细胞过程中的生物学功能异常相关的医学病况。

测量LP-Z以确定Z指数的方法

本文描述了利用NMR表征生物样品中的LP-Z以诊断或检测受试者中的AH的新方法(即，测定)。在一些实施方案中，所述方法可预测AH患者中的死亡率。所述方法可以多种方式体现。

NMR光谱法已经用于同时测量循环脂蛋白的全谱，所述脂蛋白包括来自体外血浆或血清样品的极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)颗粒亚类，以及异常脂蛋白颗粒如LP-X和LP-Z。参见，美国专利号4,933,844、美国专利号6,617,167、2018年11月13日提交的美国专利申请号16/188,435，其内容通过引用并入本文，如同全部在本文记载一样。在一些实施方案中，样品可为血液、血清、血浆、脑脊液或尿液。

一般而言，为了评价血浆和/或血清样品中的脂蛋白，通过复合甲基信号包络(envelope)的去卷积以产生亚类浓度来导出NMR光谱的化学位移区域内的多个NMR光谱导出信号的振幅。图1显示具有突出显示的脂质甲基的人血清的示例性NMR光谱。亚类由许多(通常超过60个)与NMR频率和脂蛋白直径关联的离散贡献亚类信号表示。NMR评价可分解测量的血浆NMR信号，以产生VLDL、LDL和HDL的不同脂蛋白亚群的浓度。例如，这些亚群可进一步表征为与如图2中所示的VLDL、LDL或HDL亚类内的特定大小范围关联。如图2中所示，将亚类信号组合以产生测量的信号。通过去卷积导出的亚类信号振幅可提供每个亚类的浓度。

过去，可从LapCorp, Burlington, N.C.得到的“高级”脂蛋白测试组(如NMRLIPOPROFILE®脂蛋白测试)通常包括将所有HDL亚类的浓度相加的总HDL颗粒(HDL-P)测量和将所有LDL亚类的浓度相加的总LDL颗粒(LDL-P)测量。LDL-P数表示以nmol/L等浓度单位表示的那些相应颗粒的浓度。HDL-P数表示以μmol/L等浓度单位表示的那些相应颗粒的浓度。

最近，使用精修的去卷积模型的NMR分析已经用于确定生物样品中LP-X和LP-Z的浓度。图3显示当使用包括LP-X、LP-Y和LP-Z的参考信号的LP-X去卷积模型时，由来自具有高胆红素的患者的血浆的分析产生的良好拟合和小残余信号的实例。

NMR光谱法可用于鉴定和定量LP-Z在其中积累的患者(如患有酒精性肝炎(AH)的患者)中的LP-Z。如图4中所示，最近利用由LabCorp开发的基于NMR的方法对来自AH患者的血浆样品的测试以定量生物样品中循环脂蛋白的分布，表明示例性AH患者携带明显高水平的异常脂蛋白LP-Z。特定地，与健康个体(HC)或患有其他形式的慢性肝病的患者相比，LP-Z的水平在AH患者中可明显更高。为了将NMR可靠地用于AH患者预后，必须理解通过NMR确定的LP-Z与患者死亡率的关系。

上述AH测试进一步确定，在AH患者中，LP-Z和总的含apoB脂蛋白两者的水平与肝合成功能逆相关，如通过INR所测量。尽管LP-Z和总的含apoB脂蛋白的水平可能与患有AH的患者的死亡率都没有稳健的关联，但是这两个参数可相互地预测死亡率。LP-Z和总的含apoB脂蛋白(VLDL、LDL和LP-Z)可用于同时预测死亡率。LP-Z可与死亡率正相关，而总的含apoB脂蛋白可与死亡率负相关。本文所述的新型生物标记Z指数利用这些与患者死亡率的关联。Z指数可通过以下等式计算：

其中脂蛋白组分的浓度单位是nmol/L。

Z指数可代表含apoB脂蛋白中异常脂蛋白LP-Z的比例，且可反映导致AH中循环脂蛋白紊乱的肝损伤程度。Z指数可高度预测90天内的短期死亡率。如图5的示例性KaplanMeier曲线所示，Z指数可与90-天死亡率稳健地相关联。对于Z指数每增加1%，死亡危险率增加5% (95% CI 1.02-1.08，p = 0.001)。Z指数的阈值确定为0.6。在Z指数小于0.6时，在LP-Z鉴定的90天内仅约5%的患者可能死亡(在图5中所示的数据中38名测试受试者中有2名)。相反，当Z指数大于0.6时，可预计将近40%的患者在LP-Z鉴定的90天内死亡(在图5中所示的数据中，53名测试受试者中有21名在90天内死亡)。

Z指数可为比MELD得分更可靠的预测因子，MELD得分是预测肝衰竭患者结果的当前标准。如表1中所示，在AH患者中预测90天死亡率时，Z指数可明显优于MELD评分。

表1. 多变量Cox比例风险回归

Z指数也可为比预测AH结果的其他分量更可靠的预测因子，如表2中所示的。

表2. 用于各种策略的置信度比较

Z指数可使用通过NMR测量的LP-Z和总的含apoB脂蛋白的浓度来计算，并且可用于有效地对患有严重AH的患者进行风险分级。有效的风险分级可特别有用地帮助区分在90天内处于低死亡风险的患者与处于高死亡风险的患者。如图6中所示，例如，Z指数可用作重复测量以预测结果。存活的人中的Z指数到第14天下降，而死亡的人的Z指数保持稳定。

尽管本文的公开内容公开了通过NMR光谱法的LP-Z和含apoB脂蛋白，但是本领域的技术人员理解Z指数不是NMR光谱法特有的。例如，LP-Z的浓度可使用琼脂糖凝胶电泳联合使用苏丹黑和Filipin的脂质染色来估计。ApoB的浓度可通过ELISA测量。图7显示AH中示例性脂蛋白分布与示例性健康受试者(HC)相比在苏丹黑和Filipin测试两者中是独特的。

图8显示脂蛋白结构以及磷脂(PL)、胆固醇酯(CE)和甘油三酯(TG)以及游离胆固醇(FC)的化学结构。图9显示健康受试者的脂蛋白代谢中脂质的途径。大多数个体(即“正常”健康受试者)具有非常低的LP-X或LP-Z水平或没有LP-X或LP-Z。相反，在健康个体和患病个体两者中都发现了可变量的LP-Y。在展示存在LP-X或LP-Z的受试者(例如患有阻塞性黄疸或AH的受试者)中，LP-Z水平可升高到不同程度。

来自LP-X、LP-Y和LP-Z的甲基脂质信号各自在NMR光谱中具有独特的谱形状和位置，而不同于那些“正常”脂蛋白颗粒。AH中可存在独特的循环脂蛋白模式，其特征在于异常脂蛋白LP-X和LP-Z的积累。图10显示AH患者中的示例性独特脂蛋白分布。如通过NMR分析所确定，升高的LP-X和LP-Z浓度可区分健康患者和患有肝病的患者。这些脂蛋白可为风险分级严重酒精性肝炎的有效生物标记。本文所述的测定利用这些独特的光谱线形来检测和定量血清或血浆样品中的LP-X、LP-Y和LP-Z。

在一些实施方案中，所述方法还包括产生列出样品中存在的脂蛋白成分的浓度和死亡可能性的报告的步骤。在一些实施方案中，诊断受试者是否存在LP-Z的方法包括以下步骤：获取从受试者获得的血浆或血清样品的NMR光谱和基于样品的NMR光谱程序化地确定样品中LP-Z的存在，其中样品的NMR光谱包括LP-X、LP-Y和LP-Z。在一些实施方案中，所述方法的获取步骤包括(a)对于从受试者获得的血浆或血清样品的NMR光谱产生测量的脂质信号线形；和(b)生成样品的计算线形，所述计算线形基于样品中可能存在的脂蛋白组分的导出浓度，其中脂蛋白组分包括LP-X、LP-Y和LP-Z，每种脂蛋白组分的导出浓度是所述组分的参考谱和计算的参考系数的函数，其中计算浓度的三种脂蛋白组分为LP-X、LP-Y和LP-Z。

在一些实施方案中，所述方法还包括(c)确定样品的初始计算线形与样品的测量线形之间的相关度；以及(d)如果样品的计算线形与测量线形之间的相关度高于预定阈值，则基于计算线形确定LP-Z的存在。在一些实施方案中，所述方法的步骤(b)包括基于线性最小二乘拟合技术计算所述计算线形的参考系数。在一些实施方案中，样品可为血液、血清、血浆、脑脊液或尿液。

现在参考图11，预期大部分(即使不是全部)测量可在系统10上或使用系统10进行，所述系统10与如例如美国专利号8,013,602中描述的NMR临床分析仪22通信或至少部分地装载在其上，所述专利的内容以引用的方式并入本文，如同全部在本文记载一样。

系统10可包括Z指数风险模块370，以收集适于确定Z指数的数据。系统10可包括分析电路20，所述分析电路20包括可装载在分析仪22上或至少部分地远离分析仪22的至少一个处理器20p。如果是后者，则模块370和/或电路20可全部或部分地位于服务器150上。可使用云计算来提供服务器150，所述云计算包括经由计算机网络按需提供计算资源。所述资源可体现为各种基础设施服务(例如计算机、存储等)以及应用程序、数据库、文件服务、电子邮件等。在传统的计算模型中，数据和软件两者通常完全包含在用户的计算机中；在云计算中，用户的计算机可包含很少的软件或数据(可能是操作系统和/或网络浏览器)，并且可能仅作为外部计算机网络上发生的进程的显示终端。云计算服务(或多个云资源的聚合)通常可被称为“云”。云存储可包括联网计算机数据存储的模型，其中数据被存储在多个虚拟服务器上，而不是被托管在一个或多个专用服务器上。数据传输可被加密，并且可使用任何适当的防火墙经由因特网来完成，以符合行业或监管标准(如HIPAA)。术语“HIPAA”是指由健康保险携带和责任法案(Health Insurance Portability and Accountability Act)定义的美国法律。患者数据可包括登录号或标识符、性别、年龄和测试数据。

分析结果可经由计算机网络(如因特网)、经由电子邮件等发送到患者、临床医生站点50、健康保险代理处52或药房51。结果可直接从分析站点发送或可间接发送。结果可打印出来并通过常规邮件发送。这个信息也可发送给药房和/或医疗保险公司，或者甚至是患者，其监控可能导致不良事件的风险增加的处方或药物使用，或者发出医疗警报以防止相矛盾的药剂的处方。结果可通过发电子邮件到“家庭”计算机或普及计算装置(如智能电话或笔记本等)而发送给患者。例如，结果可作为整个报告的电子邮件附件或作为文本消息警报。

方法、系统和分析仪的说明性实施方案

如以下所用，对方法、系统或分析仪的任何提及都将被理解为单独地对那些方法、系统或分析仪中的每一个的提及(例如，“说明性实施方案1-4”将被理解为“说明性实施方案1、2、3或4”)。

说明性实施方案1是一种预测酒精性肝炎的患者死亡率的方法，其包括：获取从受试者获得的生物样品的NMR光谱；基于所述样品的NMR光谱程序化地确定所述样品中LP-Z和总的含apoB脂蛋白的浓度，其中所述样品的NMR光谱包括LP-X和LP-Z；和计算Z指数得分。

说明性实施方案2是任何前述或后续实施方案的方法，其中所述方法的获取步骤包括：对于从受试者获得的生物样品的NMR光谱产生测量的脂质信号线形；和生成所述样品的计算线形。

说明性实施方案3是任何前述或后续实施方案的方法，其中所述计算线形基于包括LP-X和LP-Z的脂蛋白组分的导出浓度。

说明性实施方案4是任何前述或后续实施方案的方法，其中所述脂蛋白组分中的每一种的导出浓度是所述组分的参考光谱和计算的参考系数的函数。

说明性实施方案5是任何前述或后续实施方案的方法，其中生成步骤包括基于线性最小二乘拟合技术计算所述计算线形的参考系数。

说明性实施方案6是任何前述或后续实施方案的方法，其还包括：确定所述样品的初始计算线形与所述样品的测量线形之间的相关度；以及如果所述样品的计算线形与测量线形之间的相关度高于预定阈值，则基于所述计算线形确定LP-Z的存在。

说明性实施方案7是任何前述或后续实施方案的方法，其中所述Z指数得分包括脂蛋白LP-Z、LDL和VLDL的浓度。

说明性实施方案8是任何前述或后续实施方案的方法，其中所述Z指数是LP-Z浓度与含ApoB脂蛋白总浓度的比值。

说明性实施方案9是任何前述或后续实施方案的方法，其中所述Z指数通过以下等式计算：

Z指数＝([ LP-Z ])/([ VLDL ] + [ LDL ] + [ LP-Z ])。

说明性实施方案10是任何前述或后续实施方案的方法，其中大于0.6的Z指数预测患者死亡将在90天或更短时间内发生。

说明性实施方案11是任何前述或后续实施方案的方法，其中所述方法预测在90天内患者死亡的可能性。

说明性实施方案12是任何前述或后续实施方案的方法，其中所述方法预测存活的可能性或患者对治疗的反应。

说明性实施方案13是任何前述或后续实施方案的方法，其还包括，在程序化确定之前，

将受试者的样品置于NMR光谱仪中；

对NMR光谱去卷积；以及

基于去卷积的NMR光谱计算多个选择的脂蛋白参数的NMR导出测量。

说明性实施方案14是任何前述或后续实施方案的方法，其还包括产生列出所述样品中存在的脂蛋白成分的浓度和死亡可能性的报告。

说明性实施方案15是任何前述实施方案的方法，其中所述生物样品是血液、血清、血浆、脑脊液或尿液中的一种。

说明性实施方案16是一种NMR分析仪，其包括：

NMR光谱仪；

与所述光谱仪通信的探针；以及

与所述光谱仪通信的控制器，所述控制器配置成获得与所述探针中的流体样本的LP-Z关联的NMR光谱的限定单个峰区域的NMR信号且生成提供LP-Z水平的患者报告。

说明性实施方案17是任何前述或后续实施方案的分析仪，其中所述控制器与至少一个本地或远程处理器通信，其中所述至少一个处理器被配置成：

(i)获得所述流体样本的拟合区域的复合NMR光谱；以及

(ii)使用限定的去卷积模型去卷积所述复合NMR光谱以生成LP-Z水平。

说明性实施方案18是任何前述或后续实施方案的分析仪，其中所述去卷积模型包括高密度脂蛋白(HDL)组分、低密度脂蛋白(LDL)组分、VLDL (极低密度脂蛋白)/乳糜微粒组分、LP-X、LP-Y和LP-Z中的至少一种。

说明性实施方案19是任何前述或后续实施方案的分析仪，其中所述探针是流量探针。

说明性实施方案20是任何前述或后续实施方案的分析仪，其中所述流体样本是体外血浆生物样品。

说明性实施方案21是任何前述实施方案的分析仪，其中所述流体样本是血液、血清、血浆、脑脊液或尿液的生物样品。