重组酿酒酵母及其构建方法和应用

文档序号：1948457 发布日期：2021-12-10 浏览：5次 >En<

阅读说明：本技术 重组酿酒酵母及其构建方法和应用 (Recombinant saccharomyces cerevisiae and construction method and application thereof ) 是由戴宗杰苏立秋赵全禄张媛媛王钦宏于 2021-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了重组酿酒酵母及其构建方法和应用。该重组酿酒酵母的构建方法,包括：将香叶醇合成酶基因和/或柠檬烯合成酶基因导入酿酒酵母,得到产月桂烯的重组酿酒酵母。本发明为月桂烯的生物合成方面提供有力菌株及研究基础,对高活性月桂烯合成酶的挖掘具有重要意义。(The invention discloses recombinant saccharomyces cerevisiae and a construction method and application thereof. The construction method of the recombinant saccharomyces cerevisiae comprises the following steps: and (3) introducing a geraniol synthetase gene and/or a limonene synthetase gene into saccharomyces cerevisiae to obtain the recombinant saccharomyces cerevisiae for producing myrcene. The invention provides a powerful strain and a research foundation for the biosynthesis of myrcene, and has important significance for the mining of high-activity myrcene synthase.)

重组酿酒酵母及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及重组酿酒酵母及其构建方法和应用。

背景技术

单萜类化合物是分子中含有两分子异戊二烯单位的萜烯及其衍生物。按其结构分类包括：无环单萜，单环单萜，多环单萜。因其药用价值及其在食品、化妆品、能源工业中存在的巨大应用潜力，吸引了广泛关注。目前，单萜类化合物主要通过从天然植物中提取或者化学合成得到，但是这些方法产率低，高度依赖原料的可利用性。同时，产生的废弃物成分复杂，污染环境，给后续处理带来困难。随着合成生物学技术和代谢工程的发展，改造微生物使其成为高附加值化学品合成的细胞工厂，为萜类化合物的合成开辟了绿色清洁生产的新途径。

发明内容

本发明的一个目的是提供产月桂烯的重组酿酒酵母的构建方法。

本发明提供了一种产月桂烯的重组酿酒酵母的构建方法，包括：将香叶醇合成酶基因和/或柠檬烯合成酶基因导入酿酒酵母，得到产月桂烯的重组酿酒酵母。

香叶醇合成酶和柠檬烯合成酶统称为月桂烯合成酶。

例如，所述酿酒酵母为能够积累月桂烯合成前体牻牛儿基二磷酸盐(GPP)的酿酒酵母。

可选地，根据上述的构建方法，所述香叶醇合成酶基因来源于罗勒和/或紫苏；所述柠檬烯合成酶基因来源于温州蜜柑。

可选地，根据上述的构建方法，所述香叶醇合成酶基因编码的香叶醇合成酶氨基酸序列为SEQ ID No.10和/或11所示；所述柠檬烯合成酶基因编码的柠檬烯合成酶氨基酸序列为SEQ ID No.12所示。

所述香叶醇合成酶基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.6第777-2414位所示和/或SEQ ID No.7第777-2381位所示；所述柠檬烯合成酶基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.8第777-2444位所示。

可选地，根据上述的构建方法，所述酿酒酵母为提高出发酿酒酵母中法尼基焦磷酸合成酶ERG20、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶AtHMG1、乙酰辅酶A酰基转移酶mvaE、HMG-CoA合成酶mvaS-m、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1、甲羟戊酸激酶ERG12、MVAP激酶ERG8和/或MVAPP脱羧酶ERG19的含量和/或活性，和/或降低出发酿酒酵母中半乳糖调节基因Gal80基因表达得到的菌。例如，提高酶的含量和/或活性通过增加所述出发酿酒酵母相应酶基因的拷贝数实现，降低Gal80基因表达通过敲除所述出发酿酒酵母Gal80基因实现。

可选地，所述出发酿酒酵母为TIB H1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.21000。

可选地，根据上述的构建方法，包括：对所述出发酿酒酵母还进行如下至少一种改造，获得所述酿酒酵母：A1、导入法尼基焦磷酸合成酶基因96位和127位双点突变基因ERG20^F96W/N127W基因；A2、导入tHMG1基因；A3、导入mvaE基因；A4、导入mvaS-m基因；A5、导入IDI1基因；A6、导入ERG12基因；A7、导入ERG8基因；A8、导入ERG19基因；A9、敲除Gal80基因。

可选地，所述ERG20^F96W/N127W基因编码的ERG20^F96W/N127w蛋白质的序列如SEQ IDNo.13所示；和/或，所述tHMG1基因编码的tHMG1蛋白质的序列为genbank登陆号：AJS96703.1序列第530-1054位所示；和/或，所述mvaE基因编码的mvaE蛋白质的序列为genbank登陆号AAG02439.1所示；和/或，所述mvaS-m基因编码的mvaS-m蛋白质的序列为genbank登陆号AAG02438.1第110位丙氨酸替换为甘氨酸所示；和/或，所述IDI1基因编码的IDI1蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_015208.1序列所示；和/或，所述ERG12基因编码的ERG12蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013935.1序列所示；和/或，所述ERG8基因编码的ERG8蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013947.1序列所示；和/或，所述ERG19基因编码的ERG19蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_014441.1序列所示。

可选地，所述ERG20^F96W/N127W基因序列如SEQ ID No.1第722-1780位所示；和/或，所述tHMG1基因序列如SEQ ID No.2第800-2383位所示；和/或，所述mvaE基因序列如SEQ IDNo.3第270-2681位的反向互补所示；和/或，所述mvaS-m基因序列如SEQ ID No.3第3358-4509位所示；和/或，所述IDI1基因序列如SEQ ID No.4第270-1136位的反向互补所示；和/或，所述ERG12基因序列如SEQ ID No.4第1813-3144位所示；和/或，所述ERG8基因序列如SEQ ID No.5第333-1688位的反向互补所示；和/或，所述ERG19基因序列如SEQ ID No.5第2365-3555位所示。

可选地，根据上述的构建方法，所述将香叶醇合成酶基因和/或柠檬烯合成酶基因导入出发酿酒酵母通过向所述出发酿酒酵母导入香叶醇合成酶基因表达盒和/或柠檬烯合成酶基因表达盒实现；和/或，所述A1通过向所述出发酿酒酵母导入ERG20^F96W/N127W基因表达盒实现；和/或，所述A2通过向所述出发酿酒酵母导入tHMG1基因表达盒实现；和/或，所述A3通过向所述出发酿酒酵母导入mvaE基因表达盒实现；和/或，所述A4通过向所述出发酿酒酵母导入mvaS-m基因表达盒实现；和/或，所述A5通过向所述出发酿酒酵母导入IDI1基因表达盒实现；和/或，所述A6通过向所述出发酿酒酵母导入ERG12基因表达盒实现；和/或，所述A7通过向所述出发酿酒酵母导入ERG8基因表达盒实现；和/或，所述A8通过向所述出发酿酒酵母导入ERG19基因表达盒实现；和/或，所述A9通过CRISPR/CAS9系统敲除所述出发酿酒酵母中的Gal80基因实现。

可选地，根据上述的构建方法，所述香叶醇合成酶基因表达盒和/或柠檬烯合成酶基因表达盒包括启动子、所述香叶醇合成酶基因和/或柠檬烯合成酶基因和终止子，所述启动子为Gal2；所述终止子为CYC1。例如，所述香叶醇合成酶基因表达盒序列为SEQ ID No.6的72-2633位所示或SEQ ID No.7的72-2600位所示，所述柠檬烯合成酶基因表达盒序列为SEQ ID No.8的72-2663位所示。

可选地，根据上述的构建方法，所述ERG20^F96W/N127W基因表达盒序列如SEQ ID No.1第54-2141位所示；和/或，所述tHMG1基因表达盒序列如SEQ ID No.2第75-2769位所示；和/或，所述mvaE基因表达盒序列如SEQ ID No.3第78-3357位的反向互补所示；和/或，所述mvaS-m基因表达盒序列如SEQ ID No.3第2682-4728位所示；和/或，所述IDI1基因表达盒序列如SEQ ID No.4第69-1812位的反向互补所示；和/或，所述ERG12基因表达盒序列如SEQID No.4第1137-3256位所示；和/或，所述ERG8基因表达盒序列如SEQ ID No.5第74-2364位的反向互补所示；和/或，所述ERG19基因表达盒序列如SEQ ID No.5第1689-3774位所示。

通过CRISPR/CAS9系统敲除所述出发酿酒酵母中的Gal80基因具体可为将CAS9基因、gRNA基因和Gal80同源重组片段导入所述出发酿酒酵母菌，并使CAS9基因和gRNA基因表达。所述gRNA基因编码的gRNA片段靶向Gal80基因。Gal80同源重组片段例如可为SEQ IDNo.9所示。

采用上述的构建方法构建的重组酿酒酵母也属于本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供生产月桂烯的方法。

本发明提供了生产月桂烯的方法，包括培养上述重组酿酒酵母，得到发酵产物，即得到月桂烯。

本发明还提供了下述任一一种应用，X1、上述的构建方法在制备生产月桂烯产品中的应用；X2、上述的构建方法在生产月桂烯中的应用；X3、上述的重组酿酒酵母在制备生产月桂烯产品中的应用；X4、上述的重组酿酒酵母在生产月桂烯中的应用；X5、香叶醇合成酶基因或柠檬烯合成酶基因在制备生产月桂烯产品中的应用；X6、香叶醇合成酶基因或柠檬烯合成酶基因在生产月桂烯中的应用；X7、香叶醇合成酶或柠檬烯合成酶在制备生产月桂烯产品中的应用；X8、香叶醇合成酶或柠檬烯合成酶在生产月桂烯中的应用。

可选地，上述应用中，所述香叶醇合成酶基因来源于罗勒和/或紫苏；所述柠檬烯合成酶基因来源于温州蜜柑。例如，所述香叶醇合成酶基因编码的香叶醇合成酶氨基酸序列为SEQ ID No.10和/或SEQ ID No.11所示；所述柠檬烯合成酶基因编码的柠檬烯合成酶氨基酸序列为SEQ ID No.12所示。又例如，所述香叶醇合成酶基因的核苷酸序列可为SEQID No.6第777-2414位所示和/或SEQ ID No.7第777-2381位所示；所述柠檬烯合成酶基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.8第777-2444位所示。

月桂烯是一种芳香烃，是许多不同植物精油的重要组成部分，它是一种单萜物质。本发明实施例通过对酿酒酵母中MVA途径进行强化及导入香叶醇合成酶基因或柠檬烯合成酶基因，构建出产月桂烯的重组酿酒酵母；对香叶醇合成酶和柠檬烯合成酶进行筛选，可提高重组酿酒酵母月桂烯的产量；为月桂烯的生物合成方面提供有力菌株及研究基础，对高活性月桂烯合成酶的挖掘具有重要意义。

保藏说明

菌种名称：酿酒酵母

拉丁名：Saccharomyces cerevisiae

菌株编号：TIB H1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020年11月04日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21000

附图说明

图1为实施例3工程菌的月桂烯产量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值表示。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TIB H1，已于2020年11月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.21000。

YPD培养基，每L体积YPD培养基包含：20g蛋白胨，10g酵母提取物，20g葡萄糖，20g琼脂粉(YPD固体培养基添加)

无尿嘧啶添加的SD平板：每L体积无尿嘧啶添加的SD培养基含：8g Ura minusmeida(北京泛基诺科技有限公司)，20g琼脂粉，20g葡萄糖。

含5-氟乳清酸的SD平板，每L体积含5-氟乳清酸的SD含：8g Ura minus meida(北京泛基诺科技有限公司)，20g琼脂粉，20g葡萄糖，尿嘧啶60mg，5-氟乳清酸1g。

Delft液体培养基，每L体积Delft液体培养基包含：20g葡萄糖，7.5g硫酸铵，0.5g七水硫酸镁，14.4g磷酸二氢钾，2ml微量金属盐母液(1L体积中含3.0g七水硫酸铁，4.5g七水硫酸锌，4.5g二水氯化钙，0.84g二水氯化锰，0.3g六水氯化钴，0.3g五水硫酸铜，0.4g二水钼酸钠，1.0g硼酸，0.1g碘化钾，19.0g乙二胺四乙酸二钠盐)，1ml维他命母液(1L体积中含0.05g D-生物素，1.0g D-泛酸，1.0g维生素B1，1.0g吡哆醇，1.0g烟酸，0.2g 4-氨基苯酸，25.0g肌醇)，60mg尿嘧啶。

下述实施例中的基因片段和蛋白质序列相关信息参见下表。

基因片段和蛋白质序列相关信息

蛋白质相关信息

实施例1、目标基因的制备

1、MVA途径改造相关基因的获得

ERG20^F96W-N127W-T_ERG20、tHMG-T_hmgl、IDI1-T_IDI1、ERG8-T_ERG8、ERG12-T_ERG12、ERG19-T_ERG19基因及Gal1、Gal2、Gal7、Gal10启动子，ADH、CYC1终止子、Gal80上游片段和Gal80下游片段的获得。

提取酵母基因组DNA为模板，使用表1中基因扩增所需引物进行扩增，得到符合预期大小的片段

使用PrimSTAR HS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，Dntp Mix 4μL，引物各1μL，基因组DNA模板1μL，HS聚合酶(2.5U/＞L)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸2.5分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。

表1为引物序列

2、月桂烯合成酶及mvaS-m、mvaE基因的获得

将香叶醇合成酶和柠檬烯合成酶统称为月桂烯合成酶。

苏州金唯智生物科技有限公司依照GerS_Pc(香叶醇合成酶，来源于紫苏Perillacitriodora)，GerS_Ob(香叶醇合成酶，来源于罗勒Ocimum basilicum)，LS_Cu(柠檬烯合成酶，来源于温州蜜柑Citrus unshiu)，mvaE(来源于肠球菌Enterococcus)，mvaS-m(来源于肠球菌)密码子优化后基因序列人工合成得到双链DNA，然后将双链DNA转化克隆至克隆载体pET28a(苏州金唯智生物科技有限公司)中，分别构建含以上基因的质粒。

使用以上各质粒为模板，表2中基因扩增所需引物进行扩增，得到符合预期大小的片段，产物经割胶回收保存。由此获得GerS_Pc基因、GerS_Ob基因、LS_Cu基因和mvaE基因和mvaS-m基因。

表2为引物序列

3、P_Gal1-ERG20^F96W-N127W-T_Eer20表达元件的构建

利用Overlap PCR技术将以上获得的片段P_Gal1，ERG20^F96W-N127W-T_Eer20进行连接扩增，使用PrimSTAR HS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PSBuffer 10μL，Dntp Mix 4μL，引物P_Gal1-f及TErg20-r各1μL，基因组DNA模板1μL(P_Gal1，ERG20^F96W-N127W-T_Eer20各片段添加摩尔比为1：1)，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存。获得P_Gal1-ERG20^F96W-N127W-T_Eer20表达元件。P_Gal1-ERG20^F96W-N127W-T_Eer20表达元件含有ERG20^F96W-N12TW表达盒，其表达ERG20^F96W-N127w基因，表达产物为ERG20^F96W-N127w蛋白质。

4、P_Gal7-tHMG1-T_hmg1表达元件的构建

利用Overlap PCR技术将以上获得的片段P_Gal7，tHMG1-T_hmmg1进行连接扩增，使用PrimSTAR HS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer10μL，Dntp Mix 4μL，引物P_aal7-f及Thmg1-r各1μL，基因组DNA模板1μL(P_Gal7，tHMG-T_hmg1各片段添加摩尔比为1∶1)，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存，获得P_Gal7-tHMG1-T_hmg1表达元件。P_Gal7-tHMG1-T_hmg1表达元件含有tHMG1表达盒，其表达tHMG1基因，表达产物为tHMG1蛋白质。

4、T_ADH-mvaE-P_GAL1-P_GAL10-mvaS-m-T_CYC1表达元件的构建

利用Overlap PCR技术将以上获得的片段T_ADH，mvaE，P_GAL1，P_GAL10，mvaS-m，T_CYC1进行连接扩增，使用PrimSTAR HS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，Dntp Mix 4μL，引物T_ADH1-r及T_CYC1-r各1μL，基因组DNA模板1μL(T_ADH，mvaE，P_GAL1，P_GAL10，mvaS-m，T_CYC1各片段摩尔比1∶3∶5∶5∶3∶1)，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸6分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存，获得T_ADH-mvaE-P_GAL1-P_GAL10-mvaS-m-T_CYC1表达元件。T_ADH-mvaE-P_GAL1-P_GAL10-mvaS-m-T_CYC1表达元件含有mvaE表达盒和mvaS-m表达盒。mvaE表达盒表达mvaE基因，表达产物为mvaE蛋白质。mvaS-m表达盒表达mvaS-m基因，表达产物为mvaS-m蛋白质。

5、T_IDI1-IDI1-P_GAL1-P_GAL10-ERG12-T_ERG12表达元件的构建

利用Overlap PCR技术将以上获得的片段IDI1-T_IDI1，P_GAL1，P_GAL10，ERG12-T_ERG12进行连接扩增，使用PrimSTAR HS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，Dntp Mix 4μL，引物T_IDI1-r及T_ERG20-r各1μL，基因组DNA模板1μL(IDI1-T_IDI1，P_GAL1，P_GAL10，ERG12-T_ERG12各片段摩尔比1∶3∶3∶1)，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸6分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存，获得T_IDI1-IDI1-P_GAL1-P_GAL10-ERG12--T_ERG12表达元件。T_IDI1-IDI1-P_GAL1-P_GAL10-ERG12-T_ERG12表达元件含有IDl1表达盒和ERG12表达盒。IDI1表达盒表达IDI1基因，表达产物为IDI1蛋白质。ERG12表达盒表达ERG12基因，表达产物为ERG12蛋白质。

6、T_ERG8-ERG8-P_GAL1-P_GAL10-ERG19-T_ERG19表达元件的构建

利用Overlap PCR技术将以上获得的片段ERG8-T_ERG8，P_Gal1，P_Gal10，ERG19-T_ERG19进行连接扩增，使用PrimSTAR HS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，Dntp Mix 4μL，引物T_ERG8-r及T_CYC1-r各1μL，基因组DNA模板1μL(ERG8-T_ERG8，P_GAL1，P_GAL10，ERG19-T_ERG19各片段摩尔比1∶3∶3∶1)，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸6分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存，获得T_ERG8-ERG8-P_GAL1-P_GAL10-ERG19-T_erg19表达元件。T_ERG8-ERG8-P_GAL1-P_GAL10-ERG19-T_erg19表达元件含有ERG8表达盒和ERG19表达盒。ERG8表达盒表达ERG8基因，表达产物为ERG8蛋白质。ERG19表达盒表达ERG19基因，表达产物为ERG19蛋白质。

P_Gal2-GerS_Pc-T_cyc1表达元件的构建

利用Overlap PCR技术将以上获得的片段P_Gal2，GerS_Pc，T_cyc1进行连接扩增，使用PrimSTAR HS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，Dntp Mix 4μL，引物PGa12-f及TCYC1-r各1μL，基因组DNA模板1μL(P_Gal2，GerS_Pc，Tcyc1各片段摩尔比1∶3∶1)，HS聚合酶(2.5U/＞L)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存，获得P_Gal2-GerS_Pc-T_cyc1表达元件。P_Gal2-GerS_Pc-T_cyc1表达元件含有GerS_Pc表达盒，表达GerS_Pc基因，表达产物为GerS_Pc蛋白质。

7、P_Gal2-GerS_Ob-T_cyc1表达元件的构建

利用Overlap PCR技术将以上获得的片段P_Gal2，GerS_Ob，T_cyc1进行连接扩增，使用PrimSTAR HS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，Dntp Mix 4μL，引物PGal2-f及TCYC1-r各1μL，基因组DNA模板1μL(P_Gal2，GerS_Ob，Tcyc1各片段摩尔比1∶3∶1)，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存，获得P_Gal2-GerS_Ob-T_cyc1表达元件。P_Gal2-GerS_Ob-T_cyc1表达元件含有GerS_Ob表达盒，表达GerS_Ob基因，表达产物为GerS_Ob蛋白质。

8、P_Gal2-LS_Cu-T_cyc1表达元件的构建

利用Overlap PCR技术将以上获得的片段P_Gal2，LS_Cu，T_cyc1进行连接扩增，使用PrimSTAR HS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，Dntp Mix 4μL，引物PGal2-f及TCYC1-r各1μL，基因组DNA模板1μL(PGal2，LS_Cu，Tcyc1各片段摩尔比1∶3∶1)，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存，获得P_Gal2-LS_Cu-T_cycl表达元件。P_Gal2-LS_Cu-T_cyc1表达元件含有LS_Cu表达盒，表达LS_Cu基因，表达产物为LS_Cu蛋白质。

9、Gal80同源重组片段的构建

利用Overlap PCR技术将以上获得的片段Gal80上游片段与Ga180下游片段进行连接扩增，使用PrimSTAR HS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，Dntp Mix 4μL，引物Gal80-up-f及Gal80-down-r各1μL，基因组DNA模板1μL(Gal80上游片段∶Gal80下游片段摩尔比1∶1)，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存，获得Gal80同源重组片段，用于Gal80基因的敲除。

实施例2、重组菌的构建

1、酵母感受态的制备

将出发菌单菌落于YPD培养基中30℃，250rpm过夜培养，计数过夜培养物细胞密度，以最终OD_600nm0.1的细胞浊度接种20mlYPD培养基。30℃，250rpm培养至OD_600nm0.8。使用无菌离心管2500rpm离心5分钟，收集细胞。弃培养液，把细胞悬浮于无菌水中，再同上离心。弃水，把细胞悬浮于1mL100mM醋酸锂中，转悬浮物到无菌离心管中；高速短时沉淀细胞，去除醋酸锂；悬浮细胞到4倍体系的100mM醋酸锂中并分装获得感受态细胞。

下述重组菌的构建原理为菌株TIB H1中预先转入了可以表达Cas9蛋白的表达元件，而后表达gRNA的重组质粒(质粒1-6)与表达元件或同源重组片段一同转化进该菌株中，表达gRNA的重组质粒识别并结合相应位点特定PAM区，同时激活并指导Cas9蛋白行使剪切功能，使相应位点的双链DNA断裂开，此时含有同源区的表达元件或同源重组片段通过同源重组修复被整合进入菌株DNA中。

2、含gRNA的重组质粒的构建

质粒pBGR的构建：以pET32a载体为模板，使用引物1及引物3扩增含片段AmpR表达框及ori片段的片段1，以酿酒酵母TIB H1基因组为模板，以引物8及引物9扩增片段Ura3表达盒；以p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t(DiCarlo JE，Norville JE，Mali P，etal.Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cassystems.Nucleic Acids Res2013b；41：4336-43)为模板，以引物4及引物5扩增gRNA表达框1，以引物10及引物11扩增gRNA表达框2，以引物6及引物7扩增2μori，使用overlap PCR，以gRNA表达框1，gRNA表达框2，2μori片段为模板，以引物4及引物10获得片段2；使用CloneExpress II试剂盒(诺唯赞)，将片段1及片段2在体外重组，转化入DH5α感受态细胞进行扩增，提取质粒，获得质粒pBGR。

质粒1：以质粒pBGR为模板，以引物gRNA1-f，gRNA1-r扩增基因片段gRNA1，以引物pBGR-2-f扩增基因片段pBGR-2，利用CloneExpress II试剂盒(诺唯赞)将以上获得的基因片段gRNA1，pBGR-2进行重组，获得质粒1。质粒1表达gRNA1，其靶序列为tgaaactctaatcctactat，tagaaacgcggacacaggag。

质粒2：以pBGR为模板，以引物gRNA2-f扩增基因片段gRNA2，以引物pBGR-2-f扩增基因片段pBGR-2，利用CloneExpress II试剂盒(诺唯赞)将以上获得的基因片段gRNA2，pBGR-2进行重组，获得质粒2。质粒2表达gRNA2，其靶序列为gcaatgcgatgttagtttag。

质粒3：以pBGR为模板，以引物gRNA3-f扩增基因片段gRNA3，以引物pBGR-2-f扩增基因片段pBGR-2，利用CloneExpress II试剂盒(诺唯赞)将以上获得的基因片段gRNA3，pBGR-2进行重组，获得质粒3。质粒3表达gRNA3，其靶序列为cgccattcaagagcagcaac。

质粒4：以pBGR为模板，以引物gRNA4-f扩增基因片段gRNA4，以引物pBGR-2-f扩增基因片段pBGR-2，利用CloneExpress II试剂盒(诺唯赞)将以上获得的基因片段gRNA4，pBGR-2进行重组，获得质粒4。质粒4表达gRNA4，其靶序列为ttgtcacagtgtcacatcag。

质粒5：以pBGR为模板，以引物gRNA5-f扩增基因片段gRNA5，以引物pBGR-2-f扩增基因片段pBGR-2，利用CloneExpress II试剂盒(诺唯赞)将以上获得的基因片段gRNA5，pBGR-2进行重组，获得质粒5。质粒5表达gRNA5，其靶序列为tggatgctctgatattacacagg。

质粒6：以pBGR为模板，以引物gRNA6-f扩增基因片段gRNA6，以引物pBGR-2-f扩增基因片段pBGR-2，利用CloneExpress II试剂盒(诺唯赞)将以上获得的基因片段gRNA6，pBGR-2进行重组，获得质粒6。质粒6表达gRNA6，其靶序列为atatgtctctaattttggaa。

上述所使用的引物如表3所示。

表3引物序列

3、GPP-1菌株的构建

出发菌酿酒酵母TIB H1于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)DNA(2mg/mL)，50μL水和基因(P_Gal1-ERG20^F96W-N127W-T_Erg20表达元件，P_Gal7-tHMG1-T_hmmg1表达元件，质粒1)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为GPP-1并保存。

4、GPP-2菌株的构建

出发菌酿酒酵母GPP-1于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL)，50μL水和基因(T_ADH-mvaE-P_GAL1-P_GAL10-mvaS-m-T_CYc1表达元件，质粒2)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为GPP-2并保存。

5、GPP-3菌株的构建

出发菌酿酒酵母GPP-2于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL)，50μL水和基因(T_IDI1-IDI1-P_6AL1-P_GAL10-ERG12-T_ERG12表达元件，质粒3)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为GPP-3并保存。

6、GPP-4菌株的构建

出发菌酿酒酵母GPP-3于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0 mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL)，50μL水和基因(T_ERG8-ERG8-P_GAL1-P_GAL10-ERG19-T_ERG19表达元件，质粒4)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为GPP-4并保存。

7、GPP-5菌株的构建

出发菌酿酒酵母GPP-4于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0 mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL)，50μL水和基因(Gal80同源重组片段，质粒5)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为GPP-5并保存。

8、SLQ-1菌株的构建

出发菌酿酒酵母GPP-5于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0 mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL)，50μL水和基因(P_Gal2-GerS_Pc-T_cyc1表达元件，质粒6)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为SLQ-1并保存。

9、SLQ-2菌株的构建

出发菌酿酒酵母GPP-5于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL)，50μL水和基因(P_Gal2-GerS_Ob-T_cyc1表达元件，质粒6)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为SLQ-2并保存。

10、SLQ-3菌株的构建

出发菌酿酒酵母GPP-5于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL)，50μL水和基因(P_Gal2-LS_Cu-T_cyc1表达元件，质粒6)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为SLQ-3并保存。

实施例3、重组菌在生产月桂烯中的应用

1、工程菌培养及产物提取

在Delft液体培养基中分别活化实施例2制备的酵母工程菌株SLQ-1、SLQ-2和SLQ-3，于Delft液体培养基中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1％的接种量接种于含20mLDelft液体培养基及2ml含仲丁基苯正十二烷的100mL三角瓶中，30℃，250rpm培养2-3天，最后，将三角瓶中液体转移至50ml离心管，5000rpm离心5min，收集有机相备用。

2、菌体生产月桂烯的定性定量分析

将步骤1收集的有机相物质用正己烷稀释50倍，用GC-MS检测。GC-MS测定条件：进样口温度260℃，进样体积1μL，不分流，溶剂延时3min；色谱柱：HP-5ms(30m*0.25mM)；色谱条件：60℃，3min，40℃/min到150℃，20℃/min到220℃，40℃/min到260℃保温2min；MS条件：Full Scan：50-750amu。用月桂烯的标准品(北京润泽康生物科技有限公司，M812782)进行定性定量。月桂烯标准品按照上述参数进行HPCL的出峰峰值对应的保留时间为8.0min。步骤1收集的有机相物质在8.0min有出峰，表明步骤1收集的有机相物质均含有月桂烯。

结果如图1所示，各工程菌发酵3天时产量如下：

SLQ-1、SLQ-2、SLQ-3的月桂烯产量分别为21.7mg/L，56.9mg/L，17.3mg/L(相对于发酵液)。

该实施例证明，在酿酒酵母中表达月桂烯合成酶基因，可以生产月桂烯；采用宿主来源不同的月桂烯合成酶基因，其月桂烯的产量不同。上述SLQ-1、SLQ-2和SLQ-3产量相比较，采用来源于罗勒Ocimum basilicum经过密码子优化后的月桂烯合成酶基因(GerS Ob基因)，产量最高。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 重组酿酒酵母及其构建方法和应用

<130> 212192

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2224

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ataaggttta aaggcactga aacaataggc aagaagtagg cgagagccga catttatatt 60

gaattttcaa aaattcttac tttttttttg gatggacgca aagaagttta ataatcatat 120

tacatggcat taccaccata tacatatcca tatctaatct tacttatatg ttgtggaaat 180

gtaaagagcc ccattatctt agcctaaaaa aaccttctct ttggaacttt cagtaatacg 240

cttaactgct cattgctata ttgaagtacg gattagaagc cgccgagcgg gcgacagccc 300

tccgacggaa gactctcctc cgtgcgtcct cgtcttcacc ggtcgcgttc ctgaaacgca 360

gatgtgcctc gcgccgcact gctccgaaca ataaagattc tacaatacta gcttttatgg 420

ttatgaagag gaaaaattgg cagtaacctg gccccacaaa ccttcaaatt aacgaatcaa 480

attaacaacc ataggatgat aatgcgatta gttttttagc cttatttctg gggtaattaa 540

tcagcgaagc gatgattttt gatctattaa cagatatata aatggaaaag ctgcataacc 600

actttaacta atactttcaa cattttcagt ttgtattact tcttattcaa atgtcataaa 660

agtatcaaca aaaaattgtt aatatacctc tatactttaa cgtcaaggag aaaaaactat 720

aatggcttca gaaaaagaaa ttaggagaga gagattcttg aacgttttcc ctaaattagt 780

agaggaattg aacgcatcgc ttttggctta cggtatgcct aaggaagcat gtgactggta 840

tgcccactca ttgaactaca acactccagg cggtaagcta aatagaggtt tgtccgttgt 900

ggacacgtat gctattctct ccaacaagac cgttgaacaa ttggggcaag aagaatacga 960

aaaggttgcc attctaggtt ggtgcattga gttgttgcag gcttactggt tggtcgccga 1020

tgatatgatg gacaagtcca ttaccagaag aggccaacca tgttggtaca aggttcctga 1080

agttggggaa attgccatct gggacgcatt catgttagag gctgctatct acaagctttt 1140

gaaatctcac ttcagaaacg aaaaatacta catagatatc accgaattgt tccatgaggt 1200

caccttccaa accgaattgg gccaattgat ggacttaatc actgcacctg aagacaaagt 1260

cgacttgagt aagttctccc taaagaagca ctccttcata gttactttca agactgctta 1320

ctattctttc tacttgcctg tcgcattggc catgtacgtt gccggtatca cggatgaaaa 1380

ggatttgaaa caagccagag atgtcttgat tccattgggt gaatacttcc aaattcaaga 1440

tgactactta gactgcttcg gtaccccaga acagatcggt aagatcggta cagatatcca 1500

agataacaaa tgttcttggg taatcaacaa ggcattggaa cttgcttccg cagaacaaag 1560

aaagacttta gacgaaaatt acggtaagaa ggactcagtc gcagaagcca aatgcaaaaa 1620

gattttcaat gacttgaaaa ttgaacagct ataccacgaa tatgaagagt ctattgccaa 1680

ggatttgaag gccaaaattt ctcaggtcga tgagtctcgt ggcttcaaag ctgatgtctt 1740

aactgcgttc ttgaacaaag tttacaagag aagcaaatag aactaacgct aatcgataaa 1800

acattagatt tcaaactaga taaggaccat gtataagaac tatatacttc caatataata 1860

tagtataagc tttaagatag tatctctcga tctaccgttc cacgtgacta gtccaaggat 1920

tttttttaag ccaatgaaaa tgaagaaatg cgtgatcgga aattacgggt agtacgagaa 1980

ggaaacttga gccacccccc aaattttatt catataataa taggaaaagc aacgacctca 2040

tctctcgaac attgtttact tgagcaagtc cgattaagag taagttgtcg tacgttaaat 2100

acaaataatc aacaaaacac tacacaaaaa cttctacgat acacttttca atgaaacgga 2160

tattgatatg ctagtaaaag gacgagctca agagcgaaaa tataagtaaa gaattcgagt 2220

gcac 2224

<210> 2

<211> 2839

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aatctgtaac aagcgccatt tttttttctg tatcgggccc tccttactgc tctccttccg 60

tgtaacgcgt tatgtttgcc agcttactat ccttcttgaa aatatgcact ctatatcttt 120

tagttcttaa ttgcaacaca tagatttgct gtataacgaa ttttatgcta ttttttaaat 180

ttggagttca gtgataaaag tgtcacagcg aatttcctca catgtaggga ccgaattgtt 240

tacaagttct ctgtaccacc atggagacat caaaaattga aaatctatgg aaagatatgg 300

acggtagcaa caagaatata gcacgagccg cggagttcat ttcgttactt ttgatatcac 360

tcacaactat tgcgaagcgc ttcagtgaaa aaatcataag gaaaagttgt aaatattatt 420

ggtagtattc gtttggtaaa gtagaggggg taatttttcc cctttatttt gttcatacat 480

tcttaaattg ctttgcctct ccttttggaa agctatactt cggagcactg ttgagcgaag 540

gctcattaga tatattttct gtcattttcc ttaacccaaa aataagggaa agggtccaaa 600

aagcgctcgg acaactgttg accgtgatcc gaaggactgg ctatacagtg ttcacaaaat 660

agccaagctg aaaataatgt gtagctatgt tcagttagtt tggctagcaa agatataaaa 720

gcaggtcgga aatatttatg ggcattatta tgcagagcat caacatgata aaaaaaaaca 780

gttgaatatt ccctcaaaaa tggctgcaga ccaattggtg aaaactgaag tcaccaagaa 840

gtcttttact gctcctgtac aaaaggcttc tacaccagtt ttaaccaata aaacagtcat 900

ttctggatcg aaagtcaaaa gtttatcatc tgcgcaatcg agctcatcag gaccttcatc 960

atctagtgag gaagatgatt cccgcgatat tgaaagcttg gataagaaaa tacgtccttt 1020

agaagaatta gaagcattat taagtagtgg aaatacaaaa caattgaaga acaaagaggt 1080

cgctgccttg gttattcacg gtaagttacc tttgtacgct ttggagaaaa aattaggtga 1140

tactacgaga gcggttgcgg tacgtaggaa ggctctttca attttggcag aagctcctgt 1200

attagcatct gatcgtttac catataaaaa ttatgactac gaccgcgtat ttggcgcttg 1260

ttgtgaaaat gttataggtt acatgccttt gcccgttggt gttataggcc ccttggttat 1320

cgatggtaca tcttatcata taccaatggc aactacagag ggttgtttgg tagcttctgc 1380

catgcgtggc tgtaaggcaa tcaatgctgg cggtggtgca acaactgttt taactaagga 1440

tggtatgaca agaggcccag tagtccgttt cccaactttg aaaagatctg gtgcctgtaa 1500

gatatggtta gactcagaag agggacaaaa cgcaattaaa aaagctttta actctacatc 1560

aagatttgca cgtctgcaac atattcaaac ttgtctagca ggagatttac tcttcatgag 1620

atttagaaca actactggtg acgcaatggg tatgaatatg atttctaaag gtgtcgaata 1680

ctcattaaag caaatggtag aagagtatgg ctgggaagat atggaggttg tctccgtttc 1740

tggtaactac tgtaccgaca aaaaaccagc tgccatcaac tggatcgaag gtcgtggtaa 1800

gagtgtcgtc gcagaagcta ctattcctgg tgatgttgtc agaaaagtgt taaaaagtga 1860

tgtttccgca ttggttgagt tgaacattgc taagaatttg gttggatctg caatggctgg 1920

gtctgttggt ggatttaacg cacatgcagc taatttagtg acagctgttt tcttggcatt 1980

aggacaagat cctgcacaaa atgttgaaag ttccaactgt ataacattga tgaaagaagt 2040

ggacggtgat ttgagaattt ccgtatccat gccatccatc gaagtaggta ccatcggtgg 2100

tggtactgtt ctagaaccac aaggtgccat gttggactta ttaggtgtaa gaggcccgca 2160

tgctaccgct cctggtacca acgcacgtca attagcaaga atagttgcct gtgccgtctt 2220

ggcaggtgaa ttatccttat gtgctgccct agcagccggc catttggttc aaagtcatat 2280

gacccacaac aggaaacctg ctgaaccaac aaaacctaac aatttggacg ccactgatat 2340

aaatcgtttg aaagatgggt ccgtcacctg cattaaatcc taaacttagt catacgtcat 2400

tggtattctc ttgaaaaaga agcacaacag caccatgtgt tacgtaaaat atttacttta 2460

tagtttgtac gtcataattt cttccatatt acaagttcgt gcatatatag aaagaattct 2520

gttgttgtaa ttgtcataac tattgagctt tacctgaaaa ttcaacgaaa aaaactcaaa 2580

aaccacatgc ttctcttgag tcatgcggtt cctttccctt atgagtgaaa atcttccttt 2640

tttagctatg tgcgccatcc gataaatgta ggagcaatga agcggaaagt caattttttc 2700

atacagtata cattaatatc tagtgtgtat tgactgtgat cgggaagatc ttcagggttg 2760

aattacaact cggcgactct ctcgaaattt ttcttaacgc gtccttgtac tgcgtctaac 2820

gcttttgcca cttggattt 2839

<210> 3

<211> 4779

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgtgcaccg catcaaactt tctcggagga ttctttgcac cggttttcat tttcttccac 60

ggaataccaa gcccattcat gccggtagag gtgtggtcaa taagagcgac ctcatgctat 120

acctgagaaa gcaacctgac ctacaggaaa gagttactca agaataagaa ttttcgtttt 180

aaaacctaag agtcacttta aaatttgtat acacttattt tttttataac ttatttaata 240

ataaaaatca taaatcataa gaaattcgct cactgctttc taagatcgtt aagaattgca 300

agtgctctat cttggttcat tgtcttctgt cgcttaagtt gctgggccac ggcctcgact 360

tctttcccag tcgctcccac ggtcatagca agtgatcttg cttgaagtgc catgtgaccc 420

ttttgaatac cttctgaaac aagtgctcta agtgctgcca aattctgtgc aagtccaact 480

gctgcaacaa ctcttgaaag ttcctttgca tctgtaactg caagaagatc tgctgctgct 540

tgtgatttag gtagtacctt tgttgctcct ccaactgttg caagtgcaag aggaactgaa 600

atttctccaa taagttgttc tccatcaagt gtccatgatg taagtccttg atatcttcct 660

tctttaactg caaatgcatg acatgatgct gaaactgctc ttgtatcgtt tcctgttgcg 720

agtacgacgg cctctattcc gttcataatt cctttgttat gtgtaactgc tctataagga 780

tcaagtgatg catatcttga tgcaagcacg atcttctctg caatttctct tccgttagaa 840

ccctttgaaa gtcttgaaac aggaatggcc gtcttcattg taacaactga ttctgttgca 900

taattactga ggatgctgaa cagaatcttc tgctcggcga accattccct aaacagctca 960

gcaactcctt caagcattgc gttaacaatg tttgctccca ttgcatcttt aacatccacc 1020

aggaaatcaa cactcacgaa agactcgtcg aaggcgcggt actgcaaatc gcgaagaccg 1080

cctccacgct taacaattga aggatatgaa agttctgcct gctggaagat ttctgtttct 1140

ctaacttgaa gttcatcaat aagtgattct gcatctgcaa cgtcgtagaa gacaatttgt 1200

cctctcataa gtctttgttg gttgacagtc ttaaatcctt gggcgatctt tgctccgttt 1260

gaaagtgctg caataactga aggttcttct gttgccatag gaacaagata atctgtttca 1320

tcaactgtaa gatgaagtcc aactcccata ggaacttctg tttctgaaat ctgattctca 1380

atcatatggt ttgcaatttg tgatgaaagt gccgtattct cgaactcctt ctttgtatct 1440

gctgaaattt gtccttcgtt aagaagtgat gcaagtcttt cttcaggtga catctggtag 1500

aatcttgagt ttttcttctg ttgaggtctt tcaagaagca ttgctaaacc aagacctcca 1560

ccaatacaaa gtgacgcgac tccatatttc ttctccttct ggttaagttg atatgaaagt 1620

gatgtaagaa gacgcgctcc ggtagctccg attgcatgtc caagtgaaat tcctcctcca 1680

taaatattta ccttctcttc aggaagtgca agttctcttt gaacaacaat tgatgttgct 1740

gcaaatgctt cgttaatttc gtagaggtcg atctcctcag ttgtaagttg atttcgagcg 1800

aggagtttct gaattgcttt aataggtgaa attcccatat atgcaggatc aattccaact 1860

tcaactgaat ctctaataat tgcaagataa ggaagtccat gtgcttctgc atattcttgt 1920

gatgcaataa taagtgctga tgctccatcg ttaattgttg atgcgtttcc tgctgtaact 1980

gttccatcct ctttaaacac ggtcttaagt gtccctagct tctcaactga tgagttaggt 2040

ctaattccct cgtccttctc aacaagtgtt cctgaaactt caagaggtgc aatttcgtcg 2100

gcgaagattc cttctgcttg tgcttgtgct gctttaagtt gtgaatgcac agagaattga 2160

tcttgttctt ctcttgtaac gtggtacttc tctgctacat tctctgctgt aagtcccatt 2220

gcttggcccg agaatgcatc tgtaagtcca tcatacatca tagacgagaa aggtgcatca 2280

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cctcctgcaa taagaacttc tgcttctcca agttgaatga gctgctttgc aagaataact 2400

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<210> 4

<211> 3322

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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gtgatggtca tggtgttcaa cattctaaaa ttcatcaaca aatgggtggt ttgatgtttg 2400

aaccatatgt ttaaacaggc cccttttcct ttgtcgatat catgtaatta gttatgtcac 2460

gcttacattc acgccctcct cccacatccg ctctaaccga aaaggaagga gttagacaac 2520

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taaactgtt 2709

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7