一种利用基因编辑构建法夫酵母的方法
阅读说明：本技术 一种利用基因编辑构建法夫酵母的方法 (Method for constructing phaffia rhodozyma by using gene editing ) 是由 李志朋 杨昊翌 倪辉 李利君 陈哲昊 吴晓琪 朱艳冰 姜泽东 李清彪 于 2021-07-06 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种利用基因编辑构建法夫酵母的方法,其包括：以法夫酵母的基因组为DNA模板,以crtYB为目的基因,设计相对应的sgRNA,使用sgRNA体外转录试剂盒对sgRNA进行PCR扩增；将上述扩增后的sgRNA与Cas9组合形成核糖核蛋白,核糖核蛋白再导入质粒中；将上述获得的质粒电转化法夫酵母,用抗性平板筛选,并经PCR基因序列验证,得到利用基因编辑构建的法夫酵母。由此通过CRISPR Cas9编辑法夫酵母中的crtYB基因,将使其失去原有功能,并进一步对生物体造成影响。通过分析构建菌株中基因的变化以及生物体特征的改变,从而理解该基因在法夫酵母中的作用,为研究法夫酵母合成虾青素的机理提供重要帮助。(The invention provides a method for constructing phaffia rhodozyma by using gene editing, which comprises the following steps: the method comprises the following steps of (1) designing corresponding sgRNA by taking a genome of Phaffia as a DNA template and crtYB as a target gene, and carrying out PCR amplification on the sgRNA by using an sgRNA in-vitro transcription kit; combining the amplified sgRNA with Cas9 to form ribonucleoprotein, and introducing the ribonucleoprotein into a plasmid; and (3) screening the obtained plasmid electro-transformation phaffia rhodozyma by using a resistance plate, and verifying a PCR gene sequence to obtain the phaffia rhodozyma constructed by using gene editing. Therefore, the crtYB gene in the Phaffia rhodozyma is edited by the CRISPR Cas9, so that the original function of the Phaffia rhodozyma is lost, and the CRtYB gene further influences organisms. By analyzing the change of the gene in the constructed strain and the change of the organism characteristics, the function of the gene in the phaffia rhodozyma is understood, and important help is provided for researching the mechanism of synthesizing astaxanthin by the phaffia rhodozyma.)
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用基因编辑构建法夫酵母的方法。
背景技术
虾青素是一种类胡萝卜素，呈粉红色，具有极强的抗氧化活性，是迄今为止自然界里发现的抗氧化性最强的物质，被誉为"超级抗氧化剂"。天然虾青素的来源主要是红法夫酵母和微藻(雨生红球藻)，雨生红球藻较难培养，需要适宜的光照、温度和空气等，培育所需时间较长。红法夫酵母是虾青素的主要生物来源，但由于虾青素是胞内色素，是一种与细胞生长相偶联的次级代谢产物，且红法夫酵母最适生长温度低，菌体生长缓慢，使得虾青素的产量也比较低。目前高产虾青素酵母菌株主要是通过反复多次诱变和筛选得到。然而，反复多次诱变会产生有毒的突变株且会产生抗药性，难以再进行深入研究。
基因编辑技术是以特异性改变遗传物质靶向序列为目标的技术。近年来，锌指核酸酶、类转录激活因子效应核酸酶、规律成簇的间隔短回文重复和单碱基编辑技术的相继出现，不仅为基因功能研究提供了有力的工具，还为生命科学提供了新的技术方案。其中，CRISPR/Cas系统由于载体构建过程简单、编辑效率高等优点，成为当前广泛应用的主流基因编辑系统。目前几乎还没有将基因编辑应用于法夫酵母方面的研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种利用基因编辑构建法夫酵母的方法。
为此，根据本发明的实施例，提供了一种利用基因编辑构建法夫酵母的方法，其包括：
(1)以法夫酵母的基因组为DNA模板，以crtYB为目的基因，设计相对应的sgRNA，使用sgRNA体外转录试剂盒对sgRNA进行PCR扩增；
(2)将步骤(1)扩增后的sgRNA与Cas9组合形成核糖核蛋白，核糖核蛋白再导入质粒中；
(3)将步骤(2)获得的质粒电转化法夫酵母，用抗性平板筛选，并经PCR基因序列验证，得到利用基因编辑构建的法夫酵母。
根据本发明的实施例，crtYB基因是用于编码番茄红素环化酶的基因，而番茄红素环化酶是将线性的番茄红素转化为具有环状结构的类胡萝卜素的关键酶，是合成虾青素的重要步骤。基于以上分析，通过CRISPR Cas9编辑法夫酵母中的crtYB基因，将使其失去原有功能，并进一步对生物体造成影响，进而理解该基因在法夫酵母中的作用，为研究法夫酵母合成虾青素的机理提供重要帮助。
可选地，步骤(1)中，crtYB基因的序列如SEQ ID NO：1所示。
可选地，步骤(1)中，sgRNA进行PCR扩增使用的引物为：正向引物：5’ -ATAGGAGAATGGGATGTGGA-3’；反向引物：5’-AAGAGTTGTATTCCAGAAAGGGAA-3’。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例1中sgRNA片段PCR验证结果图，其中泳道1为Marker，泳道2 为sgRNA片段。
图2为本发明实施例2中基因编辑完成之后的部分测序结果对比，包括原始菌株MVP14 及各株编辑完成后的菌株。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。
实施例1核糖核蛋白形式的CRISPR Cas9的构建
根据http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html网页的方法，选取crtYB的基因序列 GACCTGCAGGCATGTCATGTCTAGTTGGTCATATG(SEQ ID NO：1)，置于网页中分析，得到crtYB的sgRNA序列为GCAGGCATGTCATGTCTAGTTGG。
根据sgRNA，设计相应的sgRNA的DNA模板链引物，正反向引物分别为：
正向引物：ATAGGAGAATGGGATGTGGA；
反向引物：AAGAGTTGTATTCCAGAAAGGGAA。
选取sgRNA体外原位转录试剂盒对sgRNA模板DNA链进行PCR扩增。将下表1组分混合在200μL PCR管中，短暂涡旋混合管底部的试剂。
表1 sgRNA模板DNA链PCR扩增
将反应放入PCR仪中，设定并由PCR仪自动运行以下程序：(1)98℃，10s；(2)65℃，5s；(3)重复(1)～(2)33个循环；(4)4℃保存。
在2％琼脂糖凝胶上运行并分析5μL PCR产物，如图1所示，可看到一个约156bp的条带。
sgRNA体外原位转录试剂盒进行，上步骤中扩增的PCR产物直接用作IVT反应的模板而无需纯化。
将以下组分(表2)在200μL PCR管中混合。短暂涡旋以收集管底部的试剂。
表2 sgRNA体外转录
将反应放入带有加热盖PCR仪，并由PCR仪自动运行以下程序，(1)37℃，4h；(2) 4℃保存。
采用Guide-it IVT RNA Clean-Up试剂盒对sgRNA进行纯化。
纯化具体步骤如下：
(1)向反应混合物中加入78μL RNaseFree Water，总体积为100μL。将所有100μL转移至1.5mL微量离心管中；
(2)加入30μL IVT结合缓冲液并涡旋5s；
(3)加入130μL异丙醇并涡旋5s；
(4)将IVT RNA Clean-Up Spin Column置于收集管中，并将步骤(3)中的样品加到吸附柱上。在室温下以11000rpm离心30s；
(5)丢弃滤液并将吸附柱放回收集管中；
(6)加入600μL IVT洗涤缓冲液，在室温下以11000rpm离心30s；
(7)丢弃滤液并将吸附柱放回收集管中；
(8)加入250μL IVT洗涤缓冲液，在室温下以11000rpm离心2min；
(9)将IVT RNA Clean-Up Spin Column置于新的1.5mL微量离心管中；
(10)将20μL RNaseFree Water直接加入Spin Column的柱子上，在室温下孵育1min；
(11)在室温下以11000rpm离心1min；
(12)吸取1μL洗脱液，使用NanoDrop分光光度计(或等效物)测量OD。预期产量为10～20μg的sgRNA。
将Cas9蛋白和sgRNA组分组合以形成用于电穿孔的RNP复合物。在室温下解冻Cas9蛋白和sgRNA；以5:1的质量比混合Cas9蛋白和sgRNA，共计12μL。敲入体系额外加入 6.3μLResuspension Buffer R or T；将复合物在37℃放置5min，得到Cas9-sgRNA，4℃保存至使用。
实施例2基因编辑法夫酵母的构建
将实施例1获得的Cas9-sgRNA电击转化法夫酵母，在22℃复苏2.5h，涂布于抗性平板上，于37℃培养筛选转化子。从转化子中提取质粒，利用PCR进行验证，从而获得编辑crtYB基因的法夫酵母菌株。
电转化具体步骤如下：
感受态法夫酵母的制备：
(1)从法夫酵母原始菌株MVP14的YPD固体培养基平板上挑取单个菌落，接种于YPD液体液体培养基中，22℃，200rpm震荡培养48h；
(2)以10％的接种量接种至YPD液体培养基中，22℃，200rpm震荡培养24h；
(3)取5mL菌液于无菌离心管中，4℃，5000rpm离心弃上清收集菌体细胞；
(4)加入20mL磷酸钾缓冲液(含DTT)重悬菌体细胞，22℃，200rpm震荡30min；
(5)4℃，5000rpm离心弃上清收集菌体细胞；
(6)STM(蔗糖-Tris-MgCl2)溶液重悬细胞沉淀，4℃，5000rpm离心弃上清，收集菌体细胞；重复操作一次；
(7)STM溶液重悬细胞，轻旋混匀，置于冰上，当天使用。
法夫酵母的电转化：
(1)取感受态法夫酵母菌，与Cas9-gRNA重组质粒以及Cas9-sgRNA混合物混合，移至电击杯中冰浴；
(2)电击杯外壁水汽用吸水纸擦干后，置于基因导入仪电转槽，以1.8-2.5kV的电压进行电转化；
(3)加入STM溶液与菌液混合均匀，将混合物移到无菌离心管中；于22℃静置孵育2.5h；
(4)取适量转化后的法夫酵母菌株涂布于YPD固体培养基平板(含5-FOA和尿苷)上，于22℃恒温培养进行筛选；
基因编辑后的各株法夫酵母提取总DNA，送至测序公司测序，可以检测到明显的基因序列变化(图2)，证明基因编辑成功。
实施例3利用法夫酵母及其基因工程菌发酵生产虾青素
将法夫酵母MVP14出发菌株和实施例2获得的工程菌接种于液体种子培养基中，22℃， 200rpm培养4-5d，制备种子培养液。以体积比10％的接种量接种于发酵培养基中，22℃， 200rpm培养，进行发酵生产虾青素。依据各菌株生长情况不同，测定5～10d内的虾青素产量。
其中，法夫酵母虾青素提取方法：
(1)准确移取1mL发酵液于干净的5mL离心管中，10 000rpm/min，离心5min，弃去上清液；
(2)沉淀以去离子水重悬洗涤两次后，向菌体中加入1mL预热的二甲亚砜(60℃)，充分摇匀后，于50℃水浴锅中加热破壁5min；
(3)向离心管中加入2mL无水乙醇，避光静置萃取15min后于10 000rpm/min离心5min；
(4)将上清液转移到15mL的离心管中，所得沉淀菌体再重复上述萃取步骤，直到沉淀物为白色为止；
(5)将所有上清液收集在一起，准备进行液相色谱测定。
虾青素测定方法：用注射器吸取1mL待测样品，通过0.22μm有机滤膜过滤后，即可进行高效液相色谱分析。
液相色谱条件：选用C18色谱柱。流动相为超纯水和甲醇。流动梯度为：0～40min时，水为15％，甲醇为85％；40～45min时，甲醇为100％。流速为0.2μL/min。
结果如表3所示，本申请构建的法夫酵母菌株的虾青素产量下降了82.5％-100％(表3)。
表3各菌株发酵后虾青素产量
综上，根据本发明的实施例，经过PCR和测序，表明通过基因编辑会导致目标基因发生部分序列缺失和移码突变，最终完成基因敲除，编辑效率在7.5％。本发明成功构建了法夫酵母的基因编辑CRISPR Cas9体系，编辑后得到的各株法夫酵母的虾青素产量下降了82.5％-100％，测序结果也检测到了crtYB基因明显的变化。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
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