一种构建重组解脂耶氏酵母的方法与应用
阅读说明：本技术 一种构建重组解脂耶氏酵母的方法与应用 (Method for constructing recombinant yarrowia lipolytica and application ) 是由 戴宗杰 梁配新 李静 王钦宏 于 2021-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高解脂耶氏酵母温度耐受性或提高高温条件下解脂耶氏酵母的赤藓糖醇产量的方法,包括如下步骤：将高温耐受性基因在受体解脂耶氏酵母中过表达,得到对高温耐受性或赤藓糖醇产量高于所述受体解脂耶氏酵母的目的解脂耶氏酵母。本发明通过NCBI、PDB等数据库对酿酒酵母和嗜热微生物耐热基因信息进行挖掘整理,将不同功能的基因作为候选元件,密码子优化后构建质粒表达载体,转化到解脂耶氏酵母工业菌株中,筛选重组子表达菌株,通过发酵评价,获得可以在35℃条件下提高其赤藓糖醇产量的不同功能的耐热基因Yap1、Hsp12、Vma2、Hul5、Tsa1和Groes。(The invention discloses a method for improving the temperature tolerance of yarrowia lipolytica or the erythritol yield of yarrowia lipolytica under high temperature conditions, which comprises the following steps: and (3) overexpressing the high-temperature tolerance gene in the receptor yarrowia lipolytica to obtain the target yarrowia lipolytica with higher high-temperature tolerance or erythritol yield than the receptor yarrowia lipolytica. The invention excavates and sorts heat-resistant gene information of saccharomyces cerevisiae and thermophilic microorganisms through databases such as NCBI, PDB and the like, takes genes with different functions as candidate elements, constructs plasmid expression vectors after codon optimization, transforms the plasmid expression vectors into yarrowia lipolytica industrial strains, screens recombinant expression strains, and obtains heat-resistant genes Yap1, Hsp12, Vma2, Hul5, Tsa1 and Groes with different functions, which can improve the yield of erythritol at 35 ℃ through fermentation evaluation.)
技术领域
本发明涉及生物
技术领域
中一种构建重组解脂耶氏酵母的方法与应用。背景技术
赤藓糖醇(1,2,3,4-丁四醇)是一种四碳功能糖醇，广泛分布于水果，发酵食品和动物中。由于其在机体内的代谢能量较低，可防治牙齿龋变，以及低胰岛素代谢响应等，是低热量甜味剂，因此被广泛应用于食品、医药和化工等领域。赤藓糖醇的市场发展空间巨大，应用前景十分广阔。尽管水果、海带等食物中广泛含有赤藓糖醇，但利用嗜高渗或耐高渗酵母生物发酵生产赤藓糖醇是主要的生产方式。目前，解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)已经实现了规模化赤藓糖醇发酵生产，取得了较好的经济效益。但利用该菌株生产赤藓糖醇的发酵温度一般是30℃，这样的发酵温度在夏天等温度较高的季节生产时需要进行循环冷却处理，从而增加生产成本，甚至导致工厂停产，严重影响企业的生产经营和经济效益。因此，提高解脂耶氏酵母的温度耐受性，增加生产周期，提高经济效益迫在眉睫。
传统的诱变耗时耗力，菌株遗传稳定性差，且通常以降低产物产量为代价，因此不适合构建工业微生物菌种。随着酿酒酵母在高温胁迫下应答和防御机制的阐明及嗜热菌来源耐热元件的表征，为理性育种耐高温酵母提供了新靶点。例如，研究者发现泛素连接酶Rsp5和泛素结合酶的过表达导致在较高的温度(39℃)下改善多重胁迫耐受性；热应激还会引起ROS损伤，而通过敲除糖基磷脂酰肌醇固定的膜蛋白编码基因DFG5可以提高酵母的耐热性。Liu等通过引入来自腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobactertengcongensis)的耐热元件，使酿酒酵母在42℃条件下的细胞活力明显高于对照菌株。Zhou等通过异源表达来自凝结芽孢杆菌(Baciluscoagulans)2-6的冷激蛋白cspL，大大增强了大肠杆菌和酿酒酵母(在36℃时生物量增加了2.6倍)的高温生长。Wang等通过在解脂耶氏酵母中单独过表达Rsp5基因使其在33℃条件下保持高产赤藓糖醇的特性。
解脂耶氏酵母细胞在高温胁迫下，细胞内的功能蛋白可能会发生热变性、错误折叠及聚集等；细胞内的pH稳态可能会失衡；细胞内结构可能会受到氧化损伤；核酸可能会降解或突变。因此，针对高温胁迫对其造成的影响，挖掘具有相应保护功能的元件，对提高解脂耶氏酵母在高温下高产赤藓糖醇的能力具有非常重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高解脂耶氏酵母温度耐受性，如何提高高温条件下解脂耶氏酵母的赤藓糖醇产量。
为了解决以上技术问题，本发明的第一个目的是提供了构建重组解脂耶氏酵母的方法，包括将高温耐受性基因导入解脂耶氏酵母，得到所述重组解脂耶氏酵母；所述高温耐受性基因下述基因中的至少一种：Groes基因、Hsp12基因、Tsa1基因、Hul5基因、Vma2基因和Yap1基因；
所述Groes基因编码如下A1)-A3)中任一种蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中序列12的蛋白质，
A2)将A1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述Hsp12基因编码如下B1)-B3)中任一种蛋白质：
B1)氨基酸序列是序列表中序列8的蛋白质，
B2)将B1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
B3)在B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述Tsa1基因编码如下C1)-C3)中任一种蛋白质：
C1)氨基酸序列是序列表中序列11的蛋白质，
C2)将C1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
C3)在C1)或C2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述Hul5基因编码如下D1)-D3)中任一种蛋白质：
D1)氨基酸序列是序列表中序列10的蛋白质，
D2)将D1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
D3)在D1)或D2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述Vma2基因编码如下E1)-E3)中任一种蛋白质：
E1)氨基酸序列是序列表中序列9的蛋白质，
E2)将E1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
E3)在E1)或E2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述Yap1基因编码如下F1)-F3)中任一种蛋白质：
F1)氨基酸序列是序列表中序列7的蛋白质，
F2)将F1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
F3)在F1)或F2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
所述高温为31℃-40℃，具体可为35℃。
其中，序列表中的序列7由650个氨基酸残基组成，序列表中的序列8由109个氨基酸残基组成，序列表中的序列9由517个氨基酸残基组成，序列表中的序列10由910个氨基酸残基组成，序列表中的序列11由196个氨基酸残基组成，序列表中的序列12由101个氨基酸残基组成。
上述方法中，所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述方法中，所述蛋白质可来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或嗜热菌(Thermus thermophilus)。
上述方法中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述方法中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述方法中，所述80％以上的同一性可为至少80％、85％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述方法中，所述Groes基因为如下a1)或a2)所示的基因：
a1)编码链的编码序列(CDS)是序列表中序列6的cDNA分子或DNA分子，
a2)编码链的核苷酸是序列表中序列6的cDNA分子或DNA分子；
所述Hsp12基因为如下b1)或b2)所示的基因：
b1)编码链的编码序列(CDS)是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子，
b2)编码链的核苷酸是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
所述Tsa1基因为如下c1)或c2)所示的基因：
c1)编码链的编码序列(CDS)是序列表中序列5的cDNA分子或DNA分子，
c2)编码链的核苷酸是序列表中序列5的cDNA分子或DNA分子；
所述Hul5基因为如下d1)或d2)所示的基因：
d1)编码链的编码序列(CDS)是序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子，
d2)编码链的核苷酸是序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子；
所述Vma2基因为如下e1)或e2)所示的基因：
e1)编码链的编码序列(CDS)是序列表中序列3的cDNA分子或DNA分子，
e2)编码链的核苷酸是序列表中序列3的cDNA分子或DNA分子；
所述Yap1基因为如下f1)或f2)所示的基因：
f1)编码链的编码序列(CDS)是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子，
f2)编码链的核苷酸是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子。
其中，序列表中的序列1由1953个核苷酸组成，编码序列表中的序列7所示的蛋白质；序列表中的序列2由330个核苷酸组成，编码序列表中的序列8所示的蛋白质；序列表中的序列3由1554个核苷酸组成，编码序列表中的序列9所示的蛋白质；序列表中的序列4由2733个核苷酸组成，编码序列表中的序列10所示的蛋白质；序列表中的序列5由591个核苷酸组成，编码序列表中的序列11所示的蛋白质；序列表中的序列6由306个核苷酸组成，编码序列表中的序列12所示的蛋白质。
上述方法中，所述重组解脂耶氏酵母在高温条件下的赤藓糖醇产量高于所述解脂耶氏酵母。所述高温为31℃-40℃，具体可为35℃。
本发明第二个目的是保护以上述方法构建的重组解脂耶氏酵母。
本发明第三个目的是保护高温耐受性基因在提高高温条件下解脂耶氏酵母的赤藓糖醇产量中的应用或在提高解脂耶氏酵母高温耐受性中的应用，所述高温耐受性基因下述基因中的至少一种：Groes基因、Hsp12基因、Tsa1基因、Hul5基因、Vma2基因和Yap1基因；
所述Groes基因编码如下A1)-A3)中任一种蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中序列12的蛋白质，
A2)将A1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述Hsp12基因编码如下B1)-B3)中任一种蛋白质：
B1)氨基酸序列是序列表中序列8的蛋白质，
B2)将B1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
B3)在B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述Tsa1基因编码如下C1)-C3)中任一种蛋白质：
C1)氨基酸序列是序列表中序列11的蛋白质，
C2)将C1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
C3)在C1)或C2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述Hul5基因编码如下D1)-D3)中任一种蛋白质：
D1)氨基酸序列是序列表中序列10的蛋白质，
D2)将D1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
D3)在D1)或D2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述Vma2基因编码如下E1)-E3)中任一种蛋白质：
E1)氨基酸序列是序列表中序列9的蛋白质，
E2)将E1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
E3)在E1)或E2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述Yap1基因编码如下F1)-F3)中任一种蛋白质：
F1)氨基酸序列是序列表中序列7的蛋白质，
F2)将F1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
F3)在F1)或F2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
本发明还保护高温耐受性基因在构建耐高温重组解脂耶氏酵母中的应用，所述高温耐受性基因下述基因中的至少一种：Groes基因、Hsp12基因、Tsa1基因、Hul5基因、Vma2基因和Yap1基因；
所述Groes基因编码如下A1)-A3)中任一种蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中序列12的蛋白质，
A2)将A1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述Hsp12基因编码如下B1)-B3)中任一种蛋白质：
B1)氨基酸序列是序列表中序列8的蛋白质，
B2)将B1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
B3)在B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述Tsa1基因编码如下C1)-C3)中任一种蛋白质：
C1)氨基酸序列是序列表中序列11的蛋白质，
C2)将C1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
C3)在C1)或C2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述Hul5基因编码如下D1)-D3)中任一种蛋白质：
D1)氨基酸序列是序列表中序列10的蛋白质，
D2)将D1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
D3)在D1)或D2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述Vma2基因编码如下E1)-E3)中任一种蛋白质：
E1)氨基酸序列是序列表中序列9的蛋白质，
E2)将E1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
E3)在E1)或E2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述Yap1基因编码如下F1)-F3)中任一种蛋白质：
F1)氨基酸序列是序列表中序列7的蛋白质，
F2)将F1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，
F3)在F1)或F2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
上述应用中，所述高温为31℃-40℃，具体可为35℃。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述方法或上述重组解脂耶氏酵母在赤藓糖醇生产中的应用。所述赤藓糖醇生产为在高温条件下生产赤藓糖醇，所述高温为31℃-40℃，具体可为35℃。
本发明所提供的试剂含有促进解脂耶氏酵母中上述高温耐受性基因表达的物质。
上述试剂的活性成分可为促进解脂耶氏酵母中高温耐受性基因表达的物质，上述试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述试剂的其他活性成分本领域技术人员可根据提高解脂耶氏酵母高温耐受性或赤藓糖醇产量的效果确定。
本发明还保护上述方法或试剂在赤藓糖醇生产中的应用。
本发明通过NCBI、PDB等数据库对已完成测序的酿酒酵母和嗜热微生物及其耐热基因信息进行挖掘整理，结合已有文献报道效果明显的不同功能的基因作为候选元件。密码子优化后构建质粒表达载体，转化到解脂耶氏酵母菌株中，筛选重组子表达菌株。通过发酵评价，获得可以在35℃条件下提高其赤藓糖醇产量的不同功能的耐热基因Yap1、Hsp12、Vma2、Hul5、Tsa1和Groes。相比于转入空质粒的对照菌株，质粒型表达耐热基因Yap1、Hsp12、Vma2、Hul5、Tsa1或Groes的菌株在35℃条件下的生长有所改善，赤藓糖醇产量也有明显增加。
保藏说明
菌种名称：解脂耶氏酵母
拉丁名：Yarrowialipolytica
菌株编号：ERY01
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2021年7月27日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.22966
附图说明
图1为本发明实施例1中35℃条件下，发酵72h时各菌株的生长情况。
图2为本发明实施例1中35℃条件下，发酵72h时各菌株的赤藓糖醇产量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
1菌株
下述实施例中的酿酒酵母BY4741记载于非专利文献“Zhang G,Lin Y,Qi X,Li L,Wang Q,Ma Y.TALENs-assisted multiplex editing for accelerated genomeevolution to improve yeast phenotypes.ACS Synth Biol.2015；4(10):1101–11”，公众可以从中国科学院天津工业生物技术研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的Yarrowialipolyticastrain W29(CLIB89)为ARS CultureCollection(NRRL)产品。
下述实施例中的解脂耶氏酵母工业菌株ERY01已保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号：CGMCC No.22966，分类名：解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)，保藏日期：2021年7月27日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2培养基
种子液培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：葡萄糖20％(w/v：g/mL)，酵母膏1％，磷酸二氢钾0.1％，柠檬酸铵0.5％，七水硫酸镁0.05％，诺尔斯菌素800mg/L。
发酵培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：食品级葡萄糖(一个结晶水)337.5g/L，酵母浸膏8.6g/L，玉米浆6.1g/L，硫酸镁(七个结晶水)0.173g/L，磷酸氢二铵3.07g/L，VB10.0086 g/L，硫酸锰(一个结晶水)0.013g/L，硫酸铜(无水)0.002g/L，谷氨酸钠0.0173g/L，诺尔斯菌素800mg/L。
下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
实施例1
本发明实现目的技术路线如下：
(1)对已有文献报道、生物信息数据库中有基因序列的酿酒酵母来源及嗜热微生物来源的耐热基因进行检索，获得耐热元件库。
通过NCBI、PDB等数据库对已完成测序的酿酒酵母和嗜热微生物及其耐热基因信息进行挖掘整理，结合已有文献报道中效果明显的不同功能的基因作为候选元件组成耐热元件库。
(2)对耐热元件库中的基因按照来源及功能进行分类，筛选来自不同物种具有不同功能的耐热基因作为候选基因。
将步骤(1)耐热元件库中的基因按照功能进行分类，得到耐热基因类型具体见表1：
表1不同功能耐热基因信息
(3)对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)来源的候选基因以酿酒酵母BY4741基因组为模板进行PCR扩增；对嗜热菌(Thermusthermophilus)来源的候选基因按照解脂耶氏酵母进行密码子优化合成。
对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)来源的候选基因Yap1、Hsp12、Vma2、Hul5和Tsa1，以酿酒酵母BY4741基因组为模板进行PCR扩增，所用引物具体如下：
以引物对Yap1-F/Yap1-R扩增Yap1基因片段(核苷酸序列如序列表序列1的第1至第1953位所示)：
Yap1-F：5′-GACATATCTACAGCAATGAGTGTGTCTACCGCCAA-3′(带下划线的核苷酸为与质粒pTIB完全匹配的同源序列)；
Yap1-R：5′-ACCGGCAACGTGGGGTTAGTTCATATGCTTATTCA-3′(带下划线的核苷酸为与质粒pTIB完全匹配的同源序列)。
以引物对Hsp12-F/Hsp12-R扩增Hsp12基因片段(核苷酸序列如序列表序列2的第1至第330位所示)：
Hsp12-F：5′-GACATATCTACAGCAATGTCTGACGCAGGTAGAAA-3′(带下划线的核苷酸为与质粒pTIB完全匹配的同源序列)；
Hsp12-R：5′-ACCGGCAACGTGGGGTTACTTCTTGGTTGGGTCTT-3′(带下划线的核苷酸为与质粒pTIB完全匹配的同源序列)。
以引物对Vma2-F/Vma2-R扩增Vma2基因片段(核苷酸序列如序列表序列3的第1至第1554位所示)：
Vma2-F：5′-GACATATCTACAGCAATGGTTTTGTCTGATAAGGA-3′(带下划线的核苷酸为与质粒pTIB完全匹配的同源序列)；
Vma2-R：5′-ACCGGCAACGTGGGGTTAGATTAGAGATTCTTCTT-3′(带下划线的核苷酸为与质粒pTIB完全匹配的同源序列)。
以引物对Hul5-F/Hul5-R扩增Hul5基因片段(核苷酸序列如序列表序列4的第1至第2733位所示)：
Hul5-F：5′-GACATATCTACAGCAATGTTAAACTTCACCGGTCA-3′(带下划线的核苷酸为与质粒pTIB完全匹配的同源序列)；
Hul5-R：5′-ACCGGCAACGTGGGGTTATGATAAGTCAAACCTGG-3′(带下划线的核苷酸为与质粒pTIB完全匹配的同源序列)。
以引物对Tsa1-F/Tsa1-R扩增Tsa1基因片段(核苷酸序列如序列表序列5的第1至第591位所示)：
Tsa1-F：5′-GACATATCTACAGCAATGGTCGCTCAAGTTCAAAA-3′(带下划线的核苷酸为与质粒pTIB完全匹配的同源序列)；
Tsa1-R：5′-ACCGGCAACGTGGGGTTATTTGTTGGCAGCTTCGA-3′(带下划线的核苷酸为与质粒pTIB完全匹配的同源序列)。
对嗜热菌(Thermusthermophilus)的候选基因Groes交由公司按照解脂耶氏酵母基因组进行密码子优化合成，合成了Groes基因片段，其核苷酸序列如序列表序列6的第1至第306位所示。
(4)过表达载体pTIB的构建：
以商业化质粒pUC57为模板，利用引物primer17/primer18扩增原核生物复制起始位点及氨苄抗生素基因表达盒片段，命名为ori-Amp：
Primer 17：ATCAATGGGCCTTGGTTTCCATAGGCTCCGCCCCC(带下划线的核苷酸为与ChrE1-DOWN完全匹配的同源序列)
Primer 18：CGCCCAAAATGCCAGCGCGGAACCCCTATTTGTTT(带下划线的核苷酸为与pXPR2完全匹配的同源序列)
以Yarrowialipolyticastrain W29(CLIB89)基因组为模板，利用引物primer1/primer2扩增基因XPR2的启动子，命名为pXPR2：
Primer 1：AATAGGGGTTCCGCGCTGGCATTTTGGGCGTTTTC(带下划线的核苷酸为与ori-Amp完全匹配的同源序列)
Primer 2：CAAAGTAGTACCCATTGTTGGATTGGAGGATTGGA(带下划线的核苷酸为与Nat完全匹配的同源序列)
在NCBI查找诺尔斯菌素抗性基因氨基酸序列(来源于Cloning vectorpNZ11)，交由金唯智公司按照解脂耶氏酵母的密码子进行优化后合成，利用引物primer3/primer4扩增诺尔斯菌素抗性基因，命名为Nat：
Primer 3：TCCTCCAATCCAACAATGGGTACTACTTTGGATGA(带下划线的核苷酸为与pXPR2完全匹配的同源序列)
Primer 4：GATTCCGAACAGAAGTCATGGACATGGCATAGACA(带下划线的核苷酸为与Tlip2完全匹配的同源序列)
以ERY01基因组为模板，利用引物primer5/primer6扩增基因lip2的终止子，命名为Tlip2：Primer 5：ATGCCATGTCCATGACTTCTGTTCGGAATCAACCT(带下划线的核苷酸为与Nat完全匹配的同源序列)
Primer 6：TCCATTATCTACGAACAGATGCATTCTTGGGCGGT(带下划线的核苷酸为与CEN1完全匹配的同源序列)
以Yarrowia lipolytica strain W29(CLIB89)基因组为模板，利用引物primer7/primer8扩增真核生物复制起始位点，命名为CEN1：
Primer 7：CCAAGAATGCATCTGTTCGTAGATAATGGAATACA(带下划线的核苷酸为与Tlip2完全匹配的同源序列)
Primer 8：TTCGGGGTCTGCCAGCATCAAATTTAGGGATGCCA(带下划线的核苷酸为与ChrE1-UP完全匹配的同源序列)
以ERY01基因组为模板，利用引物primer9/primer10扩增基因插入位点ChrE1的上游同源臂500bp序列片段，命名为ChrE1-UP：
Primer 9：TCCCTAAATTTGATGCTGGCAGACCCCGAAACCTA(带下划线的核苷酸为与CEN1完全匹配的同源序列)
Primer 10：GGCGCCAAACTCCTTACAACAGCCAGTCCTCCACG(带下划线的核苷酸为与pExp1完全匹配的同源序列)
以Yarrowia lipolytica strain W29(CLIB89)基因组为模板，利用引物primer11/primer12扩增启动子pExp1片段，命名为pExp1：
Primer 11：AGGACTGGCTGTTGTAAGGAGTTTGGCGCCCGTTT(带下划线的核苷酸为与ChrE1-UP完全匹配的同源序列)
Primer 12：ACCGGCAACGTGGGGGCGATCGCTGCTGTAGATATGTCTTGTG(带下划线的核苷酸为与TTef完全匹配的同源序列)
以Yarrowia lipolytica strain W29(CLIB89)基因组为模板，利用引物primer13/primer14扩增终止子TTef片段，命名为TTef：
Primer 13：TACAGCAGCGATCGCCCCCACGTTGCCGGTCTTGC(带下划线的核苷酸为与pExp1完全匹配的同源序列)
Primer 14：GGTGTCCGAGCGTCGGAATTCGGACACGGGCATCT(带下划线的核苷酸为与ChrE1-DOWN完全匹配的同源序列)
以ERY01基因组为模板，利用引物primer15/primer16扩增基因插入位点ChrE1的下游同源臂500bp序列片段，命名为ChrE1-DOWN：
Primer 15：CCCGTGTCCGAATTCCGACGCTCGGACACCTCTGG(带下划线的核苷酸为与TTef完全匹配的同源序列)
Primer 16：CGGAGCCTATGGAAACCAAGGCCCATTGATTGAGA(带下划线的核苷酸为与ori-Amp完全匹配的同源序列)
将扩增得到的ori-Amp与pXPR2通过融合PCR进行融合，得到片段ori-Amp-pXPR2；Tlip2与CEN1通过融合PCR进行融合，得到片段Tlip2-CEN1；Nat与Tlip2-CEN1通过融合PCR进行融合，得到片段Nat-Tlip2-CEN1；ori-Amp-pXPR2与Nat-Tlip2-CEN1通过融合PCR进行融合，得到片段ori-Amp-pXPR2-Nat-Tlip2-CEN1；ChrE1-UP与pExp1通过融合PCR进行融合，得到片段ChrE1-UP-pExp1；TTef与ChrE1-DOWN通过融合PCR进行融合，得到片段TTef-ChrE1-DOWN；利用Trelief SoSoo Cloning Kit Ver.2试剂盒将片段ori-Amp-pXPR2-Nat-Tlip2-CEN1、ChrE1-UP-pExp1和TTef-ChrE1-DOWN进行组装，经测序得到正确的过表达载体pTIB(核苷酸序列如序列表中序列13所示，其中第1-1752位为pXPR2启动子序列，第1753-2325位为Nat序列，第2326-3262位为Tlip2序列，第3263-3481位为CEN1序列，第3482-3966位为ChrE1-UP序列，第3967-4967位为pExp1序列，第4968-4975位为AsiSI酶识别位点，第4976-5385位为TTef序列，第5386-5885位为ChrE1-DOWN序列，第5886-7610位为ori-Amp序列)。
(5)将耐热基因片段与过表达载体pTIB相连，得到重组表达载体。
将步骤(3)PCR扩增获得的各个耐热基因片段连接到用限制性内切酶AsiSI酶切过的载体pTIB上，经测序得到正确的重组载体，具体如下：
将Yap1基因片段(核苷酸序列如序列表序列1的第1至第1953位所示)连接到用限制性内切酶AsiSI酶切过的体pTIB上，得到Yap1蛋白的重组表达载体，命名为pTIB-Yap1。pTIB-Yap1含有编码序列(CDS)是序列表中序列1的第1至第1953位所示的Yap1基因，由启动子pExp1启动Yap1基因转录。
将Hsp12基因片段(核苷酸序列如序列表序列2的第1至第330位所示)连接到用限制性内切酶AsiSI酶切过的体pTIB上，得到Hsp12蛋白的重组表达载体，命名为pTIB-Hsp12。pTIB-Hsp12含有编码序列(CDS)是序列表中序列2的第1至第330位所示的Hsp12基因，由启动子pExp1启动Hsp12基因转录。
将Vma2基因片段(核苷酸序列如序列表序列3的第1至第1554位所示)连接到用限制性内切酶AsiSI酶切过的体pTIB上，得到Vma2蛋白的重组表达载体，命名为pTIB-Vma2。pTIB-Vma2含有编码序列(CDS)是序列表中序列3的第1至第1554位所示的Vma2基因，由启动子pExp1启动Vma2基因转录。
将Hul5基因片段(核苷酸序列如序列表序列4的第1至第2733位所示)连接到用限制性内切酶AsiSI酶切过的体pTIB上，得到Hul5蛋白的重组表达载体，命名为pTIB-Hul5。pTIB-Hul5含有编码序列(CDS)是序列表中序列4的第1至第2733位所示的Hul5基因，由启动子pExp1启动Hul5基因转录。
将Tsa1基因片段(核苷酸序列如序列表序列5的第1至第591位所示)连接到用限制性内切酶AsiSI酶切过的体pTIB上，得到Tsa1蛋白的重组表达载体，命名为pTIB-Tsa1。pTIB-Tsa1含有编码序列(CDS)是序列表中序列5的第1至第591位所示的Tsa1基因，由启动子pExp1启动Tsa1基因转录。
将步骤(3)合成的Groes基因片段直接连到pTIB的AsiSI酶切位点处，保持pTIB载体的其它序列不变，得到Groes蛋白的重组表达载体，命名为pTIB-Groes。pTIB-Groes含有编码序列(CDS)是序列表中序列6的第1至第306位所示的Groes基因，由启动子pExp1启动Groes基因转录。
(5)将重组载体转化至高产赤藓糖醇的解脂耶氏酵母工业菌株ERY01中，得到重组菌株。
将上述步骤(4)获得的重组载体(pTIB-Yap1，pTIB-Hsp12，pTIB-Vma2，pTIB-Hul5，pTIB-Tsa1和pTIB-Groes，以空质粒pTIB为对照)分别转化至高产赤藓糖醇的解脂耶氏酵母工业菌株ERY01中，经测序得到正确转化的重组菌株，具体操作步骤如下：
制备感受态细胞：
将出发菌株ERY01在YPD平板划线后置于30℃培养箱培养24h；培养后的菌株再次划线YPD平板后置于30℃培养箱培养24h；将培养的细胞刮下来后重悬于1mL无菌水中，3000g离心5min去除上清，此步骤重复两次；用1mL无菌水重悬细胞，并测定OD600；取出OD值9.2的菌置于新的无菌离心管中，3000g离心5min去除上清，得到ERY01感受态细胞，用于一次转化。
转化过程：
1)取500ng质粒(分别为pTIB-Yap1，pTIB-Hsp12，pTIB-Vma2，pTIB-Hul5，pTIB-Tsa1、pTIB-Groes和空质粒pTIB)加入ERY01感受态细胞；
2)用转化液混合物重悬细胞：
表2
成分
含量
PEG(Stock50％；sterile-filtrated；end43.8％)
87.5μl
LiAc(Stock2M；sterile-filtrated；end0.1M)
5.0μl
ssDNA(Stock10mg/ml；end0.25g/l)
2.5μl
DTT(stock2M；sterile-filtrated；end100mM)
5.0μl
3)39℃孵育1h；
4)3000g离心5min中后去上清，加入500μl的YPD培养基重悬后置于30℃摇床培养2h；
5)3000g离心5min中后去上清，用100μl的无菌水重悬后涂布于含有诺尔斯菌素(800mg/L)的YPD平板上，置于30℃培养。
按照上述操作步骤，将重组载体pTIB-Yap1转化至高产赤藓糖醇的解脂耶氏酵母工业菌株ERY01中，经测序得到含有pTIB-Yap1的重组解脂耶氏酵母菌株，命名为ERY01pTIB-Yap1。
按照上述操作步骤，将重组载体pTIB-Hsp12转化至高产赤藓糖醇的解脂耶氏酵母工业菌株ERY01中，经测序得到含有pTIB-Hsp12的重组解脂耶氏酵母菌株，命名为ERY01pTIB-Hsp12。
按照上述操作步骤，将重组载体pTIB-Vma2转化至高产赤藓糖醇的解脂耶氏酵母工业菌株ERY01中，经测序得到含有pTIB-Vma2的重组解脂耶氏酵母菌株，命名为ERY01pTIB-Vma2。
按照上述操作步骤，将重组载体pTIB-Hul5转化至高产赤藓糖醇的解脂耶氏酵母工业菌株ERY01中，经测序得到含有pTIB-Hul5的重组解脂耶氏酵母菌株，命名为ERY01pTIB-Hul5。
按照上述操作步骤，将重组载体pTIB-Tsa1转化至高产赤藓糖醇的解脂耶氏酵母工业菌株ERY01中，经测序得到含有pTIB-Tsa1的重组解脂耶氏酵母菌株，命名为ERY01pTIB-Tsa1。
按照上述操作步骤，将重组载体pTIB-Groes转化至高产赤藓糖醇的解脂耶氏酵母工业菌株ERY01中，经测序得到含有pTIB-Groes的重组解脂耶氏酵母菌株，命名为ERY01pTIB-Groes。
按照上述操作步骤，将空质粒pTIB转化至高产赤藓糖醇的解脂耶氏酵母工业菌株ERY01中，经测序得到含有pTIB的重组解脂耶氏酵母菌株，命名为ERY01pTIB。
(6)将各株重组菌株在35℃条件下进行发酵培养，通过分光光度计测定细胞的生长情况；通过HPLC测定赤藓糖醇的产量。
将上述重组解脂耶氏酵母菌株(ERY01pTIB-Yap1，ERY01pTIB-Hsp12，ERY01pTIB-Vma2，ERY01pTIB-Hul5，ERY01pTIB-Tsa1，ERY01pTIB-Groes，ERY01pTIB)分别划线含有诺尔斯菌素的YPD平板培养，待长起后挑单克隆到种子液培养基进行培养。培养温度为30℃，培养36小时，得到种子液。
将种子液转接至发酵培养基至初始OD600为0.1，在35℃进行培养72h，，收集发酵液。每个菌株进行3个平行实验。
将发酵液稀释后进行OD600测定，同时利用HPLC进行赤藓糖醇含量的测定。HPLC中，以赤藓糖醇(北京索莱宝科技有限公司，产品CAS号149-32-6)为标准品根据标准品的保留时间定性，采用标准曲线法(外标法)进行定量分析赤藓糖醇。HPLC检测条件：HPLC(HPX-87H色谱柱，300mm×7.8mm，Bio-Rad，Hercules，CA，USA)，柱温55℃，流动相为0.008M硫酸溶液，流速为0.6m L/min，进样量为5μL。
采用Excel软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示。
测定结果如图1、图2所示。相比于转入空质粒pTIB的对照菌株ERY01pTIB，所有重组质粒型表达耐热基因的菌株(ERY01pTIB-Yap1，ERY01pTIB-Hsp12，ERY01pTIB-Vma2，ERY01pTIB-Hul5，ERY01pTIB-Tsa1，ERY01pTIB-Groes)在35℃条件下的生长均有所改善，赤藓糖醇产量也有明显增加。其中，ERY01pTIB-Groes的赤藓糖醇产量最高，为31.6±0.6g赤藓糖醇/L发酵液；ERY01pTIB-Yap1的赤藓糖醇产量为14.2±0.3g赤藓糖醇/L发酵液；ERY01pTIB-Hsp12的赤藓糖醇产量为22±1.4g赤藓糖醇/L发酵液；ERY01pTIB-Vma2的赤藓糖醇产量为19.8±0.7g赤藓糖醇/L发酵液；ERY01pTIB-Hul5的赤藓糖醇产量为20.3±1.5g赤藓糖醇/L发酵液；ERY01pTIB-Tsa1的赤藓糖醇产量为21.3±1.1g赤藓糖醇/L发酵液；ERY01pTIB的赤藓糖醇产量为11±0.9g赤藓糖醇/L发酵液。
(7)筛选得到能使解脂耶氏酵母工业菌株在35℃条件下生长良好且高产赤藓糖醇的不同功能的耐热基因。
根据步骤(6)的结果，筛选得到能使解脂耶氏酵母工业菌株在35℃条件下生长良好且高产赤藓糖醇的不同功能的耐热基因Yap1、Hsp12、Vma2、Hul5、Tsa1和Groes。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种构建重组解脂耶氏酵母的方法与应用
<130> GNCSY212191
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1953
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
atgagtgtgt ctaccgccaa gaggtcgctg gatgtcgttt ctccgggttc attagcggag 60
tttgagggtt caaaatctcg tcacgatgaa atagaaaatg aacatagacg tactggtaca 120
cgtgatggcg aggatagcga gcaaccgaag aagaagggta gcaaaactag caaaaagcaa 180
gatttggatc ctgaaactaa gcagaagagg actgcccaaa atcgggccgc tcaaagagct 240
tttagggaac gtaaggagag gaagatgaag gaattggaga agaaggtaca aagtttagag 300
agtattcagc agcaaaatga agtggaagct acttttttga gggaccagtt aatcactctg 360
gtgaatgagt taaaaaaata tagaccagag acaagaaatg actcaaaagt gctggaatat 420
ttagcaaggc gagatcctaa tttgcatttt tcaaaaaata acgttaacca cagcaatagc 480
gagccaattg acacacccaa tgatgacata caagaaaatg ttaaacaaaa gatgaatttc 540
acgtttcaat atccgcttga taacgacaac gacaacgaca acagtaaaaa tgtggggaaa 600
caattacctt caccaaatga tccaagtcat tcggctccta tgcctataaa tcagacacaa 660
aagaaattaa gtgacgctac agattcctcc agcgctactt tggattccct ttcaaatagt 720
aacgatgttc ttaataacac accaaactcc tccacttcga tggattggtt agataatgta 780
atatatacta acaggtttgt gtcaggtgat gatggcagca atagtaaaac taagaattta 840
gacagtaata tgttttctaa tgactttaat tttgaaaacc aatttgatga acaagtttcg 900
gagttttgtt cgaaaatgaa ccaggtatgt ggaacaaggc aatgtcccat tcccaagaaa 960
cccatctcgg ctcttgataa agaagttttc gcgtcatctt ctatactaag ttcaaattct 1020
cctgctttaa caaatacttg ggaatcacat tctaatatta cagataatac tcctgctaat 1080
gtcattgcta ctgatgctac taaatatgaa aattccttct ccggttttgg ccgacttggt 1140
ttcgatatga gtgccaatca ttacgtcgtg aatgataata gcactggtag cactgatagc 1200
actggtagca ctggcaataa gaacaaaaag aacaataata atagcgatga tgtactccca 1260
ttcatatccg agtcaccgtt tgatatgaac caagttacta atttttttag tccgggatct 1320
accggcatcg gcaataatgc tgcctctaac accaatccca gcctactgca aagcagcaaa 1380
gaggatatac cttttatcaa cgcaaatctg gctttcccag acgacaattc aactaatatt 1440
caattacaac ctttctctga atctcaatct caaaataagt ttgactacga catgtttttt 1500
agagattcat cgaaggaagg taacaattta tttggagagt ttttagagga tgacgatgat 1560
gacaaaaaag ccgctaatat gtcagacgat gagtcaagtt taatcaagaa ccagttaatt 1620
aacgaagaac cagagcttcc gaaacaatat ctacaatcgg taccaggaaa tgaaagcgaa 1680
atctcacaaa aaaatggcag tagtttacag aatgctgaca aaatcaataa tggcaatgat 1740
aacgataatg ataatgatgt cgttccatct aaggaaggct ctttactaag gtgttcggaa 1800
atttgggata gaataacaac acatccgaaa tactcagata ttgatgtcga tggtttatgt 1860
tccgagctaa tggcaaaggc aaaatgttca gaaagagggg ttgtcatcaa tgcagaagac 1920
gttcaattag ctttgaataa gcatatgaac taa 1953
<210> 2
<211> 330
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 2
atgtctgacg caggtagaaa aggattcggt gaaaaagctt ctgaagcttt gaagccagac 60
tctcaaaagt catacgctga acaaggtaag gaatacatca ctgacaaggc cgacaaggtc 120
gctggtaagg ttcaaccaga agacaacaag ggtgtcttcc aaggtgtcca cgactctgcc 180
gaaaaaggca aggataacgc tgaaggtcaa ggtgaatctt tggcagacca agctagagat 240
tacatgggag ccgccaagtc caagttgaac gatgccgtcg aatatgtttc cggtcgtgtc 300
cacggtgaag aagacccaac caagaagtaa 330
<210> 3
<211> 1554
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 3
atggttttgt ctgataagga gttgtttgcc ataaataaga aagccgtcga acaaggtttc 60
aatgtgaagc ctagattgaa ctataatacg gtcagtggtg tgaacggtcc attagtcatt 120
ttggaaaagg tcaagttccc acgttacaac gaaattgtta atttgacatt gccagatgga 180
accgtgagac aaggtcaagt tttggaaatt agaggagata gagccattgt gcaagtgttt 240
gaaggtacat ctggtattga tgtcaagaag actaccgtgg aattcactgg tgagagtttg 300
agaattcctg tgtctgaaga catgttgggt agaatttttg acggttctgg tagacccatt 360
gacaacggtc ctaaagtttt cgcagaggat tacttggaca ttaacggttc tcctatcaac 420
ccatatgctc gtatttatcc agaagaaatg atttctactg gtgtttctgc tattgacaca 480
atgaactcca ttgccagagg tcaaaagatc ccaattttct ccgcatcagg tttaccacac 540
aacgaaattg cagcacaaat ttgtagacag gctggtttgg tgagacctac caaggatgtt 600
catgatggtc atgaagaaaa tttctccatc gtttttgctg ccatgggtgt caacttggaa 660
accgctagat ttttcaaaca ggatttcgaa gaaaatgggt ctttggaaag aacttcatta 720
tttttgaact tggctaatga ccctaccatt gaaagaatta tcactccaag attggccttg 780
accaccgctg aataccttgc ttaccaaacg gaacgtcatg tgttgaccat cttgaccgat 840
atgtcatcgt atgctgatgc tcttagagaa gtttccgctg ctagagaaga agttccaggt 900
agaagaggtt atcctggtta catgtataca gatttgtcca caatttatga aagagcaggt 960
agagtagagg gtcgtaacgg gtccatcact caaataccta tcttgacaat gcctaacgat 1020
gatattacgc atccaattcc ggatttgacc ggttatatta ccgagggtca aatcttcgtt 1080
gaccgtcaat tacataacaa gggtatctac ccaccaatca acgtcttgcc ttcgttgagt 1140
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aaccaattgt atgccaagta cgccatcggt aaggacgctg ctgctatgaa ggccgttgtc 1260
ggtgaagagg cgttatccat cgaagataag ttatctttgg aatttttgga aaaattcgaa 1320
aagaccttta tcacacaagg cgcctacgag gacagaaccg ttttcgaaag tttggaccag 1380
gcatggagtt tgctaagaat ctaccctaag gagatgttga atagaatctc cccaaagatt 1440
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<210> 4
<211> 2733
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 4
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aattcaaaga aggatttact ggaaaaggcc aaaagggaac gtgaaaggag agcacaagat 120
aagctcaaag aagacgccag taaaaccatt caaaaaagca tcagaagaca tttttcaaat 180
gtgagactct tcaaaaacac atttactagt tcgcaacttg ttcatatgat accagcttac 240
gggggcaaat taatctatta catttctcaa tatgatctgc agcaactgct aaaattatct 300
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aagctatatc aagatgatgc actggtggct gaaactctaa gcgatcttaa catggactgc 420
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agtgcctcca ttagtatttt ttcgatatcg ataggatctt acgaaaaacg gccatttgca 600
ctacagtttt attgcatact tgccgaaaga aaccttttgc cccaacttat caacacaaat 660
ccgatattat gggataacat ggcaaagaca tattcacact gtagtaaagg tggccaaaaa 720
aatatcgcca agctactcat accaaacttc aacaatcata ttgctccatc agtcttgcgt 780
agtgataacg actatgtctt gaaattttat gaaaaggcat ttatagacga agttattgct 840
actactgcaa attacgtttc tgatgaagat cacgtgaaga atttgatgtg ctacattgca 900
agctctccca atcaaagctg taagaattct gtccttatta ccttactgtc taacaaagac 960
ttcgtgagaa ggctctcatg ggaattcttt cacactaaat tcaacgccag caagactgag 1020
gctcaccccc tgttttcagt tttggcacag cttatcgaca tgcacctttt aatatcgaca 1080
gatcgggagt tattagacta caactctgtg atacctatcg aagaactaaa gaaatttaca 1140
tccacgttaa aagattttac tttccgacaa tattgggaac tacctaaaag tgaaaggaac 1200
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aatttgagat tttacgaaga attacaggag tacgaagatc tgtatagaga acacttagaa 1380
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ttggaaatac ttttggaatt accatttttt attccttttg aagaaagggt ggacttattt 1560
tatatgttca tcgcactgga caagaagcga ttatctttag atgacgatca caacttgatc 1620
aatatgttta ccccctgggc ctccaccggt atgaggaagc aatccgctat catctctagg 1680
gataatgtct tagaagatgc tttcaacgca tttaactcta taggagaaag gttcaaagct 1740
tcattagatg ttacttttat taatgaattt ggtgaagaag ctggtattga tgggggcggc 1800
attaccaagg aatttttaac tactgtgtct gatgaaggat ttaaagatcc aaagcacgag 1860
ttatttcgga cgaatgatcg ctacgaatta tatccttctg ttgtttatga cgctacgaaa 1920
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ttattaaaat tgccagatta tagaaacaaa acaattttga gagagaaatt attatatgca 2700
ataaactcag gcgccaggtt tgacttatca taa 2733
<210> 5
<211> 591
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 5
atggtcgctc aagttcaaaa gcaagctcca acttttaaga aaactgccgt cgtcgacggt 60
gtctttgacg aagtctcctt ggacaaatac aagggtaagt acgttgtcct agcctttatt 120
ccattggcct tcactttcgt ctgtccaacc gaaatcattg ctttctcaga agctgctaag 180
aaattcgaag aacaaggcgc tcaagttctt ttcgcctcca ctgactccga atactccctt 240
ttggcatgga ccaatatccc aagaaaggaa ggtggtttgg gcccaatcaa cattccattg 300
ttggctgaca ccaaccactc tttgtccaga gactatggtg tcttgatcga agaagaaggt 360
gtcgccttga gaggtttgtt catcatcgac ccaaagggtg tcattagaca catcaccatt 420
aacgatttgc cagtcggtag aaacgttgac gaagccttga gattggttga agccttccaa 480
tggaccgaca agaacggtac tgtcttgcca tgtaactgga ctccaggtgc tgctaccatc 540
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<210> 6
<211> 306
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggccgccg aggtgaagac cgtgatcaag cccctgggcg accgagtggt cgtgaagcga 60
atcgaggaag agcccaagac caagggcggc atcgtgctgc ccgacaccgc caaggagaag 120
cctcagaagg gcaaggtgat cgccgtgggc accggccgag tgctggagaa cggacagcga 180
gtgcccctgg aggtgaagga gggcgacatc gtggtgttcg ccaagtacgg cggcaccgag 240
atcgagatcg acggcgagga gtacgtgatc ctgtctgagc gagacctgct ggccgtgctg 300
cagtaa 306
<210> 7
<211> 650
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Ser Val Ser Thr Ala Lys Arg Ser Leu Asp Val Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ala Glu Phe Glu Gly Ser Lys Ser Arg His Asp Glu Ile Glu
20 25 30
Asn Glu His Arg Arg Thr Gly Thr Arg Asp Gly Glu Asp Ser Glu Gln
35 40 45
Pro Lys Lys Lys Gly Ser Lys Thr Ser Lys Lys Gln Asp Leu Asp Pro
50 55 60
Glu Thr Lys Gln Lys Arg Thr Ala Gln Asn Arg Ala Ala Gln Arg Ala
65 70 75 80
Phe Arg Glu Arg Lys Glu Arg Lys Met Lys Glu Leu Glu Lys Lys Val
85 90 95
Gln Ser Leu Glu Ser Ile Gln Gln Gln Asn Glu Val Glu Ala Thr Phe
100 105 110
Leu Arg Asp Gln Leu Ile Thr Leu Val Asn Glu Leu Lys Lys Tyr Arg
115 120 125
Pro Glu Thr Arg Asn Asp Ser Lys Val Leu Glu Tyr Leu Ala Arg Arg
130 135 140
Asp Pro Asn Leu His Phe Ser Lys Asn Asn Val Asn His Ser Asn Ser
145 150 155 160
Glu Pro Ile Asp Thr Pro Asn Asp Asp Ile Gln Glu Asn Val Lys Gln
165 170 175
Lys Met Asn Phe Thr Phe Gln Tyr Pro Leu Asp Asn Asp Asn Asp Asn
180 185 190
Asp Asn Ser Lys Asn Val Gly Lys Gln Leu Pro Ser Pro Asn Asp Pro
195 200 205
Ser His Ser Ala Pro Met Pro Ile Asn Gln Thr Gln Lys Lys Leu Ser
210 215 220
Asp Ala Thr Asp Ser Ser Ser Ala Thr Leu Asp Ser Leu Ser Asn Ser
225 230 235 240
Asn Asp Val Leu Asn Asn Thr Pro Asn Ser Ser Thr Ser Met Asp Trp
245 250 255
Leu Asp Asn Val Ile Tyr Thr Asn Arg Phe Val Ser Gly Asp Asp Gly
260 265 270
Ser Asn Ser Lys Thr Lys Asn Leu Asp Ser Asn Met Phe Ser Asn Asp
275 280 285
Phe Asn Phe Glu Asn Gln Phe Asp Glu Gln Val Ser Glu Phe Cys Ser
290 295 300
Lys Met Asn Gln Val Cys Gly Thr Arg Gln Cys Pro Ile Pro Lys Lys
305 310 315 320
Pro Ile Ser Ala Leu Asp Lys Glu Val Phe Ala Ser Ser Ser Ile Leu
325 330 335
Ser Ser Asn Ser Pro Ala Leu Thr Asn Thr Trp Glu Ser His Ser Asn
340 345 350
Ile Thr Asp Asn Thr Pro Ala Asn Val Ile Ala Thr Asp Ala Thr Lys
355 360 365
Tyr Glu Asn Ser Phe Ser Gly Phe Gly Arg Leu Gly Phe Asp Met Ser
370 375 380
Ala Asn His Tyr Val Val Asn Asp Asn Ser Thr Gly Ser Thr Asp Ser
385 390 395 400
Thr Gly Ser Thr Gly Asn Lys Asn Lys Lys Asn Asn Asn Asn Ser Asp
405 410 415
Asp Val Leu Pro Phe Ile Ser Glu Ser Pro Phe Asp Met Asn Gln Val
420 425 430
Thr Asn Phe Phe Ser Pro Gly Ser Thr Gly Ile Gly Asn Asn Ala Ala
435 440 445
Ser Asn Thr Asn Pro Ser Leu Leu Gln Ser Ser Lys Glu Asp Ile Pro
450 455 460
Phe Ile Asn Ala Asn Leu Ala Phe Pro Asp Asp Asn Ser Thr Asn Ile
465 470 475 480
Gln Leu Gln Pro Phe Ser Glu Ser Gln Ser Gln Asn Lys Phe Asp Tyr
485 490 495
Asp Met Phe Phe Arg Asp Ser Ser Lys Glu Gly Asn Asn Leu Phe Gly
500 505 510
Glu Phe Leu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Lys Lys Ala Ala Asn Met Ser
515 520 525
Asp Asp Glu Ser Ser Leu Ile Lys Asn Gln Leu Ile Asn Glu Glu Pro
530 535 540
Glu Leu Pro Lys Gln Tyr Leu Gln Ser Val Pro Gly Asn Glu Ser Glu
545 550 555 560
Ile Ser Gln Lys Asn Gly Ser Ser Leu Gln Asn Ala Asp Lys Ile Asn
565 570 575
Asn Gly Asn Asp Asn Asp Asn Asp Asn Asp Val Val Pro Ser Lys Glu
580 585 590
Gly Ser Leu Leu Arg Cys Ser Glu Ile Trp Asp Arg Ile Thr Thr His
595 600 605
Pro Lys Tyr Ser Asp Ile Asp Val Asp Gly Leu Cys Ser Glu Leu Met
610 615 620
Ala Lys Ala Lys Cys Ser Glu Arg Gly Val Val Ile Asn Ala Glu Asp
625 630 635 640
Val Gln Leu Ala Leu Asn Lys His Met Asn
645 650
<210> 8
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Ser Asp Ala Gly Arg Lys Gly Phe Gly Glu Lys Ala Ser Glu Ala
1 5 10 15
Leu Lys Pro Asp Ser Gln Lys Ser Tyr Ala Glu Gln Gly Lys Glu Tyr
20 25 30
Ile Thr Asp Lys Ala Asp Lys Val Ala Gly Lys Val Gln Pro Glu Asp
35 40 45
Asn Lys Gly Val Phe Gln Gly Val His Asp Ser Ala Glu Lys Gly Lys
50 55 60
Asp Asn Ala Glu Gly Gln Gly Glu Ser Leu Ala Asp Gln Ala Arg Asp
65 70 75 80
Tyr Met Gly Ala Ala Lys Ser Lys Leu Asn Asp Ala Val Glu Tyr Val
85 90 95
Ser Gly Arg Val His Gly Glu Glu Asp Pro Thr Lys Lys
100 105
<210> 9
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Val Leu Ser Asp Lys Glu Leu Phe Ala Ile Asn Lys Lys Ala Val
1 5 10 15
Glu Gln Gly Phe Asn Val Lys Pro Arg Leu Asn Tyr Asn Thr Val Ser
20 25 30
Gly Val Asn Gly Pro Leu Val Ile Leu Glu Lys Val Lys Phe Pro Arg
35 40 45
Tyr Asn Glu Ile Val Asn Leu Thr Leu Pro Asp Gly Thr Val Arg Gln
50 55 60
Gly Gln Val Leu Glu Ile Arg Gly Asp Arg Ala Ile Val Gln Val Phe
65 70 75 80
Glu Gly Thr Ser Gly Ile Asp Val Lys Lys Thr Thr Val Glu Phe Thr
85 90 95
Gly Glu Ser Leu Arg Ile Pro Val Ser Glu Asp Met Leu Gly Arg Ile
100 105 110
Phe Asp Gly Ser Gly Arg Pro Ile Asp Asn Gly Pro Lys Val Phe Ala
115 120 125
Glu Asp Tyr Leu Asp Ile Asn Gly Ser Pro Ile Asn Pro Tyr Ala Arg
130 135 140
Ile Tyr Pro Glu Glu Met Ile Ser Thr Gly Val Ser Ala Ile Asp Thr
145 150 155 160
Met Asn Ser Ile Ala Arg Gly Gln Lys Ile Pro Ile Phe Ser Ala Ser
165 170 175
Gly Leu Pro His Asn Glu Ile Ala Ala Gln Ile Cys Arg Gln Ala Gly
180 185 190
Leu Val Arg Pro Thr Lys Asp Val His Asp Gly His Glu Glu Asn Phe
195 200 205
Ser Ile Val Phe Ala Ala Met Gly Val Asn Leu Glu Thr Ala Arg Phe
210 215 220
Phe Lys Gln Asp Phe Glu Glu Asn Gly Ser Leu Glu Arg Thr Ser Leu
225 230 235 240
Phe Leu Asn Leu Ala Asn Asp Pro Thr Ile Glu Arg Ile Ile Thr Pro
245 250 255
Arg Leu Ala Leu Thr Thr Ala Glu Tyr Leu Ala Tyr Gln Thr Glu Arg
260 265 270
His Val Leu Thr Ile Leu Thr Asp Met Ser Ser Tyr Ala Asp Ala Leu
275 280 285
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290 295 300
Pro Gly Tyr Met Tyr Thr Asp Leu Ser Thr Ile Tyr Glu Arg Ala Gly
305 310 315 320
Arg Val Glu Gly Arg Asn Gly Ser Ile Thr Gln Ile Pro Ile Leu Thr
325 330 335
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340 345 350
Ile Thr Glu Gly Gln Ile Phe Val Asp Arg Gln Leu His Asn Lys Gly
355 360 365
Ile Tyr Pro Pro Ile Asn Val Leu Pro Ser Leu Ser Arg Leu Met Lys
370 375 380
Ser Ala Ile Gly Glu Gly Met Thr Arg Lys Asp His Gly Asp Val Ser
385 390 395 400
Asn Gln Leu Tyr Ala Lys Tyr Ala Ile Gly Lys Asp Ala Ala Ala Met
405 410 415
Lys Ala Val Val Gly Glu Glu Ala Leu Ser Ile Glu Asp Lys Leu Ser
420 425 430
Leu Glu Phe Leu Glu Lys Phe Glu Lys Thr Phe Ile Thr Gln Gly Ala
435 440 445
Tyr Glu Asp Arg Thr Val Phe Glu Ser Leu Asp Gln Ala Trp Ser Leu
450 455 460
Leu Arg Ile Tyr Pro Lys Glu Met Leu Asn Arg Ile Ser Pro Lys Ile
465 470 475 480
Leu Asp Glu Phe Tyr Asp Arg Ala Arg Asp Asp Ala Asp Glu Asp Glu
485 490 495
Glu Asp Pro Asp Thr Arg Ser Ser Gly Lys Lys Lys Asp Ala Ser Gln
500 505 510
Glu Glu Ser Leu Ile
515
<210> 10
<211> 910
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Leu Asn Phe Thr Gly Gln Thr Arg Arg Arg Asn Val Asn Leu Gly
1 5 10 15
Asn Arg Thr Arg Asn Ser Lys Lys Asp Leu Leu Glu Lys Ala Lys Arg
20 25 30
Glu Arg Glu Arg Arg Ala Gln Asp Lys Leu Lys Glu Asp Ala Ser Lys
35 40 45
Thr Ile Gln Lys Ser Ile Arg Arg His Phe Ser Asn Val Arg Leu Phe
50 55 60
Lys Asn Thr Phe Thr Ser Ser Gln Leu Val His Met Ile Pro Ala Tyr
65 70 75 80
Gly Gly Lys Leu Ile Tyr Tyr Ile Ser Gln Tyr Asp Leu Gln Gln Leu
85 90 95
Leu Lys Leu Ser His Asn Phe Leu Ser Ser Tyr Pro Asn Ser Leu Gly
100 105 110
Asn Arg Gln Leu Leu Ser Leu Leu Lys Leu Tyr Gln Asp Asp Ala Leu
115 120 125
Val Ala Glu Thr Leu Ser Asp Leu Asn Met Asp Cys Pro Thr Val Asp
130 135 140
Glu Phe Leu Asp Ser Leu Ser Val Tyr Leu Cys Arg Ala Ser Ser Leu
145 150 155 160
Ser Tyr Ser Ser Ala Ser Lys Leu Ala Asp Val Ile Glu Ala Trp Glu
165 170 175
Val Met His Ser Ser Ala Ser Ile Ser Ile Phe Ser Ile Ser Ile Gly
180 185 190
Ser Tyr Glu Lys Arg Pro Phe Ala Leu Gln Phe Tyr Cys Ile Leu Ala
195 200 205
Glu Arg Asn Leu Leu Pro Gln Leu Ile Asn Thr Asn Pro Ile Leu Trp
210 215 220
Asp Asn Met Ala Lys Thr Tyr Ser His Cys Ser Lys Gly Gly Gln Lys
225 230 235 240
Asn Ile Ala Lys Leu Leu Ile Pro Asn Phe Asn Asn His Ile Ala Pro
245 250 255
Ser Val Leu Arg Ser Asp Asn Asp Tyr Val Leu Lys Phe Tyr Glu Lys
260 265 270
Ala Phe Ile Asp Glu Val Ile Ala Thr Thr Ala Asn Tyr Val Ser Asp
275 280 285
Glu Asp His Val Lys Asn Leu Met Cys Tyr Ile Ala Ser Ser Pro Asn
290 295 300
Gln Ser Cys Lys Asn Ser Val Leu Ile Thr Leu Leu Ser Asn Lys Asp
305 310 315 320
Phe Val Arg Arg Leu Ser Trp Glu Phe Phe His Thr Lys Phe Asn Ala
325 330 335
Ser Lys Thr Glu Ala His Pro Leu Phe Ser Val Leu Ala Gln Leu Ile
340 345 350
Asp Met His Leu Leu Ile Ser Thr Asp Arg Glu Leu Leu Asp Tyr Asn
355 360 365
Ser Val Ile Pro Ile Glu Glu Leu Lys Lys Phe Thr Ser Thr Leu Lys
370 375 380
Asp Phe Thr Phe Arg Gln Tyr Trp Glu Leu Pro Lys Ser Glu Arg Asn
385 390 395 400
Pro Met Leu Lys Glu Ala Val Pro Leu Leu Ser Lys Val Tyr Glu Arg
405 410 415
Asp Ser Arg Leu His Phe Leu Ser Thr Glu Asn Asn Pro Thr Tyr Trp
420 425 430
Glu Asn Ser Glu Lys Gln Phe Leu Asn Leu Arg Phe Tyr Glu Glu Leu
435 440 445
Gln Glu Tyr Glu Asp Leu Tyr Arg Glu His Leu Glu Glu Glu Ser Asp
450 455 460
Glu Asp Met Glu Lys Glu Ile Asp Leu Asp Lys Glu Arg Pro Pro Leu
465 470 475 480
Lys Ser Leu Leu Leu Asn Lys Met Lys Lys Arg Leu Lys Ser Ser Leu
485 490 495
Arg Phe Arg Lys Leu Glu Ile Leu Leu Glu Leu Pro Phe Phe Ile Pro
500 505 510
Phe Glu Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr Met Phe Ile Ala Leu Asp Lys
515 520 525
Lys Arg Leu Ser Leu Asp Asp Asp His Asn Leu Ile Asn Met Phe Thr
530 535 540
Pro Trp Ala Ser Thr Gly Met Arg Lys Gln Ser Ala Ile Ile Ser Arg
545 550 555 560
Asp Asn Val Leu Glu Asp Ala Phe Asn Ala Phe Asn Ser Ile Gly Glu
565 570 575
Arg Phe Lys Ala Ser Leu Asp Val Thr Phe Ile Asn Glu Phe Gly Glu
580 585 590
Glu Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gly Ile Thr Lys Glu Phe Leu Thr Thr
595 600 605
Val Ser Asp Glu Gly Phe Lys Asp Pro Lys His Glu Leu Phe Arg Thr
610 615 620
Asn Asp Arg Tyr Glu Leu Tyr Pro Ser Val Val Tyr Asp Ala Thr Lys
625 630 635 640
Leu Lys Tyr Ile Trp Phe Leu Gly Lys Val Val Gly Lys Cys Leu Tyr
645 650 655
Glu His Val Leu Ile Asp Val Ser Phe Ala Asp Phe Phe Leu Lys Lys
660 665 670
Leu Leu Asn Tyr Ser Asn Gly Phe Leu Ser Ser Phe Ser Asp Leu Gly
675 680 685
Ser Tyr Asp Ser Val Leu Tyr Asn Asn Leu Ile Lys Leu Leu Asn Met
690 695 700
Thr Thr Asp Glu Ile Lys Ser Leu Asp Leu Thr Phe Glu Ile Asp Glu
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Pro Glu Ser Ser Ala Lys Val Val Asp Leu Ile Pro Asn Gly Ser Lys
725 730 735
Thr Tyr Val Thr Lys Asp Asn Val Leu Leu Tyr Val Thr Lys Val Thr
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Leu Asp Asp Leu Lys Ser Asn Thr Glu Tyr Gly Gly Tyr Lys Glu Glu
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850 855 860
Ala Gly Thr Glu Lys Tyr Arg Leu Pro Thr Ala Ser Thr Cys Val Asn
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Leu Leu Lys Leu Pro Asp Tyr Arg Asn Lys Thr Ile Leu Arg Glu Lys
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Leu Leu Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Ala Arg Phe Asp Leu Ser
900 905 910
<210> 11
<211> 196
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Val Ala Gln Val Gln Lys Gln Ala Pro Thr Phe Lys Lys Thr Ala
1 5 10 15
Val Val Asp Gly Val Phe Asp Glu Val Ser Leu Asp Lys Tyr Lys Gly
20 25 30
Lys Tyr Val Val Leu Ala Phe Ile Pro Leu Ala Phe Thr Phe Val Cys
35 40 45
Pro Thr Glu Ile Ile Ala Phe Ser Glu Ala Ala Lys Lys Phe Glu Glu
50 55 60
Gln Gly Ala Gln Val Leu Phe Ala Ser Thr Asp Ser Glu Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Leu Ala Trp Thr Asn Ile Pro Arg Lys Glu Gly Gly Leu Gly Pro Ile
85 90 95
Asn Ile Pro Leu Leu Ala Asp Thr Asn His Ser Leu Ser Arg Asp Tyr
100 105 110
Gly Val Leu Ile Glu Glu Glu Gly Val Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile
115 120 125
Ile Asp Pro Lys Gly Val Ile Arg His Ile Thr Ile Asn Asp Leu Pro
130 135 140
Val Gly Arg Asn Val Asp Glu Ala Leu Arg Leu Val Glu Ala Phe Gln
145 150 155 160
Trp Thr Asp Lys Asn Gly Thr Val Leu Pro Cys Asn Trp Thr Pro Gly
165 170 175
Ala Ala Thr Ile Lys Pro Thr Val Glu Asp Ser Lys Glu Tyr Phe Glu
180 185 190
Ala Ala Asn Lys
195
<210> 12
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Ala Ala Glu Val Lys Thr Val Ile Lys Pro Leu Gly Asp Arg Val
1 5 10 15
Val Val Lys Arg Ile Glu Glu Glu Pro Lys Thr Lys Gly Gly Ile Val
20 25 30
Leu Pro Asp Thr Ala Lys Glu Lys Pro Gln Lys Gly Lys Val Ile Ala
35 40 45
Val Gly Thr Gly Arg Val Leu Glu Asn Gly Gln Arg Val Pro Leu Glu
50 55 60
Val Lys Glu Gly Asp Ile Val Val Phe Ala Lys Tyr Gly Gly Thr Glu
65 70 75 80
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85 90 95
Leu Ala Val Leu Gln
100
<210> 13
<211> 7610
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctggcatttt gggcgttttc ggccttcatg gagcgcatgg agcgaaacta cctccgggac 60
cagagtggca tgagaaacca gcttctttgt ctggaccatt tggtccaatt tatgcttccc 120
tcactgtaca agcaccttga gaagaccgag tcaaccaatc tgtttttctt cttcagaatg 180
ctgctggtgt ggttcaagcg agagttgctc tgggatgacg ttttgcgtct gtgggaggtg 240
ttgtggacag attacctgtc gtcccaattt gttctatttg tgtgcctggc tatcctcgat 300
aagcacaagg acgtcatgat tgaccatctg gctgggtttg atgagattct gaagtacatg 360
aacgagctgt ccatgaccat cgatttggac gagcttcttg ttcgtgccga gctcttgttc 420
taccgattca gacgtacggt cgagcttatt gaccgaaaga acgaggacag acgcaactca 480
gcggacggct ccgagcctgt ttccatcaca gaggacctgc gggaattgtt atctcggaaa 540
gtcattgttg tgcgtgaggg tgagcgtcct gaaggcgtaa tgggtgggta ggtaatgcag 600
tttgcatgca tgaagacact aaacaagcca accatacagc agaagtatgt agccttgcac 660
atgatttatt gacaggccac ccaaacaggc gtatgtatag tactgtacct tcagtagact 720
attgtagcta acatgtcgtt gcgtggcgta tgtaccaagc cacagaaatt atgtcagaga 780
taaggtcgcg acagttagag cagcaacgcg tggagagttt gggttttggg ttacgtacgt 840
agagccgttt gatagatggt acatccaccg gctagcggaa cacagtgtca agacaagcct 900
gcaacacagt cataatattt gcgatattca ggcgtatcag gtacaatctg aggtgtctca 960
caagtgccgt gcagtcccgc ccccacttgc ttctctttgt gtgtagtgta cgtacattat 1020
cgagaccgtt gttcccgccc acctcgatcc ggggtcctat gcatccctga aacattgatt 1080
ggaaattaac atatgagctg cgtgcttttt gcattcaagg gcgcagctta tcttgtatcc 1140
ttaattacac atgacctctt gagcgccacg gtacattcct ggcgtcagtt cggtggagcg 1200
gacacttttc tctcctttgt ctgacatgtt ggttaagttg tagtccaggg acacaagggg 1260
ttccaacggc agtggcagcc taccccacgc tacccaccac tggccctggt ctaacttcga 1320
cgatcggcat cagggttcat ggataggcgg tgtgatttac gatgtgatgg acaatgttag 1380
agagatccca ctacttgtag tcaggccatc ttttacgtac gcactgtacc atgatgtcaa 1440
tggagtatga tgaaccgact ttgagagact cacatctgca caacaccatg tttcagcgga 1500
atccgacttc caacccaaac ccaagcccct gtcagatatc gtgagaaggc acggcaccaa 1560
ctaatgcaca cactccacct gtattgcacc aagataatga gggcatcgtc ttggcgcgtc 1620
ttggcgagag ccgtgtttcg tgacgcaatc agagcagttt ctggatagta tcttgtccag 1680
aaacacgata taaaccccat cgacgggccc gttgaagagc accaacccac tatccaatcc 1740
tccaatccaa caatgggtac tactttggat gatactgctt acagatacag aacttctgtt 1800
ccaggtgatg ctgaagctat tgaagctttg gatggttctt tcactactga cactgttttc 1860
agagttactg ctactggtga tggtttcact ttgagagaag ttccagttga tccaccattg 1920
actaaggttt ttccagatga tgaatccgat gacgaatctg atgatggtga agatggtgat 1980
ccagattcta gaacttttgt tgcttatggt gatgacggtg acttggctgg ttttgttgtt 2040
gtttcttatt ctggttggaa tagaagattg accgtcgaag atattgaagt tgctccagaa 2100
catagaggtc atggtgttgg tagagctttg atgggtttgg ctactgaatt tgctagagaa 2160
agaggtgctg gtcatttgtg gttggaagtt actaatgtta acgctccagc tattcatgcc 2220
tatagaagaa tgggttttac cttgtgtggt ttggatactg cattatacga tggtactgca 2280
tcagatggtg aacaagcctt gtatatgtct atgccatgtc catgacttct gttcggaatc 2340
aacctcaagg ttaacggcca cgatcccctc gttgttactc ttggtcagcc cattgtcggt 2400
aacgctggct ttgctaactg ggtcgataaa ctcttctttg gccaggagaa ccccgatgtc 2460
tccaaggtgt ccaaagaccg aaagctctac cgaatcaccc accgaggaga tatcgtccct 2520
caagtgccct tctgggacgg ttaccagcac tgctctggtg aggtctttat tgactggccc 2580
ctgatccacc ctcctctctc caacgttgtc atgtgccagg gccagagcaa taaacagtgc 2640
tctgccggta acactctgct ccagcaggtc aatgtgattg gaaaccatct gcagtacttc 2700
gtcaccgagg gtgtctgtgg tatctaagct atttatcact ctttacaact tctacctcaa 2760
ctatctactt taataaatga atatcgttta ttctctatga ttactgtata tgcgttcctc 2820
taagacaaat cgaaaccagc atgcgatcga atggcataca aaagtttctt ccgaagttga 2880
tcaatgtcct gatagtcagg cagcttgaga agattgacac aggtggaggc cgtagggaac 2940
cgatcaacct gtctaccagc gttacgaatg gcaaatgacg ggttcaaagc cttgaatcct 3000
tgcaatggtg ccttggatac tgatgtcaca aacttaagaa gcagccgctt gtcctcttcc 3060
tcgaaactct caaacacagt ccagaagtcc tttatagttt gatctgtatc cagatagcct 3120
ccgtaattgg tgtgtgtctt caaatcccag acgtccacat tggcatgtcc tccactgata 3180
agcatttgaa gttcatctgc gttgaacatt gagacccacg aagggtcaat gagctggtat 3240
agaccgccca agaatgcatc tgttcgtaga taatggaata caaatggata tccagagtat 3300
acacatggat agtatacact gacacgacaa ttctgtatct ctttatgtta actactgtga 3360
ggcgttaaat agagcttgat atataaaatg ttacatttca cagtctgaac ttttgcagat 3420
tacctaattt ggtaagatat taattatgaa ctgaaagttg atggcatccc taaatttgat 3480
gctggcagac cccgaaacct atgtgggggg gggttagaag caattggaga agaaacgttc 3540
agtaacttca aaacgagttt tcctctgtca aattttggat cagatcaagt gtcctatcag 3600
tctcaccctt gtgtttgcac ggtctgccaa gttctctcag atgatctacg ttcaactaat 3660
gagacagaaa gagcacgcag gcttgaacgc aggcttgaac gcatttggtt gagtcattgt 3720
acggcaactg gaagggctga gttgatctat ctgtcttctt cttcctcttc ttcttcaaat 3780
gacatcagca ctggagattc tctcctagct catggactga gactactatg ttctatggag 3840
ttgtgctctc aatccaacca tctttcacaa catcaaactc aagtccactg agaacatctc 3900
gctcgacttg tctctatctc aacacccagg gctatctgag ctggatcgtg gaggactggc 3960
tgttgtaagg agtttggcgc ccgttttttc gagccccaca cgtttcggtg agtatgagcg 4020
gcggcagatt cgagcgtttc cggtttccgc ggcgggacga gagcccatga tgggggctcc 4080
caccaccagc aatcagggcc ctgattacac acccacctgt aatgtcatgc tgttcatcgt 4140
ggttaatgct gctgtgtgct gtgtgtgtgt gttgtttggc gctcattgtt gcgttatgca 4200
gcgtacacca caatattgga agcttattag cctttctatt ttttcgtttg caaggcttaa 4260
caacattgct gtggagaggg atggggatat ggaggccgct ggagggagtc ggagaggcgt 4320
tttggagcgg cttggcctgg cgcccactcg cgaaacgcac ctaggaccct ttggcacgcc 4380
gaaatgtgcc acttttcagt ctagtaacgc cttacctacg tcattccatg catgcatgtt 4440
tgcgcctttt ttcccttgcc cttgatcgcc acacagtaca gtgcactgta cagtggaggt 4500
tttggggggg tcttagatgg gagctaaaag cggcctagcg gtacactagt gggattgtat 4560
ggagtggcat ggagcctggg tggagcctga caggacgcac gaccggctag cccgtgacag 4620
acgatgggtg gctcctgttg tccaccgcgt acaaatgttt gggccaaagt cttgtcagcc 4680
ttgcttgcga acctaattcc caattttgtc acttcgcacc cccattgatc gagccctaac 4740
ccctgcccat caggcaatcc aattaagctc gcattgtctg ccttgtttag tttggctcct 4800
gcccgtttcg gcgtccactt gcacaaacac aaacaagcat tatatataag gctcgtctct 4860
ccctcccaac cacactcact tttttgcccg tcttcccttg ctaacacaaa agtcaagaac 4920
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cggtgataat tctcttaacc tcccacactc ctttgacata acgatttatg taacgaaact 5220
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ctttgttcat caattccctc tgtgactact cgtcatccct ttatgttcga ctgtcgtatt 5340
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