具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例所采用的材料和试剂如下：

1)种子培养基

磷酸二氢钾11.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、七水硫酸镁10.0g/L、硫酸铵10.0g/L、氯化钙0.30g/L、氯化钠1.0g/L、氯化钾1.0g/L、葡萄糖30g/L、维生素溶液1mL/L、微量元素溶液4mL/L；pH为6.0-6.2。

2)发酵培养基

葡萄糖30g/L、硫酸钙1.0g/L、硫酸钾17.0g/L、七水硫酸镁16.0g/L、氢氧化钾4.0g/L、浓磷酸26.0mL/L、生物素0.9mg/L、泛酸钙20mg/L、维生素B1 15mg/L、肌醇16mg/L、烟酸90mg/L和维生素B6 4mg/L和微量元素溶液4.5mL/L；pH为6.0-6.2。

3)微量元素溶液

五水硫酸铜5.5g/L、碘化钠0.09g/L、硫酸锰3.5g/L、钼酸钠0.3g/L、硼酸0.04g/L、氯化钴0.6g/L、氯化锌21g/L和七水硫酸亚铁68g/L。

4)维生素溶液

生物素0.8g/L、泛酸钙20g/L、维生素B1 15g/L、肌醇16g/L、烟酸10g/L和维生素B64g/L。

5)葡萄糖溶液

葡萄糖500g/L、维生素溶液4mL/L、微量元素溶液12mL/L。

6)氮源溶液

蛋白胨0.15kg、酵母粉0.08kg/L。

7)质粒和相关酶：

pPIC9K载体：购自Invitrogen公司；

EcoR I、Not I：购自Sigma。

上述溶液中，如无特殊说明，溶剂为水。

实施例1构建重组巴斯德毕赤酵母

一、设计天蚕素抗菌肽基因的核苷酸序列UCAD

依据天蚕素抗菌肽基因的氨基酸序列，设计如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列UCAD(由北京赛百盛基因技术有限公司合成)。

SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列UCAD如下：

5’-agatctcacaaaaaaagtgaggatttttttatttttgtattgacaaaaatgggctcgtgtggtataataaatgtagtgaggtggatgcgagctccagacaaaggaggaaaacatatgattcagaaacggaaacggacggtcagctttagattggtgttaatgtgcacgctgttatttgttagcctgcctatcacgaaaacgtctgct-3’

二、构建天蚕素抗菌肽表达载体

采用EcoR I和和Not I分别对pPIC9K载体和天蚕素抗菌肽基因核苷酸序列进行双酶切；其中，双酶切体系为：UCAD或pPIC9K载体DNA 4μg、EcoR I0.5μL、Not I 0.5μL、Hbuffer 1μL、灭菌水补足20μL；置于37℃反应5h。

将双酶切产物电泳验证后进行T4连接，获得天蚕素抗菌肽表达载体pPIC9K-UCAD；其中，连接体系为：UCAD双酶切产物12μL、pPIC9K载体双酶切产物4μL、T4连接酶2μL、10×T4连接酶缓冲液2μL；于16℃连接12h。

三、构建重组巴斯德毕赤酵母

用电转法将重组载体pPIC9K-UCAD转化至巴斯德毕赤酵母菌SMD1168(Pichiapastoris购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。)感受态细胞；取转化菌液均匀凃于MD平板培养基上培养，挑取阳性单克隆，获得重组巴斯德毕赤酵母，冻干备用。

上述重组巴斯德毕赤酵母Y20210415，已经于2021年4月30日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.22264，建议的分类命名：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。

上述重组巴斯德毕赤酵母的常规理化鉴定结果见图1和图2，图3为本发明巴斯德毕赤酵母基于21S rDNA序列构建的系统发育树，图3中划线标注处即为本发明的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。

实施例2

本实施例提供一种利用重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法，步骤如下：

1、种子培养

将实施例1的冻干重组巴斯德毕赤酵母菌株1g直接接入装有1L种子培养基的三角瓶中，于30℃、200rpm的条件振摇培养，直至菌体浓度增长至OD600＝3.0左右。

将上述种子培养液转接至装有10L种子培养基的种子发酵罐中，10L种子发酵罐的参数为：搅拌速率500rpm、通气量2vvm，发酵培养24h。

随后，按照1：10比例继续将上述种子培养液转接至装有100L种子培养基的种子发酵罐中，100L发酵罐的参数为：搅拌速率500rpm、通气量2vvm，发酵24h后，继续逐级扩大种子培养，直至满足发酵所需种子培养液的要求。

2、发酵培养

向5000L发酵罐中加入2000L发酵培养基，然后将500L上述步骤1所得的种子培养液接入5000L发酵罐中，将通气量调至2vvm(每分钟通气量与发酵罐实际料液体积的比值)，搅拌转速调至500rpm下进行发酵；发酵过程中，利用浓氨水稳定发酵液的pH为6.0，同时利用溶氧电极监测溶氧量，大约14h后发酵液内溶氧量开始上升。

提前将葡萄糖溶液预热并保温在30℃左右，在溶氧量开始上升时，流加30℃的葡萄糖溶液350L，流加时间为14h，流加的同时控制搅拌速率以维持发酵液的溶氧量在20％左右。

葡萄糖溶液流加完毕后，待溶氧量上升至80％后，计时3h；利用浓氨水将发酵液的pH调至6.8，向发酵罐中加入氮源溶液350L，计时30min。

随后，将发酵罐罐温调节至29℃，开始多点同时流加甲醇、微量元素溶液和维生素溶液，其中甲醇和微量元素溶液的流加速度为7500mL/h，维生素溶液的总流加速度为90mL/h，同时控制搅拌速率以维持发酵液的溶氧量20％左右，流加至60h后下罐，结束反应，收集发酵液。

3、表达产物分离纯化及鉴定：

将上述步骤2收集的发酵液通过0.22μm滤膜过滤，取3L过滤液进行冻干；将冻干后的冻干粉重溶于1/10过滤液体积的去离子水中，得到菌液。

采用1KD截留透析袋对上述菌液进行透析，透析缓冲液为20mM磷酸钾盐缓冲液(pH＝6.8)，在室温中透析4次，每次2小时，待透析袋内的离子强度与20mM磷酸钾盐缓冲液相同时，将透析袋内的溶液取出；随后，采用10KD超滤离心管对透析液进行超滤离心，得到蛋白溶液。

采用20mM磷酸钾盐缓冲液(pH＝6.8)对阳离子交换柱(sepharose-SP)进行平衡，平衡3-5个柱体积，流速为0.1柱体积/分钟；平衡后，将上述蛋白溶液上柱，流速为0.1柱体积/分钟；上柱完毕后用20mM磷酸钾盐缓冲液(pH＝6.8)对柱上未结合蛋白进行清洗，清洗3-5个柱体积；再用含有0.6M NaCl的20mM磷酸钾盐缓冲液(pH＝6.8)对蛋白进行洗脱，用紫外检测器检测蛋白洗脱情况。

将上述洗脱下来的组分用1KD截留透析袋以及20mM磷酸钾盐缓冲液(pH＝6.8)进行透析，在室温中透析4次，每次2小时，随后冻干。

将冻干粉重新溶解于50v％的乙腈溶液中，用HPLC进行分离，分离条件如下：分离柱：C18液相色谱柱；流动相：0.1％三氟乙酸水溶液∶0.1％三氟乙酸乙腈溶液＝1∶1(体积比)；流速：1mL/min；检测波长：214nm；柱温：30℃。

结果显示，检测到的蛋白的分子量与理论分子量相似，证明天蚕素抗菌肽被检测到。

对照例1

本对照例采用公开号为CN101307316A的中国专利申请所公开的方法。

试验例天蚕素抗菌肽抑菌活性检测

采用标准琼脂孔穴扩散法，以下列各菌株作为指示菌，将实施例2的发酵液、对照例1的发酵上清液以及柞蚕免疫血淋巴干冻干粉溶液(200g/L)各20μl与55℃的LB固体培养基25ml混匀后平铺板待其凝固后，用灭过菌的打孔器打孔，孔中滴加20μl上述各测试液，在37℃培养12h。培养后，测定各指示菌的抑菌圈直径(mm)，以抑菌圈直径计算天蚕素抗菌肽对各指示菌的杀菌活力(X)和杀菌效价(U/ml)，计算公式如下：

杀菌活力(X)＝(抑菌圈直径-2.3mm)/2

杀菌效价(U/ml)＝2X×1000

天蚕素抗菌肽抑菌结果见表1。

表1天蚕素抗菌肽抑菌结果

结果表明：

1、本发明的方法通过对天蚕素抗菌肽基因进行改造，使其能够在巴斯德毕赤酵母中大量表达，特别适合工业化大规模生产；

2、通过本发明方法生产的天蚕素抗菌肽具有广谱的抗菌活性，天蚕素抗菌肽的抗菌活性显著高于现有技术，且每L本发明的发酵上清液相当于920g柞蚕免疫血淋巴干冻干粉中所含抗菌肽的效价，该天蚕素抗菌肽的抗菌活性高，有利于实际应用。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一种利用重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 207

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agatctcaca aaaaaagtga ggattttttt atttttgtat tgacaaaaat gggctcgtgt 60

ggtataataa atgtagtgag gtggatgcga gctccagaca aaggaggaaa acatatgatt 120

cagaaacgga aacggacggt cagctttaga ttggtgttaa tgtgcacgct gttatttgtt 180

agcctgccta tcacgaaaac gtctgct 207