CN110551758A - 重组杆状病毒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明内容关于一种适用于将外源基因引入害虫(特别是传播疾病的蚊子)中的重组杆状病毒。该重组杆状病毒的特征在于具有一启动子(其为一HzNV‑1病毒早期表达基因pag1、一抗菌肽基因b1、一防御素基因a4或hsp70基因的任何一种)；以及一可操作式地与该启动子连结的外源基因。本发明内容也关于一种用以将外源基因引入一害虫的方法。该方法包含将一重组杆状病毒转入该害虫，而不抑制该害虫体内微RNA(miRNAs)的生成，其中该重组杆状病毒包含一pag1、抗菌肽b1、防御素a4或hsp70启动子。

Description

重组杆状病毒及其用途

技术领域

本发明内容是关于用于递送基因的修饰载体。更具体来说，本发明内容是关于一种重组杆状病毒，据以将一外源基因递送至一蚊子(特别是传播疾病的蚊子)体内。

背景技术

埃及斑蚊(Aedes aegypti，也称黄热病蚊子)以及白线斑蚊(A.albopictus，也称亚洲虎蚊或森林蚊)会传播各种人类潜在致命病毒(包含登革(dengue)病毒、屈公病(chikungunya)病毒、寨卡(zika)病毒、黄热病(yellow fever)病毒以及马亚罗(Mayaro)病毒)，也会传播一些丝虫性线虫(filarial nematodes)例如犬心丝虫(Dirofilariaimmitis)及其它疾病。三斑家蚊(Culex tritaeniorhynchus)是日本脑炎(Japaneseencephalitis)的主要病媒，而中华疟蚊(Anopheles sinensis)传播疟疾及淋巴性丝虫病(lymphatic filariasis)。尽管本领域相关技术人员对蚊子基因调控的研究及防治蚊媒疾病努力不懈，缺乏有效及弹性的基因传递方法仍阻碍了对病毒/宿主之间相互作用及蚊虫生物学的研究。一个可跨越不同蚊子物种并将基因传递进细胞、幼虫及成虫不同器官的有效基因传递系统显然可成为此类研究不可或缺的工具，并在生物学研究中会有许多其它重要的应用。

鉴于此，本领域现有技术有必要发展一种可将基因传递进蚊子的工具及/或方法，以便更容易研究并控制蚊子将危险病毒传播给人类及/或牲口家畜。

发明内容

为了给读者提供基本的理解，以下提供本发明内容的简要发明内容。此发明内容不是本发明内容的广泛概述，同时非用来识别本发明的关键/必需组件或勾勒本发明的范围。其唯一目的是以简化的概念形式呈现本发明内容的一些概念，以作为呈现于后文中更详细描述的序言。

本发明整体是关于修饰载体及其用途。经修饰的载体适于将外源基因转入蚊子，特别是会传播疾病的蚊子，像是埃及斑蚊(A.aegypti)、白线斑蚊(A.albopictus)、三斑家蚊(C.tritaeniorhynchus)以及中华疟蚊(A.sinensis)。

据此，本发明第一方面主要提供一种能够将外源基因递送至蚊子体内的重组杆状病毒(baculovirus)。此重组杆状病毒的特色在于具有一HzNV-1病毒早期表达基因(viralearly expressing gene)pag1、一抗菌肽基因(cecropin gene)b1、一防御素基因(defensin gene)a4、或一热休克蛋白70(hsp70)基因的启动子，以及可操作式地(operably)与该启动子连结的外源基因。

根据本发明内容的非必要性实施方式，重组杆状病毒可更包含一报告基因，其可操作式地与该启动子及该外源基因连结，并用以编码一易于追踪及/或操控表达量的报告蛋白。报告蛋白的实施例包含，但不限于，绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)、增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein，EGFP)、圆盘海葵红色荧光蛋白(Discosoma sp.red fluorescent protein，DsRed)、蓝色荧光蛋白(bluefluorescence protein，BFP)、增强型黄色荧光蛋白(enhanced yellow fluorescentproteins，EYFP)、海葵玛哈诺荧光蛋白(Anemonia majano fluorescent protein，amFP)、钮扣珊瑚荧光蛋白(Zoanthus fluorescent protein，zFP)、圆盘海葵荧光蛋白(Discosomafluorescent protein，dsFP)以及羽珊瑚荧光蛋白(Clavularia fluorescent protein，cFP)。在一较佳的实施方式中，报告蛋白是EGFP。

适用于本发明的杆状病毒实例包含，但不限于，苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)、芹菜夜蛾多核型多角体病毒(Anagrapha falclfera MNPV，AfMNPV)、大豆夜蛾多核型多角体病毒(Anticarsia gemmatalis MNPV，AgMNPV)、家蚕多核型多角体病毒(Bombyx mori MNPV，BmMNPV)、油桐尺蠖单核多角体病毒(Buzura suppressaria singlenucleopolyhedrovirus，BsSNPV)、棉铃虫单核多角体病毒(Helicoverpa armigera SNPV，HaSNPV)、谷实夜蛾单核多角体病毒(Helicoverpa zea SNPV，HzSNPV)、舞毒蛾多核型多角体病毒(Lymantria dispar MNPV，LdMNPV)、黄杉毒蛾多核型多角体病毒(Orgyiapseudotsugata MNPV，OpMNPV)、草地贪夜蛾多核型多角体病毒(Spodoptera frugiperdaMNPV，SfMNPV)、甜菜夜蛾多核型多角体病毒(Spodoptera exigua MNPV，SeMNPV)以及粉纹夜蛾多核型多角体病毒(Trichoplusia ni MNPV，TnMNPV)。根据本发明内容一较佳实施方式，该重组杆状病毒是重组苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)。

本发明内容的第二方面关于一种通过本发明重组杆状病毒，用以将外源基因引入一蚊子体内的方法。该方法包含，将本发明的重组杆状病毒转导蚊子，而不抑制蚊子体内微RNA(miRNAs)的生成。本发明内容的重组杆状病毒的特征在于具有一启动子，其可以是一HzNV-1病毒早期表达基因pag1、一抗菌肽基因b1、一防御素基因a4、或一热休克蛋白70(hsp70)基因；以及一可操作式地与该启动子连结的外源基因。

根据本发明内容，是利用一试剂来达成抑制蚊子体内微RNA的生成，且该试剂导致抑制Drosha、Dicer、类铎受体2、STAT1、STAT6、白介素7R或白介素1A表达。

根据本发明内容的实施方式，蚊子是埃及斑蚊(A.aegypti)或白线斑蚊(A.albopictus)。

根据本发明内容的实施方式，蚊子可以是蚊子细胞、幼虫及成虫。

适用于本发明的杆状病毒实例包含，但不限于，苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)、芹菜夜蛾多核型多角体病毒(AfMNPV)、大豆夜蛾多核型多角体病毒(AgMNPV)、家蚕多核型多角体病毒(BmMNPV)、油桐尺蠖单核多角体病毒(BsSNPV)、棉铃虫单核多角体病毒(HaSNPV)、谷实夜蛾单核多角体病毒毒(HzSNPV)、舞毒蛾多核型多角体病毒(LdMNPV)、黄杉毒蛾多核型多角体病毒(OpMNPV)、草地贪夜蛾多核型多角体病毒(SfMNPV)、甜菜夜蛾多核型多角体病毒(SeMNPV)以及粉纹夜蛾多核型多角体病毒(TnMNPV)。根据本发明内容一较佳实施方式，该重组杆状病毒是重组苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)。

根据本发明内容非必要实施方式，重组杆状病毒更包含一可操作式地与该启动子及外源基因连结的报告基因，且该报告基因可编码一报告蛋白，其可为绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、圆盘海葵红色荧光蛋白(DsRed)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、海葵玛哈诺荧光蛋白(amFP)、钮扣珊瑚荧光蛋白(zFP)、圆盘海葵荧光蛋白(dsFP)或羽珊瑚荧光蛋白(cFP)。

根据本发明内容的实施方式，重组杆状病毒不会在蚊子体内复制。

根据本发明内容的实施方式，外源基因可成功地在蚊子成虫的头部、喙部(proboscis)、腿部、平衡棍(haltere)、中肠马氏小管(midgut malpighian tubule)、卵巢、嗉囊(crop)及脂肪体中表达。

在参阅下文实施方式后，本领域技术人员当可轻易了解本发明的基本精神及其它发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。

附图说明

为让本发明的上述与其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：

图1的图式呈现杆状病毒转导进入蚊子C6/36细胞的结果。A小图是绘示用于产生重组杆状病毒的复合表达载体，该复合转移载体包含sv40及pag1启动子，其设计成可分别在哺乳类细胞及昆虫细胞中表达mCherry。B小图则呈现杆状病毒以剂量依赖性的方式进入宿主细胞中，以不同感染复数(MOI＝1、10及100)的重组vABspmC杆状病毒转导C6/36细胞。C小图呈现以流式细胞仪圈选(gating)mCherry-阳性表达的细胞(图式呈现多次生物学重复的一次代表性结果)。D小图是关于mCherry-阳性表达细胞的定量结果，以评估转导作用效率。E小图呈现残存的杆状病毒介导基因表达的结果。C6/36细胞经浓度为MOI＝1的杆状病毒转导，并分析荧光蛋白的表达量数天。以荧光显微镜撷取不同时点的mCherry荧光影像。F小图呈现GP64-介导的杆状病毒进入。以一杆状病毒-抗体(抗GP64蛋白的中和化或非中和化抗体)混合物处理C6/36细胞。B小图及F小图均呈现转导作用之后48小时撷取的mCherry荧光影像。所有的实验均进行三次生物学重复。

图2的图式呈现杆状病毒在C6/36细胞中的复制分析的结果。A小图呈现杆状病毒转导作用的mCherry荧光影像。C6/36细胞经浓度为MOI＝10的vABspmC转导，且于各种时点收集mCherry荧光影像(如图所示)。B小图是有关于杆状病毒进入效率的研究。将杆状病毒转导入C6/36细胞中，或以MOI＝10及MOI＝50的浓度感染Sf21细胞2小时，接着以qPCR定量相对转入效率。C小图呈现杆状病毒的复制效率。以浓度为MOI＝10的杆状病毒转导C6/36或感染Sf21细胞，并于各种时点收集这些细胞，同时通过qPCR定量细胞内病毒DNA。将病毒DNA在所有时点的量以内部基因(Sf21细胞的GAPDH或C6/36细胞的肌动蛋白)为基准进行标准化，并于转导作用2小时之后对病毒DNA复本数再次标准化。此实验分别进行三次。

图3的图式呈现不同杆状病毒的启动子在C6/36细胞中的效能分析。A小图绘示用以产生可表达EGFP的重组杆状病毒，其可通过各种杆状病毒、哺乳类病毒及蚊子宿主启动子(来自下列基因：pag1：HzNV-1病毒早期表达基因；p10：杆状病毒晚期基因；cmv：巨细胞病毒(cytomegalovirus)；sv40：猿猴病毒(simian virus)40；lir：RhPV病毒及EV71病毒的嵌合性内部核醣体进入区(internal ribosome entry site，IRES)；b1：抗菌肽b1基因；a4：防御素a4基因；pub：聚泛素(polyubiquitin)基因)所驱动。B小图呈现荧光影像。以表达EGFP的重组病毒(浓度为MOI＝1)转导C6/36细胞，或是将用以生成重组杆状病毒的500ng的重组质粒DNA构建体转染C6/36细胞。于转导作用48小时之后以荧光显微镜撷取影像。C小图呈现以目标启动子驱动的EGFP荧光的流式细胞仪分析结果。48小时后收集经重组杆状病毒转导或经质粒DNA转染的C6/36细胞，并以流式细胞仪测量平均EGFP荧光密度以测定启动子效能。数据呈现三次生物学重复的平均值。

图4的图式呈现hr1hsp70启动子影响蚊子C6/36细胞经杆状病毒转导的EGFP表达的结果。以重组杆状病毒vABhh-EG(浓度MOI＝1)转导C6/36细胞。经48小时之后收集C6/36细胞，并以流式细胞仪测量EGFP的平均荧光密度以测定启动子强度。实验以三重复进行，并仅呈现一代表性结果。星号(p<0.0005***)表示vABhh-EG转导的C6/36细胞表达EGFP的平均荧光密度分别与对照组及vABb1-EG转导的C6/36细胞表达EGFP的平均荧光密度有显著性差异。

图5的图式呈现蚊子体内的杆状病毒转导作用分析的结果。A小图呈现将杆状病毒转导入蚊子幼虫的结果。以1×10⁵PFU的vABb1EG-irEG杆状病毒显微注射四种不同蚊子物种(埃及斑蚊(A.aegypti)、白线斑蚊(A.albopictus)、三斑家蚊(C.tritaeniorhynchus)及中华疟蚊(A.sinensis))。转导作用两天之后，以荧光显微镜观察EGFP表达。B小图则呈现杆状病毒介导的转基因在蚊子成虫体内呈现剂量依赖性表达。以各种剂量(1×10³、10⁴或10⁵PFU)的vABb1EG-irEG杆状病毒对四种不同蚊子物种进行胸腔内显微注射。转导作用六天之后，以荧光显微镜观察EGFP表达。C小图呈现蚊子成虫杆状病毒的转导作用。以1×10⁵PFU的vABb1EG-irEG杆状病毒对四种不同蚊子物种进行胸腔内显微注射。经过几日后，以荧光显微镜观察EGFP表达(如图随着时间表示)。D小图呈现的是埃及斑蚊成虫的组织趋性。以1×10⁵PFU的vABb1EG-irEG杆状病毒胸腔内显微注射至埃及斑蚊成虫中，并于转导作用进行15日后进行观察。可在蚊子成虫的头部、触角、喙部、腿部、翅膀、平衡棍、中肠马氏小管、卵巢、嗉囊及脂肪体中观察到EGFP荧光表达。

具体实施方式

为了使本发明内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，也可利用其它具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。

为了便于说明，此处统整性地说明本说明书、实施例以及后附的权利要求书中所记载的特定术语。除非本文另有定义，本文所有的技术及科学术语与本领域技术人员公知的术语的意思相同。

本发明内容是关于重组杆状病毒、以及使用本发明重组杆状病毒用于传导蚊子的方法。

1.定义

本文使用的“杆状病毒”(baculoviruses)术语是指一种节肢动物专一性的双股DNA病毒，可用以控制病虫害(例如，蚊子)。核多角体病毒(nuclear polyhedrosisviruses，NPV)是一种杆状病毒亚群。许多杆状病毒均适于作为在被感染的宿主中表达外源蛋白的载体，包含那些感染棉铃虫(cotton bollworm，学名Helicoverpa zea)、烟草夜蛾虫(tobacco budworm，学名：Heliothis virescens)、冷杉毒蛾(Douglas-fir tussock moth，学名：Orygia pseudotsugata)、舞毒蛾(gypsy moth，学名：Lymantria dispar)、苜蓿银纹夜蛾(alfalfa looper，学名：Autographa californica)、欧洲松叶蜂(European pinesawfly，学名：Neodiiprion sertifer)以及苹果卷叶蛾(codling moth，学名：Cydiapomonella)。一般而言，具有广泛宿主范围的杆状病毒较佳，像是苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)。适用于本发明内容的杆状病毒实例包含，但不限于，AcMNPV、芹菜夜蛾(Anagrapha falcifera)多核型多角体病毒(AfMNPV)、大豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)多核型多角体病毒AgMNPV)、家蚕(Bombyx mori)多核型多角体病毒(BmMNPV)、油桐尺蠖单核多角体病毒(Buzurasuppressaria single nucleopolyhedrovirus，BsSNPV)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)单核多角体病毒(HaSNPV)、谷实夜蛾(Helicoverpa zea)单核多角体病毒(HzSNPV)、舞毒蛾(Lymantria dispar)多核型多角体病毒(LdMNPV)、黄杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)多核型多角体病毒(OpMNPV)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)多核型多角体病毒(SfMNPV)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)多核型多角体病毒(SeMNPV)以及粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)多核型多角体病毒(TnMNPV)。

“基因编码”(a gene encodes or encoding)是指一核酸，其含有结构RNA(例如rRNA、tRNA)或一特定蛋白或肽的初级氨基酸序列的序列信息。此用语具体包含天然序列的简并密码子(degenerate codons，也即编码单一氨基酸的不同密码子)，或可被引入符合特定宿主细胞的偏好密码子的序列。

本发明内容使用“外源基因”(an exogenous gene)一般性地指被分离、克隆并连接至与其不在自然状态下结合的核酸，以及/或是除了在自然状态的细胞或细胞环境中可发现的核酸或蛋白质以外，被引入细胞或细胞环境中及/或在该细胞或该细胞环境中表达的核酸。前述词汇包含最初是从不同物种或与其表达的细胞种类不同的细胞种类所获得的核酸，同时也包含从与所表达的细胞株相同的细胞株所获得的核酸。

本发明内容使用的“重组”(recombinant)作为一载体(vector，即核酸)的修饰物(modifier)时，像是重组病毒载体以及序列的修饰物(例如重组多核苷酸以及多肽)，意味着组合物已经被通常不会在自然界中发生的方式所改造(例如被基因工程改造)。重组载体(像是重组杆状病毒载体)的具体实例，可以是在通常不存在于野生型病毒基因体中的多核苷酸***在该病毒基因体之中的重组载体。

本发明内容所使用的“可操作式地连结”(operably linked)是指核酸片段之间的连结，在此功能性关系下，当基因表达时，每个基因片段可无功能性问题地运行，然而当一核酸片段与其它核酸片段连接时，其功能与表达可受到其它核酸片段的影响。举例来说，前述词汇是指一编码所需蛋白质的核酸序列及一核酸表达控制序列之间的功能性连结(functional linkage)，以这样的方式来允许一般功能。可使用本发明技术领域的公知遗传重组技术来制备可操作式地连结，同时可通过利用本领域公知的酶来执行定点DNA切割及连接。

本发明内容使用的“转导”(transduce)一词是指利用载体(例如，本发明内容的重组杆状病毒载体)将核酸导入细胞或宿主生物中。通过重组杆状病毒将转基因导入细胞中因而可被称为细胞的“转导作用”(transduction)。转基因可以或不可以与转导细胞(例如sf12细胞及蚊子C6/36细胞)的基因体核酸整合。若引入的转基因整合到受体细胞或宿主生物的核酸(基因体DNA)中，则其可稳定地在该细胞或生物中维持并进一步传递、或遗传给该受体细胞或宿主生物的子代细胞或生物。最后，引入的转基因可以存续于受体细胞或宿主生物染色体外、或短暂地存在于受体细胞或宿主生物中。

本发明内容使用的“转染”或“转染作用”(transfection)一词是指将核酸引入至宿主细胞的过程，其中并无病毒或病毒颗粒载体的参与。换句话说，通过使用一药剂将核酸引入宿主细胞(特别是当添加适量的核酸与转染脂质的复合物时)，足以克服培养基中血清对转染的有害作用。转染剂可以是市售的多价阳离子(例如聚凝胺(polybrene))。转染剂的有效量是指对有血清培养的给定宿主细胞产生可计量的转染效率增长的量。

本发明内容使用的“报告蛋白”(reporter protein)是指被工程改造成与感兴趣的蛋白一起表达，且诱导视觉可辨识特征(通常涉及荧光和发光蛋白)的蛋白。举例来说，编码水母绿荧光蛋白(GFP)的基因，其使细胞表达，以在蓝光下发出绿光，或是荧光素酶，其可催化与荧光素反应以发光。报告蛋白的实例包含但不限于：GFP、圆盘海葵红色荧光蛋白(DsRed)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、海葵玛哈诺荧光蛋白(amFP)、钮扣珊瑚荧光蛋白(zFP)、圆盘海葵荧光蛋白(dsFP)以及羽珊瑚荧光蛋白(cFP)。

除非上下文另有明确说明，本文所使用的单数形式“一”(a,an)以及“该”(the)均包含复数形式。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解本发明内容阐述的所有用来表示成分、反应条件的量的数值均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本发明内容所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视本发明试图获得的期望性质而改变。

2.重组杆状病毒

本发明内容主要提供一种重组杆状病毒，其可将外源DNA引入一害虫(pestinsect)中，特别是会传播疾病的蚊子。

为了鉴定适用于本发明的启动子，分别构建携带报告蛋白的表达基因盒(genecassette)并使其与候选启动子序列连结，候选启动子包括pag1：一种HzNV-1病毒早期表达基因；p10：杆状病毒晚期基因；cmv：巨细胞病毒(cytomegalovirus)；sv40：猿猴病毒(simian virus)40；lir：RhPV病毒及EV71病毒的嵌合性内部核醣体进入区(internalribosome entry site，IRES)；b1：抗菌肽b1基因；a4：防御素a4基因；pub：聚泛素(polyubiquitin)基因；以及热休克蛋白70(hsp70)基因；因此，可生成杆状病毒转移载体(transfer vector)。可将转移载体与杆状病毒一起使用以转染一宿主细胞(例如：蚊子细胞株C6/36)，且通过该报告蛋白的表达量评估每个候选启动子序列的能力。在所有经测试的候选启动子序列之中，pag1、抗菌肽b1基因及hsp70基因是相对较强的启动子，其显著地驱动可操作式地连结基因的表达，然而其余启动子则分别展现轻微甚至可忽略不计的活性。

据此，本发明内容的第一方面是关于一重组杆状病毒，其特征在于其具有一HzNV-1病毒早期表达基因pag1、一抗菌肽基因b1、一防御素a4基因或一hsp70基因作为一启动子，用以驱动可操作式地与该启动子连结的外源基因的表达。

为了构建本发明内容的重组杆状病毒，构建携带目标外源基因的表达基因盒，并分别连接至pag1、抗菌肽b1、防御素a4或hsp70基因以生产一转移载体。接着将转移载体与杆状病毒DNA一起共转染至宿主细胞中，以生产重组杆状病毒。

根据本发明内容的特定实施方式，杆状病毒转移载体是与一Bac-N-Blue病毒DNA共转染至一昆虫宿主细胞。Bac-N-Blue病毒DNA提供必要的病毒骨架，其含有繁殖必需(propagation-essential)基因。在昆虫宿主细胞中的重组杆状病毒转移载体及Bac-N-Blue病毒DNA之间的同源重组可产生重组杆状病毒，其能够在昆虫宿主细胞中繁殖，并因此生产各别由表达基因盒编码的目标外源蛋白。重组杆状病毒可进一步筛选并纯化，譬如通过报告多肽的表达。适用于本发明内容的昆虫宿主细胞包含但不限于：草地贪夜蛾(S.frugiperda)IPBL-9(Sf9)细胞、Sf21cell、High Five细胞、Mimic Sf9细胞以及C6/C36细胞。根据本发明内容的某些实施方式，昆虫宿主细胞是Sf21细胞。根据本发明内容的某些实施方式，昆虫宿主细胞是C6/C36细胞。根据本发明内容的实施方式，转导作用不会显著地影响昆虫宿主细胞的生存力长达12天。

非必要地，杆状病毒载体可包含报告蛋白多肽。报告多肽的实例可包含，但不限于，蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白(cyan fluorescence protein，CFP)、圆盘海葵红色荧光蛋白(DsRed)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)等等。在本发明内容某些特定实施方式中，报告多肽是EGFP。应当理解到的是报告多肽(例如：EGFP)并非本发明欲解决技术问题的必要技术特征，本发明欲解决的技术问题是将感兴趣的外源基因引入一病媒虫(例如蚊子)。

3.本发明内容重组杆状病毒的用途

根据本发明内容描述的方法构建的重组杆状病毒携带至少一个目标外源基因，而该外源基因的表达会受到pag1、抗菌肽b1、防御素a4或hsp70启动子序列的驱动。所产生的重组杆状病毒可用于转导病媒虫，例如埃及斑蚊(A.aegypti)、白线斑蚊(A.albopictus)、三斑家蚊(C.tritaeniorhynchus)以及中华疟蚊(A.sinensis)等蚊子。

据此，本发明内容也包含一种将一外源基因引入蚊子体内的方法。前述方法包含以下步骤：以本发明的重组杆状病毒转导蚊子，而不抑制蚊子体内微RNA。

被病毒感染后，受感染的宿主内部的抗病毒防御机制将被活化以抵御前述感染的病毒。抗病毒防御机制包含活化免疫系统的一或多种蛋白，举例来说，活化Dosha、Dicer、外输蛋白-5(Exportin-5)、类铎受体-2(Toll-like receptor-2，TLR-2)、STAT1、STATE、白介素7R(interleukin 7R)、白介素1A等等。已有研究指出当用杆状病毒载体感染细胞时，可以在杆状病毒载体之前或与杆状病毒一起施用于抗病毒防御路径中抑制蛋白表达的试剂(例如可以抑制Dosha、Dicer、外输蛋白-5、类铎受体-2(TLR-2)、STAT1、STATE、白介素7R及白介素1A表达的试剂)(请参阅US 2013/0109077A1)。此类试剂包含但不限于，可活化微RNA产生的试剂，该微RNAs在抗病毒防御路径中用以切割mRNAs。

与US2013/0109077A1公开内容不同的地方在于，本发明人意外地发现，当以本发明重组杆状病毒感染病媒虫时，不需要使用试剂来抑制病媒虫本身的抗病毒防御路径。根据本发明内容的实施方式，可以本发明重组杆状病毒对蚊子转导一目标外源基因，且不需使用可抑制蚊子的Dosha、Dicer、外输蛋白-5、类铎受体(TLR-2)、STAT1、STATE、白介素7R及白介素1A表达的试剂。

根据本发明内容的实施方式，可通过GP64囊膜蛋白(envelope protein)实现将本发明重组杆状病毒送入蚊子内。

根据本发明内容的实施方式，本重组杆状病毒在不同属的蚊子(包含但不限于埃及斑蚊(A.aegypti)、白线斑蚊(A.albopictus)、三斑家蚊(C.tritaeniorhynchus)以及中华疟蚊(A.sinensis))的幼虫及成虫阶段均可转导较强的基因表达。本发明的重组杆状病毒较佳是用以对埃及斑蚊(A.aegypti)或白线斑蚊(A.albopictus)进行转导。

根据本发明内容的实施方式，本重组杆状病毒不会在被感染的蚊子内复制。

根据本发明内容的实施方式，以本发明内容重组杆状病毒转导的外源基因可在蚊子组织中表达，蚊子组织包含但不限于：蚊子的头部、喙部、腿部、平衡棍、中肠马氏小管、卵巢、嗉囊及脂肪体。

下文提供多种实施例来说明本发明的某些实施方式但本发明非限于这些实施方式。

实施例

材料与方法

细胞与病毒

于28℃温度的CO₂加湿培养箱(浓度5％)中，以补充有10％的胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)、2mM的L-谷氨酰胺、0.1mM的非必需氨基酸、1mM的丙酮酸钠及2％的青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液(供货商：Invitrogen)培养白线斑蚊C6/36细胞株及埃及斑蚊CCL-125细胞株。另于26℃温度下，以含10％FBS的TC100昆虫培养液中培养草地贪夜蛾IPLB-Sf21(Sf21)细胞株。于37℃温度的CO₂加湿培养箱(浓度5％)中，以补充有10％的FBS与2％的青霉素-链霉素的杜氏培养液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM；供货商：Gibco)培养HEK-293T及Vero-E6细胞。本研究是使用苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)杆状病毒(基因库登录号NC_001623.1)基因体(商品名：flashBAC-ultra)来制备重组杆状病毒。各自培养基相应的冷冻病毒库存存放于-80℃温度。

转移载体与重组杆状病毒的构建

构建转移载体pABspmC以生产vABspmC重组杆状病毒。在pTriEx-3载体(供货商：Novagen)中将哺乳类sv40及HzNV-1pag1基因启动子以相反方向***TriEX启动子的上游。将pJET-mCherry载体上的mCherry基因以PCR-扩增并转移到pag1启动子的下游，以生成最终转移载体，名为pABspmC。在此复合载体中，mCherry的表达分别受到哺乳类系统的sv40启动子与昆虫系统的pag1启动子所驱动。针对启动子分析，发明人构建如图3A图示的数种转移载体。在pABhEG质粒(供货商：Abvector)中，PCR-扩增启动子区域被克隆到EGFP的上游，以取代pABhEG质粒上的hsp70启动子。pag1(杆状病毒早期基因)、p10(杆状病毒晚期基因)、cmv(巨细胞病毒)、sv40(猿猴病毒40)、lir(RhPV病毒与EV71病毒的嵌合性内部核醣体进入区(IRES))的启动子区；还有从埃及斑蚊基因体以PCR扩增的两个蚊子基因的启动子区：抗菌肽b1与防御素a4(基因库IDs分别为HQ285957.1及HQ285959.1)；以及市售合成的聚泛素基因(基因库ID：GU179018)启动子区(Pub基因上游565碱基对之处)(分别名为：pABpag1EG、pABp10EG、pABcmvEG、pABsv40EG、pABlirEG、pABb1EG、pABa4EG以及pABpubEG转移载体)。遵循In-Fusion克隆试剂盒(供货商：Clontech)的标准流程构建前述转移载体。根据公知克隆方法构建转移载体pBacb1EG-irEG。简言之，一NcoI–XbaI EGFP片段被转移进pGL3的NcoI及XbaI切位之间，以产生质粒pGL3-EGFP。抗菌肽b1的NheI–BglII启动子片段则以PCR扩增并克隆进pGL3-EGFP，以生成pGL3-b1EGFP。另将来自pGL3-b1-EGFP，NheI–NotI之间的限制酶切割区克隆到pBac-CHIKV-26S-Rhir-E(Wu Y.J.,(2008)Acta Pharmacologica Sinica 29(8):965-974)以替换CHIKV-26S区，且***NheI-BglII片段并自连结，以产生pBac-b1-EGFP-Rhir-E载体。通过测序验证以上所有转移载体。最后，利用Cellfectin试剂(供货商：Life Technologies)将这些转移载体是与vAcRP23.Laz(AcMNPV的线性化病毒DNA，供货商：Pharmingen)一起共转染进Sf21细胞中。通过终点稀释法分离重组杆状病毒，在T75烧瓶中扩增，并以TCID₅₀分析法测定Sf21细胞的病毒效价。

杆状病毒转导及感染作用

在进行转导作用前一天，将蚊子的C6/36细胞或哺乳类细胞(除特别说明外)以每孔4×10⁵的细胞数或1×10⁵个细胞数的密度培养于24-孔盘。以1倍的DPBS冲洗细胞，并添加不同MOI(如下文于不含任何FBS或抗生素的各培养液所示)的杆状病毒。在室温(RT)下以2000rpm转速离心培养盘32分钟。分别在28℃或室温培养经转导的蚊子细胞或哺乳类细胞2小时。以含有0.1％胰蛋白酶的DPBS洗涤培养盘两次，以移除未吸附的病毒。添加10％-FBS的完全培养液，并于不同时间点进行培养。针对杆状病毒感染试验，在感染作用前一天，将Sf21细胞以每孔2×10⁵个细胞数的密度培养于24孔盘中，并添加不同数量的杆状病毒以在不同的MOI条件下进行转导。在室温下以2000rpm的转速离心培养盘，并于26℃下于后文所示的各种时间范围(time frame)内进行培养。

细胞增殖及细胞生存力分析

将浓度MOI＝1、10及100的重组vABspmC杆状病毒蚊子转导进C6/36细胞中。转导后每24小时以胰蛋白酶处理收成细胞，以1倍的DPBS重新悬浮，接着与相同体积的0.4％的染剂(trypan blue exclusion dye，供货商：Sigma)混合以去除死细胞，并测定健康细胞的增殖情形。针对细胞生存力分析，通过对这些细胞添加10％v/v的AlamarBlue并培养4小时以测定相对细胞新陈代谢活性。AlamarBlue浓度减少的量则通过荧光测读仪(供货商：EnSpire,PerkinElmer)以激发波长为560nm且发射波长为590nm进行测定。

杆状病毒中和作用分析

以总体积为300μl的1倍DPBS(含有针对GP64蛋白的1μg的中和单株抗体(AcV1，供货商：Santa Cruz Biotechnology)或非中和单株抗体(AcV5，供货商：Santa CruzBiotechnology))处理vABspmC杆状病毒(4×10⁵PFU，MOI＝1)，并在室温下以300rpm离心。接着将病毒与抗体混合物加至C6/36细胞中放置2小时，并于28℃的CO₂加湿培养箱(浓度5％)中培养。接着移除病毒与抗体混合物，并以1倍DPBS(含有0.1％的胰蛋白酶)洗涤三次，以移除未连接的病毒颗粒。最后添加10％-FBS完全培养液，并于进行mCherry荧光试验之前培养细胞两天。

质粒DNA转染作用

将蚊子C6/36细胞以每孔4×10⁵个细胞数的密度培养于24-孔盘。次日，根据使用说明将重组质粒DNA(如图3所示，0.5μg)与转染试剂(TransIT-Insect TransfectionReagent；供货商：Mirus)混合，并于室温下培养30分钟，接着再将DNA与转染试剂混合物加入细胞中。在28℃的培养环境作用5小时之后，将细胞移除并以1倍DPBS洗涤，接着添加10％-FBS的完全培养液。在28℃温度下培养细胞2天，接着收集这些细胞用于流式细胞仪分析。

制备细胞用于流式细胞仪分析

在24孔盘中以各种指定时间范围以杆状病毒对蚊子C6/36细胞进行转导。将培养液从培养盘移除，以1倍的DPBS洗涤细胞两次，接着以预热的100μl胰蛋白酶-EDTA处理5分钟。接着添加100μl的MEM培养液(modified Eagle’s medium，供货商；Gibco)以中和该胰蛋白酶-EDTA，并将细胞收集在1.5ml的微量离心管(含1ml的1倍DPBS)中。以5000rpm转速离心细胞5分钟，以移除MEM培养液，再以1倍DPBS洗涤细胞沉淀物至少三次。最后，将细胞重新悬浮在1ml的固定缓冲液(以1倍DPBS稀释的1％FBS与1％甲醛)中，并通过流式细胞仪进行分析。通过利用流式细胞仪测定呈现mCherry-阳性或EGFP-阳性的细胞，并通过FlowJo软件测定其平均荧光强度(mean fluorescence intensities，MFI)。

以实时qPCR定量杆状病毒DNA

以1倍DPBS(含有0.1％的胰蛋白酶)对经杆状病毒感染的Sf21细胞或经杆状病毒转导的C6/36细胞洗涤三次，以移除细胞的自由病毒颗粒。通过质体萃取试剂盒(High PurePCR Template Preparation Kit，供货商：Roche)萃取总细胞DNA。使用分光光度计(型号：NanoDrop ND-1000，供货商：Thermo Fisher Scientific)对DNA进行定性及定量测定。在96孔盘上执行实时qPCR，每孔放置2μl的DNA(100ng/μl)、0.6μl的10μM的专一性引物对(最终浓度为300nM)、6.8μl H₂O以及10μl的2倍染剂(SYBR Green Master Mix，供货商：ABI)。样品以三份进行。以ABI 7500FAST系统进行实时PCR，循环数设定大于40，核酸贴合温度为60℃。通过比较临界值(critical threshold，CT)方法基于相对定量(relativequantification，RQ)评估每个目标基因的表达量。通过标准化成从内源对照组基因(C6/36细胞的肌动蛋白基因，以及Sf21细胞的GAPDH)的CT，以评估每个反应中的特定基因的RQ。进行三次独立转染实验，数据是来自一次独立感染的结果。

蚊子饲养

在27℃温度、80％的湿度环境以12小时光/暗周期饲养埃及斑蚊(A.aegypti，高雄品系)、白线斑蚊(A.albopictus，中和品系)、三斑家蚊(C.tritaeniorhynchus，北投品系)以及中华疟蚊(A.sinensis)。幼虫阶段则喂食粉碎的鱼饲料，成虫阶段则提供5％蔗糖供任意采食。

蚊子病毒口服感染及胸腔内接种

经冷冻的病毒库存于37℃下进行解冻，并在RPMI1640培养液中进行四或五次的10倍连续稀释，接着将其与等体积的去纤维蛋白(defibrinated)的绵羊血液混合。每种病毒稀释物呈递给脱蛹后4-5天的雌埃及斑蚊与白线斑蚊(经饥饿24小时)。根据公知技术(Thompson and Sarnow((2003)Virology 315(1):259-266))的标准流程对经冷麻醉(cold-anesthetized)的蚊子进行胸腔内接种病毒。

实施例1：杆状病毒对蚊子C6/36细胞的转导作用

本实施例聚焦在使用AcMNPV递送基因表达盒进入宿主蚊子C6/36细胞的研究。为了达成此目的，建构含有sv40及pag1启动子的重组vABspmC杆状病毒载体用以驱动mCherry基因的表达(图1A)，且分别以MOI＝1、10及100的重组载体转导C6/36细胞。12小时就可观察到mCherry的荧光(数据未示出)，而转导后48小时可观察到显著的剂量依赖性荧光强度(图1B)。

接着收集转导细胞，并以流式细胞仪测分析细胞以测定转导效率。mCherry-阳性细胞的圈选及定量结果显示在MOI＝1时可常规地实现60％至65％的转导效率(图1D)，而在MOI＝100，效率增加至95％至100％(图1的C和D)。

接着欲研究C6/36细胞是否于病毒感染之后会裂解而减少细胞增殖，将C6/36细胞暴露于各种MOI的vABspmC病毒下并测试不同的时间范围，接着以0.4％的台酚蓝溶液染色以排除死细胞，以计算健康细胞数量。每24小时检测细胞复制作用，直到转导作用后96小时。结果发现，在所有浓度(MOI)均进行正常细胞增殖直到转导作用48小时之后，而当与对照组(伪条件)进行比较，在48小时之后的时间点可观察到较轻微的细胞繁殖减少(特别是MOI＝100，结果未显示)。通过以四天间隔添加10％v/v的AlamarBlue分析细胞生存力，以测定细胞代谢活性。所有暴露的时间范围内，针对MOI＝1及MOI＝10的C6/36细胞并没有发现明显的毒性，然而在转导作用后12天，MOI＝100的细胞则观察到轻微但显著的减少(结果未显示)。

同时发明人也对C6/36细胞是否支持持久的基因表达进行研究，并监控杆状病毒对C6/36细胞的毒性多达12天。如图1E呈现的，在达到饱和之前，mCherry表达量是随着暴露后8天的时间函数而增加。是以，该结果表示此表达系统看似不涉及杆状病毒感染的裂解期，而C6/36细胞可使杆状病毒转导作用维持较长的时间。

由于杆状病毒通过表面GP64蛋白进入昆虫或哺乳动物细胞中，因而相应地测定GP64-介导细胞进入，其中杆状病毒在被转导进入C6/36细胞之前，先以中和或非中和的GP64抗体进行处理。结果发现，相较于负对照组，经GP64-中和抗体处理的杆状病毒在转导作用48小时之后并没有显示mCherry荧光(图1F)，这表示杆状病毒的确是通过GP64表面蛋白进入蚊子宿主中。

综上所述，此实验结果说明杆状病毒可在不影响宿主细胞增殖的前提下，成功地进入蚊子C6/36细胞中并一贯地驱动转基因表达。

实施例2：杆状病毒于蚊子C6/36细胞的复制分析

此实施例通过对宿主细胞中累积的病毒DNA量的检测来分析杆状病毒于蚊子C6/36细胞的复制情况。为此，将杆状病毒的天然宿主──昆虫Sf21细胞作为对照组，并以vABspmC与C6/36细胞一起感染。

图2A则显示以vABspmC转导的C6/36细胞(于MOI＝10)的mCherry荧光时间进程影像；而图2B的柱状图则呈现杆状病毒对Sf21细胞及C6/36细胞(MOI＝10及MOI＝50)的进入效率。发现感染/转导后2小时的个别MOI的细胞内病毒DNA相对量在两个宿主中相似，表示杆状病毒进入C6/36及Sf21细胞具有相似效率(图2B)。

再者，Sf21细胞的病毒DNA累积随着时间逐渐增加(从感染后12小时至48小时)，且在感染后96小时达到高原期。相较之下，转导作用之后12小时至96小时，C6/36细胞中的病毒随着时间逐渐减少，这表示杆状病毒可能没有在蚊子C6/36细胞中进行复制(图2C)。

实施例3：各种并入杆状病毒的启动子及其在C6/36细胞内的效率的功能性分析

本实验是通过将各种启动子的DNA序列***杆状病毒基因体中以测试其功能性及效能针对此目的，构建具有不同驱动EGFP表达的启动子序列的转移载体(如图3A所示)。

每个转移载体装载进杆状病毒之后，在MOI＝1时对C6/36细胞进行转导，使得大多数细胞每细胞含有一或更少的病毒基因体复本。为了对照，也将500ng的相同转移载体质粒对C6/36细胞进行转染，已使得细胞被平均为1.15×10⁵个复本的质粒DNA转染。在转导作用48小时后，撷取EGFP图像(图3B)。通过流式细胞仪定量EGFP阳性细胞的平均荧光强度，以评估C6/36细胞中每个启动子的强度。图3C则呈现前述定量结果。

结果发现，相较于其它启动子，pag1及b1启动子始终较强，且b1驱动的EGFP表达量是比pag1驱动的EGFP表达量微佳。相比之下，p10、sv40、lir、pub及a4启动子则展现较小或较微弱的荧光，且cmv启动子仅呈现最小的活性。

质粒转染系统中，pag1启动子呈现较佳的活性，然而其它启动子的活性则维持在基础值，或是低于侦测限制。此外，在质粒转染作用之下，p10、sv40、lir以及a4启动子呈现与杆状病毒转导作用相似的结果(即，无荧光)，且cmv启动子仅呈现基础活性。出乎意料的是pub启动子在杆状病毒转导系统始终呈现较低的荧光，然而在质粒转染系统中维持功能性。发明人认为这应该是由于杆状病毒介导的细胞反应抑制了pub启动子效能的关系。

实施例4：热休克蛋白启动子及其在C6/36细胞中效能的功能性分析

在本实验中，构建分别含有b1启动子及热休克蛋白70(hsp70)的转移载体，并根据实施例2所述的相似流程对对C6/36细胞进行转导，转导后，利用流式细胞仪测定启动子活性。图4绘示该测定结果。

与对照组相比，b1启动子能够在C6/36细胞中驱动EGFP表达；然而，hsp70更呈现较强的启动子活性，对杆状病毒介导基因于C6/36细胞中转移表达来说是最强的启动子。

实施例5：各种蚊子物种的幼虫(孑孓)与成虫中，杆状病毒介导的基因表达

本实施例主要是要评估杆状病毒对不同蚊子种类幼虫的转导作用能力。埃及斑蚊(A.aegypti，也称黄热病蚊子)以及白线斑蚊(A.albopictus，也称亚洲虎蚊或森林蚊)会传播各种人类潜在致命病毒(包含登革病毒、屈公病病毒、寨卡病毒、黄热病病毒以及马亚罗(病毒)，也会传播一些丝虫性线虫例如犬心丝虫及其余疾病。三斑家蚊(C.tritaeniorhynchus)是日本脑炎的主要宿主。中华疟蚊(A.sinensis)则传播疟疾及淋巴性丝虫病。

为了达成前述目的，将剂量为1×10⁵个PFU重组vABb1EG-irEG杆状病毒经显微注射进入前述四种蚊子物种的幼虫中，并于转导作用两日后测定EGFP表达量。图5呈现结果，可看出在埃及斑蚊及白线斑蚊中，EGFP表达量较强，与此相反的，在三斑家蚊及中华疟蚊的EGFP表达量较弱(图5A)。

为了评估杆状病毒在蚊子成虫的转导能力，通过胸腔内显微注射剂量依赖性地将相同的重组杆状病毒(vABb1EG-irEG)送入前述四种蚊子物种的幼虫体内。有趣的是，在转导作用6天之后，随着病毒剂量的增加，蚊子成虫中杆状病毒介导的EGFP表达量更高。同时，也发现与其它三种蚊子种类相比，中华疟蚊呈现较低的EGFP表达量(图5B)。接着执行经转导的蚊子成虫分离的总基因体DNA的RT-qPCR，以检测杆状病毒是否可在活体内复制。结果显示，杆状病毒并无在蚊子成虫中复制(数据未显示)，而此结果也证实体外实验的结果。

接着，通过一预定的时间范围，在规律的时间点检测经显微注射的蚊子。结果发现，EGFP表达量在注射后一日仅有些微的表达，但是随后在整个实验过程中是逐渐增加，直到注射后12天为止(图5C)。为了测定杆状病毒介导的外源基因表达的组织嗜性(tissuetropism)，解剖经转导的蚊子。可在大部分的组织中(包含头部、喙部、腿部、平衡棍、中肠马氏小管、卵巢、嗉囊以及脂肪体)观察到较强的EGFP表达，然而在触角及翅膀则观察到较弱的表达(图5D)。

综上所述，这些结果表明，杆状病毒可成功地转导在本实验所测试的蚊子物种幼虫及成虫中表达转基因，且没有或很少组织屏障。

应当理解的是，前述对实施方式的描述仅是以实施例的方式给出，且本领域技术人员可进行各种修改。以上说明书、实施例及实验结果提供本发明的例示性实施方式的结构与用途的完整描述。虽然上文实施方式中揭露了本发明的各种具体实施例，然其并非用以限定本发明，本领域技术人员在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随权利要求书所界定者为准。