阅读说明：本技术 一种内源性h2s检测的电化学传感器的构建方法及其应用 (Construction method and application of electrochemical sensor for detecting endogenous H 2 S ) 是由 赵媛 柯伟 刘瀚 于 2019-09-12 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种内源性H_2S检测的电化学传感器的构建方法,属于电化学分析技术领域。本发明主要内容包括：制备rGO/Fe_3O_4/Cu_2O磁性纳米材料,并与H_2S反应生成具有空穴结构的硫铜化合物rGO/Fe_3O_4/Cu_2O-Cu_9S_8,利用rGO/Fe_3O_4/Cu_2O-Cu_9S_8电化学信号弱的特点,构建了以rGO/Fe_3O_4/Cu_2O和H_2S(NaHS)为体系的电化学传感器,该传感器具有检测限低、准确度高等优点,在内源性H_2S的检测方面具有很好的应用前景。(the invention provides a method for constructing an electrochemical sensor for endogenous H 2 S detection, which belongs to the technical field of electrochemical analysis and mainly comprises the steps of preparing a rGO/Fe 3 O 4 /Cu 2 O magnetic nano material, reacting the magnetic nano material with H 2 S to generate a sulfur copper compound rGO/Fe 3 O 4 /Cu 2 O-Cu 9 S 8 with a cavity structure, and constructing the electrochemical sensor taking rGO/Fe 3 O 4 /Cu 2 O and H 2 S (NaHS) as a system by utilizing the weak electrochemical signal characteristic of rGO/Fe 3 O 4 /Cu 2 O-Cu 9 S 8 .)

一种内源性H2S检测的电化学传感器的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于电化学分析技术领域，尤其是涉及一种内源性H₂S检测的电化学传感器的构建方法。

背景技术

自然环境中的硫化氢气体是一种高危气体，在化学功能方面硫化氢是一种酸性腐蚀气体，在物理方面是一种易爆易燃气体，在生物方面是一种神经麻醉剂，导致人休克。但是，在生物体内，硫化氢已被证明对维持机体健康和处理疾病方面具有许多重要的作用。生物体内的H₂S主要由胱硫醚-β-合成酶(CBS)，胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)，真菌/酵母巯基丙酮酸硫基转移酶(3-MST)三种酶催化胱氨酸(Cys)产生的。在正常的生物系统中，H₂S的存在有助于维持健康平衡的生理活动，但是一旦H₂S在生命体内的含量失衡，就标志着某些疾病的发生，例如***、结肠癌以及一些肺部疾病等。因此，大量研究人员将H₂S作为某种生物指标去衡量健康状态，从而，对H₂S的检测尤为重要。

目前现有的检测方法主要有荧光法，色谱法，表面增强拉曼散射光谱法等，但是，这些法存在检测受环境影响大，检测仪器昂贵，操作繁琐等缺点。与这些检测方法相比较，电化学方法由于其灵敏度高、易操作、仪器简单等特点引起了人们的广泛关注。例如采用二茂铁，Ag NPs的作为电化学信标，通过硫氢化钠，硫化钠作为H₂S的替代物与信标发生化学反应从而影响电化学信号，来达到检测H₂S的目的。

在弱碱性的环境下，Cu₂O与H₂S发生氧化还原反应，生成具有空穴结构的硫铜化合物影响其电化学响应。同时，为了简化材料的收集以及电极的修饰过程，在传感器材料上映入了具有磁性的Fe₃O₄和可以改善电子传导的二维材料rGO，制备了rGO/Fe₃O₄/Cu₂O材料。利用其修饰传感器去检测外源性和内源性的H₂S得到的很好的应用。

发明内容

本申请针对现有技术的不足，本发明提供了一种内源性H₂S检测的电化学传感器的构建方法及其应用。本发明操作简易，绿色无污染，灵敏度高。

本发明的技术方案如下：

一种内源性H₂S检测的电化学传感器的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

(1)磁性还原氧化石墨烯(rGO/Fe₃O₄)的合成：

将还原氧化石墨烯加入乙二醇中，混合溶解后加入乙酰丙酮铁，并将混合液超声处理30-40min，随后加入1.4-1.6g的乙酸胺，搅拌30-50min后，将搅拌所得混合液转移到反应釜中，190-210℃反应22-26h，反应结束后冷却至室温，随后进行固液分离取固相，后用水和乙醇清洗固相，并用水重新将所得固相溶解分散，定容至浓度为2-4mg/mL，制得磁性还原氧化石墨烯溶液，即rGO/Fe₃O₄溶液；

(2)rGO/Fe₃O₄/Cu₂O溶液的合成：

将步骤(1)中所得rGO/Fe₃O₄溶液，加入到0.01-0.012g/mL的硝酸铜溶液中，超声处理30-40min，混合均匀，之后边搅拌边加入80-100μL 0.035-0.04mol/L的NaOH溶液，并持续搅拌30-50min，随后加入400-450mL 85-90mol/L的水合肼溶液并搅拌40-50min，随后固液分离取固相，将固相用水洗涤干燥，最后重新分散在水中，即得2-3mg/ml的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O溶液；

(3)MGCE电极预处理：

将直径为4-10mm的MGCE先后在粉末粒径为0.4-0.6mm和0.025-0.03mm的氧化铝粉上分别进行打磨，然后用乙醇和水清洗打磨后的电极，测裸电极的循环伏安曲线，当氧化峰和还原峰电位差小于90mV时即为打磨结束，之后再用乙醇和水清洗打磨后的电极，将清洗干净的电极用氮气或者氩气吹干待用；

(4)电化学传感器的构建：

取一定量步骤(2)所得的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O分散液，加入一系列不同浓度的NaHS和浓度为5-7wt％的氨水，反应一定时间，将反应后的磁性混合纳米材料用磁铁吸附住，去除上清液，从而将磁性混合纳米材料分离出来，并将磁性混合纳米材料重新溶解分散在超纯水中，然后取一定量所得溶液滴涂在步骤(3)中所得电极表面，对所得电极进行电化学扫描，记录信号变化，建立反应后磁性混合纳米材料的电化学信号和NaHS浓度间的标准曲线。

步骤(1)中所述还原氧化石墨烯的乙二醇溶液浓度为1-2w/v％，其中还原氧化石墨烯、乙酰丙酮铁与乙酸胺的质量比为30-60:15-35:100-180。

步骤(2)中还原氧化石墨烯分散液、硝酸铜溶液、NaOH溶液与水合肼溶液的体积用量比为0.2-1.2:5-15:0.04-0.16:200-600。

步骤(3)中所述电化学扫描的电压范围为-0.5v-0.3v。

步骤(4)中所述电化学传感器的构建，具体步骤如下：平行取5-12份20-30μL步骤(2)所得的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O分散液置于离心管中，并分别加入100-150μL不同浓度的NaHS溶液，同时加入20-30μL浓度为5-7wt％的氨水，反应50-70min，分别将反应后的磁性混合纳米材料分离出来，取出来以后分别重新分散在20-30μL超纯水中，然后取8-12μL所得分散液滴涂在步骤(3)中所得电极表面，进行电化学扫描，记录信号变化，建立磁性混合纳米材料的电化学信号和NaHS浓度间的标准曲线。

所述NaHS溶液的浓度范围为0.5-100000nM。

所述磁性混合纳米材料为rGO/Fe₃O₄/Cu₂O与rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈纳米材料的混合物。

一种内源性H₂S检测的电化学传感器，所述电化学传感器应用于内源性H₂S的检测。

本发明有益的技术效果在于：

1、在构建的电化学传感器中，所用的纳米材料成本低廉，且简单易得。

2、本发明的原理是，利用电活性材料rGO/Fe₃O₄/Cu₂O与NaHS发生氧化还原反应，生成具有空穴结构的硫铜化合物rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈，该硫铜化合物的电化学信号比rGO/Fe₃O₄/Cu₂O的电化学信号弱，反应过程中随着rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈的增多，rGO/Fe₃O₄/Cu₂O量减少，使得整体磁性混合纳米材料的电化学信号减弱，通过建立整体磁性混合纳米材料电化学信号和NaHS浓度间的标准曲线，最终以达到检测H₂S的目的，实验原理简单。

3、现有的检测H₂S方法主要为亚甲基蓝法(检测限大约为8μM，检测范围25μM-1000μM)，而与亚甲基蓝法相比，本电化学传感器的检测限为230pM，检测范围为500pM-500μM，由此可见本发明的检测限较低，检测范围广且灵敏度高。

4、本发明中通过引入Fe₃O₄，利用材料的磁性吸附在磁电极表面，极大地简化了电极修饰的步骤，减少了电极修饰的成本，同时降低了传统电极修饰过程的所带来的误差。同时，由于材料具有磁性，可以重复收集检测，检测结果的重现性高。

5、还原氧化石墨烯改善传感器的电子传导能力，使结果更准确。

附图说明

图1是实施例1制备所得中间产物rGO/Fe₃O₄/Cu₂O、反应最终混合物rGO/Fe₃O₄/Cu₂O和rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈磁性复合纳米材料的XRD图谱；

图2是实施例1制备所得中间产物rGO/Fe₃O₄/Cu₂O、反应最终混合物rGO/Fe₃O₄/Cu₂O和rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈磁性复合纳米材料的XPS图谱；

图3是实施例1中制备所得电化学传感器的交流阻抗图和循环伏安(CV)图；

图4是电化学传感器的DPV图谱和验证紫外图谱；

图5是实施例1制备得到的电化学传感器测得反应后的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O和rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈磁性混合纳米材料的电化学信号，随着NaHS浓度变化的DPV曲线图，以及在峰电流值与NaHS浓度对数值之间建立的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1：

(1)磁性还原氧化石墨烯(rGO/Fe₃O₄)的合成：

将0.45g还原氧化石墨烯加入乙二醇中，混合溶解后加入0.23g乙酰丙酮铁，并将混合液超声处理30min，随后加入1.49g的乙酸胺，搅拌30min后，将搅拌所得混合液转移到反应釜中，200℃反应24h；反应结束后冷却至室温，随后进行固液分离取固相，后用水和乙醇清洗固相，并用水重新将所得固相溶解分散，定容至浓度为3mg/mL，即得磁性还原氧化石墨烯(rGO/Fe₃O₄)溶液；

(2)rGO/Fe₃O₄/Cu₂O溶液的合成：

将步骤(1)中制备得到的1mL rGO/Fe₃O₄溶液加入到10mL浓度为0.01g/mL的硝酸铜溶液中，在室温下超声30min，使溶液充分混合均匀，结束超声。在搅拌的作用下，将80μL浓度为0.035M的NaOH溶液加入到混合体系中持续搅拌30min，接下来将400mL浓度为85mM的水合肼加入到溶液中，在室温下搅拌40min，随后固液分离取固相，将固相用水洗涤干燥，最后重新分散在水中，即得2mg/mL的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O溶液，并利用XRD扫描仪对rGO/Fe₃O₄/Cu₂O产物进行结构表征，结果见图1(1)。

(3)MGCE电极预处理：

将直径为4mm的MGCE先后在粉末粒径为0.5mm和0.03mm的氧化铝粉上分别进行打磨，然后用乙醇和水清洗打磨后的电极，测裸电极的CV曲线，当氧化峰和还原峰电位差为85mV时打磨结束，之后再用乙醇和水清洗打磨后的电极，将清洗干净的电极用氮气或者氩气吹干待用；

(4)电化学传感器的构建：

在已构建好的电化学传感器体系中，加入20μL步骤(2)所得的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O溶液，加入一系列不同浓度(0.5nM，1nM，10nM，100nM，1000nM，10000nM，100000nM)的NaHS和浓度为5wt％的氨水，反应50min，利用磁性将反应后的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O和rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈磁性复合纳米材料吸附分离出来，将所得混合纳米材料重新分散在超纯水中，取10μL所得分散液滴涂在步骤(3)中所得电极表面，对所得电极进行电化学扫描，记录信号变化，建立反应后的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O和rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈磁性混合纳米材料的电化学信号和NaHS浓度间的标准曲线，结果如图5所示，在500pM-500μM浓度范围内，随着NaHS的浓度的不断增大，rGO/Fe₃O₄/Cu₂O修饰电极的电化学信号逐渐降低。在峰电流和NaHS的浓度对数之间建立标准曲线，Ip＝5.96lg[NaHS]-61.61，其线性相关系数R²＝0.99275。利用检测空白组得出标准偏差乘3得出最低检测限为230pM。由此可见本发明所设计的电化学生物传感器对检测H₂S，不但具有较宽的检测范围，而且有较高的灵敏度。

实施例2

(1)磁性还原氧化石墨烯(rGO/Fe₃O₄)的合成：

将0.3g还原氧化石墨烯加入乙二醇中，混合溶解后加入0.15g乙酰丙酮铁，并将混合液超声处理40min，随后加入1.6g的乙酸胺，搅拌50min后，将搅拌所得混合液转移到反应釜中，210℃反应26h；反应结束后冷却至室温，接着进行固液分离，取固相，后用水和乙醇清洗固相，随后用水重新将固体溶解，将溶液定容至4mg/mL的溶液；

(2)rGO/Fe₃O₄/Cu₂O溶液的合成：

将步骤(1)中所得1mL磁性还原氧化石墨烯(rGO/Fe₃O₄)分散液，加入到0.012g/mL的硝酸铜溶液中，超声处理40min，混合均匀，之后边搅拌边加入100μL 0.04mol/L的NaOH溶液，并持续搅拌50min，随后加入450mL 90mol/L的水合肼溶液并搅拌50min，随后固液分离取固相，将固相用水洗涤干燥，最后重新分散在水中，即得3mg/mL的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O溶液；

(3)MGCE电极预处理：

将直径为10mm的MGCE先后在0.6mm和0.025mm的氧化铝粉上进行打磨，然后用乙醇和水清洗打磨后的电极，测裸电极的CV曲线，当氧化峰和还原峰电位差83mV时打磨结束。之后再用乙醇和水清洗打磨后的电极，将清洗干净的电极用氮气或者氩气吹干待用；

(4)电化学传感器的构建：

在已构建好的电化学传感器体系中，15μL步骤(2)所得的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O溶液，加入一系列不同浓度(0.5nM，1nM，10nM，100nM，1000nM，10000nM，100000nM)的NaHS和浓度为7wt％的氨水，反应60min，利用磁性将反应后的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O和rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈磁性复合纳米材料吸附分离出来，将所得磁性混合纳米材料重新分散在超纯水中，取8μL所得分散液滴涂在步骤(3)中所得电极表面，对所得电极进行电化学扫描，记录信号变化，建立反应后的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O和rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈磁性混合纳米材料的电化学信号和NaHS浓度间的标准曲线。

实施例3

(1)磁性还原氧化石墨烯(rGO/Fe₃O₄)的合成：

将0.6g还原氧化石墨烯加入乙二醇中，混合溶解后加入0.35g乙酰丙酮铁，并将混合液超声处理35min，随后加入1.4g的乙酸胺，搅拌40min后，将搅拌所得混合液转移到反应釜中，190℃反应22h；反应结束后冷却至室温，接着进行固液分离，取固相，后用水和乙醇清洗固相，随后用水重新将固体溶解，将溶液定容至2mg/ml的分散液，然后冷藏备用；

(2)rGO/Fe₃O₄/Cu₂O溶液的合成：

将步骤(1)中所得1mL磁性还原氧化石墨烯(rGO/Fe₃O₄)分散液，加入到0.011g/mL的硝酸铜溶液中，超声处理35min，混合均匀，之后边搅拌边加入90μL 0.037mol/L的NaOH溶液，并持续搅拌40min，随后加入430mL 87mol/L的水合肼溶液并搅拌45min，随后固液分离取固相，将固相用水洗涤干燥，最后重新分散在水中，即得2.5mg/mL的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O溶液；

(3)MGCE电极预处理：

将直径为6mm的MGCE先后在0.4mm和0.027mm的氧化铝粉上进行打磨，然后用乙醇和水清洗打磨后的电极，测裸电极的CV曲线，当氧化峰和还原峰电位差82mV时即为打磨结束，之后再用乙醇和水清洗打磨后的电极，将清洗干净的电极用氮气或者氩气吹干待用；

(4)电化学传感器的构建：

在已构建好的电化学传感器体系中，25μL步骤(2)所得的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O溶液，加入一系列不同浓度(0.5nM，1nM，10nM，100nM，1000nM，10000nM，100000nM)的NaHS和浓度为6wt％的氨水，反应40分钟，利用磁性将反应后的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O和rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈磁性复合纳米材料吸附分离出来，将所得磁性混合纳米材料重新分散在超纯水中，取13μL所得分散液滴涂在步骤(3)中所得电极表面，对所得电极进行电化学扫描，记录信号变化，建立反应后的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O和rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈磁性混合纳米材料的电化学信号和NaHS浓度间的标准曲线。

测试例

1，实施例1中制备得到中间产物rGO/Fe₃O₄/Cu₂O、反应最终混合物rGO/Fe₃O₄/Cu₂O和rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈磁性复合纳米材料的表征

A，利用XRD扫描仪对实施例1中制备得到的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O产物进行结构表征，结果见图1(1)，其中在X射线衍射图谱中，发现所得rGO/Fe₃O₄/Cu₂O中的Cu₂O峰与标准立方体的Cu₂O很好地匹配，初步说明反应后产物得到的是rGO/Fe₃O₄/Cu₂O；同时利用XRD扫描仪对实施例1步骤(4)中rGO/Fe₃O₄/Cu₂O与NaHS反应过后的反应产物进行结构表征，所得结果见图1(2)，其中，反应所得产物的X-射线衍射峰通过与标准的Cu₉S₈对比，发现所得反应产物中的峰与其匹配，初步可知得出反应后的样品为rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈。

B，同时，通过XPS测量研究了实施例1中制备得到的rGO/Fe₃O₄/Cu₂O和实施例1步骤(4)中反应得到的纳米材料rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈中元素的化学组成和化学状态的变化；如图2(1)、(2)所示，研究XPS图谱证实了与NaHS反应前复合材料中Cu元素和O元素的共存。从中的Cu _2p XPS图谱中，我们可以看出复合材料的XPS光谱在931.5eV和951eV出现两个峰，分别属于Cu_2p1/2和Cu_2p3/2，2p轨道的结合能基本与Cu⁺相匹配。此外，在530eV出现一个宽峰，与O的1s轨道结合能相匹配。在材料与NaHS反应后，进一步的研究复合材料的XPS，结果如图2(3)、(4)所示，XPS图谱显示复合材料中Cu元素，O元素和S元素的共存，这与XRD的结果相复合。从Cu _2p XPS图谱中可以看出，在933eV和954eV出现两个峰分别归属于Cu²⁺的Cu _2p3/2和Cu _2p1/2轨道结合能。在942.5eV和961.5eV的两个峰归属于Cu²⁺的卫星峰，位于931.1eV和950.4eV结合能的两个独立峰分别归因于Cu_2p3/2和Cu_2p1/2，它们对应于Cu⁺ _2p轨道结合能。在S_2p的XPS图谱中在159eV-162eV范围内出现了S元素的S_2p3/2和S_2p1/2而在167.8eV处的峰值指定为S^2-的氧化态轨道结合能。综上进一步的证明了反应后复合材料的组成为rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈。

2，为了达到电化学检测的目的，研究了反应前后材料的电化学性质，利用软件中的等效电路去处理交流阻抗数据得到传感器在0.1M[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液中的电子转移动力学图谱。如图3(1)所示，裸的MGCE呈现几乎平滑的直线，然而，MGCE/rGO/Fe₃O₄/Cu₂O可以观察到一个半弧形，说明rGO/Fe₃O₄/Cu₂O的存在阻碍了电子的传导，更进一步，与NaHS反应后，将材料修饰在电极表面发现其圆弧半径要大于rGO/Fe₃O₄/Cu₂O，说明rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈表面电荷的迁移率低于rGO/Fe₃O₄/Cu₂O。相应的，如图3(2)所示，不同修饰电极对应的循环伏安(CV)图，观察发现不同修饰电极的CV图变化与EIS的变化趋势相照应，证明rGO/Fe₃O₄/Cu₂O-Cu₉S₈的电化学信号比rGO/Fe₃O₄/Cu₂O弱。

3，电化学传感器的验证紫外图谱和DPV图谱

为了更加进一步的准确检测内源性硫化氢，记录了rGO/Fe₃O₄/Cu₂O与NaHS反应前后紫外吸收变化，其结果如图4所示，发现在电压为-0.1伏，rGO/Fe₃O₄/Cu₂O修饰的电极具有明显的DPV电流响应。rGO/Fe₃O₄/Cu₂O和500μM的NaHS反应过后，利用磁性分离材料，用超水洗涤材料去除未反应的S^2-，重新定容，修饰在电极表面在-0.5伏～0.3伏的扫描范围，扫描DPV，发现电化学信号发生了明显的下降。同时，利用紫外吸收光谱研究实施例1中rGO/Fe₃O₄/Cu₂O纳米材料与NaHS反应前后光学性质的变化，如图4(2)所示，与rGO/Fe₃O₄/Cu₂O在500nm处出现肩峰以及在及近红外区域(500-1000nm)具有向下倾斜曲线相比，与500nm的NaHS反应过后，混合物的吸收强度增大，同时随着波长的增加而表现出一种近红外区域的钩状吸收。