阅读说明：本技术 一种检测***根的近红外荧光探针的制备方法及应用 (Preparation method and application of near-infrared fluorescent probe for detecting selenious acid roots ) 是由 *** 张迪 刘继红 李漫 王铁良 王红旗 徐孟生 王允 曹成 王俊艳 郑嘉 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明属于亚硒酸跟(SeO<Sub>3</Sub><Sup>2-</Sup>)检测领域,涉及一种检测亚硒酸根的近红外荧光探针的制备方法及应用。通过催化剂EDC和DMAP对乙酰丙酸进行活化,该活化产物与丙二腈异佛尔酮类物质中间体1(2-[3-(4-羟基苯乙烯基)-5,5-二甲基-环己-2-烯-1-亚基]丙二腈)进行缩合酰化反应,得到一种基于丙二腈异佛尔酮类的化合物,该化合物在乙醇-水溶液中可以用做亚硒酸根的高选择性荧光探针,其荧光发射波长在650 nm以上,实现了近红外荧光光谱识别。结果表明：探针SeP1对亚硒酸根具有高效专一的选择性,具有较强的抗干扰能力。该探针对亚硒酸根的最低检测限为0.068μM,具有应用于环境中亚硒酸根的检测的实用价值。(The present invention belongs to selenious acid heel (SeO) 3 2‑ ) The detection field relates to a preparation method and application of a near-infrared fluorescent probe for detecting selenious acid roots. Activating levulinic acid by catalysts EDC and DMAP, and reacting the activated product with malononitrile isophorone intermediate 1 (2- [3- (4-hydroxystyryl) -5, 5-dimethyl-cyclohex-2-en-1-ylidene)]Malononitrile) to obtain a compound based on malononitrile isophorone which can be used as a high choice for selenite in ethanol-water solutionThe fluorescence emission wavelength of the sex fluorescent probe is above 650 nm, and near-infrared fluorescence spectrum recognition is realized. The results show that: the probe SeP1 has high-efficiency and specific selectivity on selenite and strong anti-interference capability. The lowest detection limit of the probe to selenite is 0.068 mu M, and the probe has practical value of being applied to detection of selenite in the environment.)

一种检测***根的近红外荧光探针的制备方法及应用

技术领域

本发明属于***跟（SeO₃ ^2-）检测领域，涉及一种检测***根的近红外荧光探针的制备方法及应用。

背景技术

硒是人体内必须的重要微量元素之一，参与合成人体内多种含硒酶和含硒蛋白，具有抗氧化、抗肿瘤等多种生理功能。由于硒的重要作用，人体适量补充硒能够起到防止器官老化与病变，延缓衰老、增强免疫力、抵抗有害重金属的作用。

硒在自然界有有机硒和无机硒两种存在形式。有机硒是硒通过生物转化与氨基酸结合形成，主要以硒代蛋氨酸的形式存在，参与生物体内蛋白的合成，发挥着抗氧化、增强人体免疫力的重要功能。无机硒主要是指硒酸钠和***钠，其生物有效性低，毒性较大，易造成环境污染。无机硒的毒性明显大于有机硒，而***盐的毒性略大于硒酸钠。因此对不同形态硒特别是无机硒的检测评价具有重要意义。

目前无机硒形态分析方法主要采取色谱分离与原子荧光技术联用的方法，但是该方法对仪器设备要求较高，对操作人员的技术水平要求苛刻，所需试剂昂贵，成本较高，不利于广泛推广。

近年来发展起来的有机荧光分子传感技术，因其高灵敏性、高选择性、无需分离、易于观测等优点而被应用于各种离子的检测，同时也成为了一个热门的研究领域。因此，设计荧光探针用来快速检测***跟变得非常有意义。荧光探针具有选择性好、灵敏度高、操作简便快速、对检测物损伤少等优点已被广泛应用于检测环境和生物体系中的金属阳离子、阴离子、生物体内活性小分子等方面。荧光探针检测法不仅弥补了传统分子、离子分析方法样品试剂量要求大、实时在线分析困难、步骤繁琐、不适合进行生物学及毒理学的研究等缺点，而且与传统检测方法相比表现出了更为吸引人的优点。在过去的几十年里，荧光探针的研究取得较大的发展；专利201510178114.X公开了一种丙二腈异佛尔酮类铜离子荧光探针及其制备方法，该探针可以在缓冲溶液中选择性的识别铜离子，表现为检测限低(仅为0.2µM)、大Stokes位移、荧光增强、长波长发射和可见光下变色，运用其荧光增强和可见光下变色可对铜离子进行裸眼检测；运用其对铜离子的荧光增强响应可以对铜离子进行定性或定量分析；但其主要是研究对阳离子-铜离子的定量和定性分析，且探针的最低检测限较高，其化学结构中的识别基团不能用于阴离子检测，所以并不能应用于阴离子***根的检测；专利201310125465.5中公开了检测硒酸根离子含量及在线还原为***根离子的方法，用以将六价的硒酸根离子在线还原为四价的***根离子，从而实现硒酸根离子高灵敏蒸气发生-原子荧光检测的液相色谱/离子色谱和原子荧光联用的形态分析方法，该专利是通过色谱法和原子荧光联用分析检测***根离子，该方法的检测限，远达不到在环境中检测***根的要求，且检测方法复杂，不利于实时快速检测，本发明采用的荧光探针分析法，对四价的***根离子进行直接检测，与上述专利方法有本质的不同；因此，开发用于高灵敏度和高选择性识别无机硒类的荧光探针的发展前景仍旧是巨大的挑战同时也会带来巨大的回报。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种检测***根的近红外荧光探针的制备方法及应用，通过催化剂EDC和DMAP对乙酰丙酸进行活化，该活化产物与丙二腈异佛尔酮类物质中间体1（2-[3-(4-羟基苯乙烯基)-5,5-二甲基-环己-2-烯-1-亚基]丙二腈）进行缩合酰化反应，得到一种基于丙二腈异佛尔酮类的化合物，该化合物在乙醇-水溶液中可以用做***根的高选择性荧光探针，其荧光发射波长在650 nm以上，实现了近红外荧光光谱识别。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种检测***根的近红外荧光探针分子，所述荧光探针结构式如下所示：

。

制备所述的检测***根的近红外荧光探针分子的方法，的合成路线如下：

。

制备步骤如下：

（1）将乙酰丙酸、EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和DMAP（4-二甲氨基吡啶）溶解于无水二氯甲烷溶液中，室温搅拌反应一段时间，得溶液Ⅰ；

（2）将中间体1（2-[3-(4-羟基苯乙烯基)-5,5-二甲基-环己-2-烯-1-亚基]丙二腈）溶解于无水二氯甲烷溶液中，得中间体1溶液，然后在室温条件下将中间体1溶液滴加到步骤（1）得到的溶液Ⅰ中，滴加完毕后反应一段时间，得溶液Ⅱ；

（3）将步骤（2）得到的溶液Ⅱ用饱和氯化钠溶液洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥、过滤，减压除去溶剂，经硅胶柱层析分离得到产物SeP1，即荧光探针分子。

所述步骤（1）中乙酰丙酸、EDC与DMAP的摩尔比为1:（0.5-4）:（0.1-2），室温搅拌反应的时间为10-60分钟。

所述步骤（2）中中间体1为2-[3-(4-羟基苯乙烯基)-5,5-二甲基-环己-2-烯-1-亚基]丙二腈，溶液Ⅰ中的乙酰丙酸与中间体1的摩尔比为1:（0.5-2），滴加完毕后反应的时间为8-24小时。

所述步骤（3）中硅胶柱分离采用体积比为1:（3-12）的乙酸乙酯和石油醚的洗脱液，产率为40-80%。

所述的近红外荧光探针分子在高灵敏、特异检测***根领域的应用。

本发明中制备荧光探针SeP1的过程中所使用的化学试剂、溶剂、金属离子等均阿拉丁试剂公司。在荧光探针SeP1的确证和性能测试过程采用Bruke公司DTX-400型核磁共振谱仪, 溶剂为氘代氯仿，以TMS为内标记录核磁共振氢谱和碳谱。采用Thermo公司的Q-Exactive HR-MS质谱仪记录高分辨质谱数据。采用日本日立公司F-7000荧光光谱仪记录荧光光谱。

本发明具有以下有益效果：

（1）本申请的荧光探针为基于丙二腈异佛尔酮类的化合物，中间体1（2-[3-(4-羟基苯乙烯基)-5,5-二甲基-环己-2-烯-1-亚基]丙二腈）结构中羟基裸露时具有强烈的荧光，当羟基被保护后几乎没有荧光。本发明采用乙酰丙基基团将中间体1结构中的羟基保护得到荧光探针SeP1, 当***根离子与乙酰丙基基团发生特异性反应后，生成并离去中间体2，从而使得结构中羟基脱保护重新生成中间体1，释放出强烈的荧光（具体机理图参见附图8）。通过高分辨质谱技术手段对上述反应机理进行了验证（如附图9所示），荧光探针SeP1识别***根后溶液的高分辨质谱测试结果为289.1347（[M-H⁺]^-），中间体1的负离子理论计算值为289.1341。该数据确证了附图8所示作用机理。

（2）本发明通过荧光光谱仪研究了探针SeP1在CH₃CH₂OH-H₂O溶液中与相关分析物的识别性能，在金属阳离子和常见阴离子存在时加入***根与单独加入***根时所得到的荧光强度(657 nm)基本相同，如图5所示，该结果表明探针SeP1对***根的检测具有较强的抗金属阳离子和常见阴离子干扰性能力，可以克服生物体和环境中复杂背景基质荧光的干扰。

（3）本发明采用荧光光谱仪来测定探针SeP1对***根的最低检出限，在CH₃CH₂OH-H₂O(1:1，v/v)溶液中，固定探针SeP1浓度为16.7 µM，测定其对不同浓度的***根的响应强度，随着***根浓度的增加，体系荧光强度不断增强（附图6），研究发现溶液荧光强度值在***根浓度为0-2.5当量间呈线性（R² = 0.985），根据IUPAC规则，经计算(3σ/k)得出该探针分子对亚硫酸氢根的检出限为0.068 μM，该测试结果表明探针SeP1具有应用于环境中***根的检测的实用价值，在环境和生物体系检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的荧光探针SeP1核磁共振氢谱图。

图2为本发明的荧光探针SeP1核磁共振碳谱图。

图3为本发明的荧光探针SeP1高分辨质谱图。

图4为本发明的荧光探针SeP1荧光选择性图，激发波长550 nm。

图5为本发明的荧光探针SeP1识别SeO₃ ^2-的抗干扰性图，激发波长550 nm，发射波长657 nm。

图6为本发明的荧光探针SeP1识别SeO₃ ^2-的荧光滴定图，激发波长550 nm。

图7为本发明的荧光探针SeP1识别SeO₃ ^2-的工作曲线图，激发波长550 nm，发射波长657 nm。

图8 为本发明的荧光探针SeP1识别SeO₃ ^2-的反应机理图。

图9 为本发明的荧光探针SeP1识别SeO₃ ^2-的反应机理高分辨验证图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

中间体1的制备方法为：

。

商品化的原料(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈（compound A，186 mg, 1mmol）和对羟基苯甲醛（244 mg, 2 mmol）溶解于6 mL的乙醇溶液中，分别将一到两滴哌啶和醋酸滴加到上述体系中，加热回流反应4小时，TLC监测反应完全后冷却至室温。将上述反应液倒入15毫升的冰水混合物中，有沉淀生成。将沉淀过滤出来并重新溶解于二氯甲烷中，柱层析分离得到黄色固体状的产物即为中间体1（203 mg），产率为70%。

实施例1

本实施例的检测***根的近红外荧光探针的制备方法，步骤为：

乙酰丙酸（116.0 mg 1.0 mmol）溶于10 mL无水二氯甲烷中，加入EDC (96 mg， 0.5mmol)和DMAP (12.2 mg，0.1 mmol)室温搅拌10分钟。将中间体1（145 mg, 0.5 mmol）溶解于10 mL无水二氯甲烷溶液中，室温条件下将其滴加入上述混合溶液中，滴加完毕后反应8小时，反应液用10 mL饱和氯化钠溶液洗涤3次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，用乙酸乙酯和石油醚作为洗涤剂（体积比为1:3），经硅胶柱层析分离得到77.6 mg产物SeP1，产率40%。

核磁共振测定：¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 1.10 (s, 6 H), 2.25 (s, 3 H),2.48 (s, 2 H), 2.62 (s, 2 H), 2.88 (m, 4 H), 6.86 (s, 1 H), 7.00 (q, J = 18.2Hz, 2 H), 7.15 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.53 (d, J = 8.4 Hz, 2 H); ¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz) δ 206.4, 171.3, 169.3, 153.6, 151.7, 135.9, 133.4, 129.3,128.6, 123.7, 122.2, 113.5, 112.7, 78.9, 43.0, 39.2, 37.9, 32.1, 29.9, 29.7,28.2, 28.0。核磁共振氢谱图如图1所示，核磁共振碳谱图如图2所示。

高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd for C₂₄H₂₄N₂O₃：388.1787, found 387.1709[M-H⁺]^-。高分辨质谱图如图3所示。

实施例2

本实施例的检测***根的近红外荧光探针的制备方法，步骤为：

乙酰丙酸（116.0 mg 1.0 mmol）溶于10 mL无水二氯甲烷中，加入EDC (192 mg，1mmol)和DMAP (61 mg，0.5 mmol)室温搅拌20分钟。将中间体1（290 mg, 1 mmol）溶解于15mL无水二氯甲烷溶液中，室温条件下将其滴加入上述混合溶液中，滴加完毕后反应10小时，反应液用10 mL饱和氯化钠溶液洗涤3次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，用乙酸乙酯和石油醚作为洗涤剂（体积比为1:6），经硅胶柱层析分离得到213.4 mg产物SeP1，即荧光探针，产率55%。

荧光探针的核磁共振测定：¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 1.10 (s, 6 H), 2.25(s, 3 H), 2.48 (s, 2 H), 2.62 (s, 2 H), 2.88 (m, 4 H), 6.86 (s, 1 H), 7.00(q, J = 18.2 Hz, 2 H), 7.15 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.53 (d, J = 8.4 Hz, 2 H);¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ 206.4, 171.3, 169.3, 153.6, 151.7, 135.9, 133.4,129.3, 128.6, 123.7, 122.2, 113.5, 112.7, 78.9, 43.0, 39.2 37.9, 32.1, 29.9,29.7, 28.2, 28.0；核磁共振氢谱图如图1所示，核磁共振碳谱图如图2所示。

高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd for C₂₄H₂₄N₂O₃：388.1787, found 387.1709[M-H⁺]^-；高分辨质谱图如图3所示。

实施例3

本实施例的检测***根的近红外荧光探针的制备方法，步骤为：

乙酰丙酸（116.0 mg 1.0 mmol）溶于10 mL无水二氯甲烷中，加入EDC (384 mg，2mmol)和DMAP (122 mg，1 mmol)室温搅拌20分钟。将中间体1（435 mg, 1.5 mmol）溶解于15mL无水二氯甲烷溶液中，室温条件下将其滴加入上述混合溶液中，滴加完毕后反应15小时，反应液用10 mL饱和氯化钠溶液洗涤3次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，用乙酸乙酯和石油醚作为洗涤剂（体积比为1:10），经硅胶柱层析分离得到252.2 mg产物SeP1，即荧光探针，产率65%。

核磁共振测定：¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 1.10 (s, 6 H), 2.25 (s, 3 H),2.48 (s, 2 H), 2.62 (s, 2 H), 2.88 (m, 4 H), 6.86 (s, 1 H), 7.00 (q, J = 18.2Hz, 2 H), 7.15 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.53 (d, J = 8.4 Hz, 2 H); ¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz) δ 206.4, 171.3, 169.3, 153.6, 151.7, 135.9, 133.4, 129.3,128.6, 123.7, 122.2, 113.5, 112.7, 78.9, 43.0, 39.2 37.9, 32.1, 29.9, 29.7,28.2, 28.0。核磁共振氢谱图如图1所示，核磁共振碳谱图如图2所示。

高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd for C₂₄H₂₄N₂O₃：388.1787, found 387.1709[M-H⁺]^-。高分辨质谱图如图3所示。

实施例4

本实施例的检测***根的近红外荧光探针的制备方法，步骤为：

乙酰丙酸（116.0 mg 1.0 mmol）溶于10 mL无水二氯甲烷中，加入EDC (768 mg，4mmol)和DMAP (244 mg，2 mmol)室温搅拌60分钟。将中间体1（580 mg, 2 mmol）溶解于15mL无水二氯甲烷溶液中，室温条件下将其滴加入上述混合溶液中，滴加完毕后反应24小时，反应液用10 mL饱和氯化钠溶液洗涤3次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，用乙酸乙酯和石油醚作为洗涤剂（体积比为1:12），经硅胶柱层析分离得到310 mg产物SeP1，即荧光探针，产率80%。

核磁共振测定：¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 1.10 (s, 6 H), 2.25 (s, 3 H),2.48 (s, 2 H), 2.62 (s, 2 H), 2.88 (m, 4 H), 6.86 (s, 1 H), 7.00 (q, J = 18.2Hz, 2 H), 7.15 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.53 (d, J = 8.4 Hz, 2 H); ¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz) δ 206.4, 171.3, 169.3, 153.6, 151.7, 135.9, 133.4, 129.3,128.6, 123.7, 122.2, 113.5, 112.7, 78.9, 43.0, 39.2 37.9, 32.1, 29.9, 29.7,28.2, 28.0。核磁共振氢谱图如图1所示，核磁共振碳谱图如图2所示。

高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd for C₂₄H₂₄N₂O₃：388.1787, found 387.1709[M-H⁺]^-。高分辨质谱图如图3所示。

应用效果例

1 mM的探针溶液配制：准确称量相应探针(SeP1)，SeP1溶解在乙醇溶液中配制1 mM的溶液备用。

选择性实验：

专一的选择性是衡量荧光探针分子是否高效的重要标准。荧光光谱仪考察了探针SeP1对***根的专一选择性。如附图4所示，在550 nm处激发条件下，单独的探针探针SeP1(16.7 μM)在CH₃CH₂OH-H₂O(1:1，v/v)溶液中657 nm处具有微弱的荧光发射强度，当加入***根(10 eq.)后，在657 nm处的荧光发射强度明显增强，但是加入其它物质 (常见金属离子和阴离子10 当量) 后，溶液体系的荧光发射强度（F657）强度与单独探针体系的荧光发射（F657）强度相比没有明显变化。以上实验结果表明，该探针对***根具有较好的专一选择性，并能实现比率检测。

荧光干扰性实验：

为了测试探针分子对***根检测的抗干扰能力，在荧光发射光谱中测试了其抗金属阳离子和常见阴离子干扰性。如附图5所示，在SeP1 (16.7 μM)在CH₃CH₂OH-H₂O(1:1，v/v)溶液中分别加入测试的各种金属阳离子和常见阴离子(10当量)测试其荧光发射强度（657nm），然后再向上述溶液中分别加入10当量的***根溶液，由附图5可知，在金属阳离子和常见阴离子存在时加入***根与单独加入***根时所得到的荧光强度(657 nm)基本相同，该结果表明探针SeP1对***根的检测具有较强的抗金属阳离子和常见阴离子干扰性能力。

最低检出限实验：

良好的检测限是检验一个探针分子是否具有应用价值的标准之一。采用荧光光谱仪来测定探针SeP1对***根的最低检出限，在CH₃CH₂OH-H₂O(1:1，v/v)溶液中，固定探针SeP1浓度为16.7 µM，测定其对不同浓度的***根的响应强度，随着***根浓度的增加，体系荧光强度不断增强（附图6），研究发现溶液荧光强度值在***根浓度为0-2.5当量间呈线性（R² = 0.985），根据IUPAC规则，经计算(3σ/k)得出该探针分子对亚硫酸氢根的检出限为0.068 μM。该测试结果表明探针SeP1具有应用于环境中***根的检测的实用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。