一种六盘山黄牛circR-UQCC1基因及其过表达载体、构建方法和应用
阅读说明：本技术 一种六盘山黄牛circR-UQCC1基因及其过表达载体、构建方法和应用 (CircR-UQCC1 gene of Lianshan cattle, over-expression vector, construction method and application thereof ) 是由 蔡翠翠 王健 李玉莲 万鹏 谢建亮 杨雪瑶 李毓华 余治家 贾宝光 佘萍 王维 于 2019-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种六盘山黄牛circR-UQCC1基因及其过表达载体、构建方法和应用,属于基因工程技术领域,本发明首次公开了环状的六盘山黄牛circR-UQCC1基因,并构建了能够表达六盘山黄牛circR-UQCC1基因的重组过表达载体,本发明所构建的载体,转染原代培养的牛肌肉细胞后,可获得circR-UQCC1 mRNA的高效表达,为circR-UQCC1基因功能鉴定和改造细胞,调控代谢和生长发育奠定了基础。(The invention discloses a circR-UQCC1 gene of a six-disc yellow bull, and an overexpression vector, a construction method and application thereof, belonging to the technical field of genetic engineering, and the invention discloses a circular circR-UQCC1 gene of the six-disc yellow bull for the first time, and constructs a recombinant overexpression vector capable of expressing the circR-UQCC1 gene of the six-disc yellow bull, and the constructed vector can obtain high-efficiency expression of the circR-UQCC1 mRNA after transfecting primary cultured bovine muscle cells, thereby laying a foundation for function identification and cell modification of the circR-UQCC1 gene, regulation of metabolism and growth and development.)
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种六盘山黄牛circR-UQCC1基因及其质粒型过表达载体pcD2.1-circR-UQCC1、构建方法和应用。
背景技术
目前，表观遗传学已经成为解析生长发育、癌症发展治疗、免疫应答等生命活动的重要研究方向。非编码RNA的调控是表观遗传调控的一种方式。环状RNA是一类不具有5’端帽子和3’端poly尾巴结构的共价闭合环状非编码RNA分子。近年来随着生物信息学的快速发展和高通量测序技术的不断革新，目前已经在真核细胞中发现了大量内源性结构稳定、丰度高且呈现出时空表达特异性的circRNA，说明circRNA可能在调控基因表达过程中发挥着重要作用。环状RNA的体外表达是试验研究其功能的前提。
而为实现环状RNA的过表达，目前已开发出许多质粒载体可实现环状RNA的过表达，其关键是在于成功的将目的基因的编码区整合到载体上。pcD2.1载体是一种表达环状RNA的载体之一，CMV promoter强启动子调控外源基因表达。载体拷贝数很高，表达量也很高。带绿色荧光标记，没有携带tag。Amp+原核筛选抗性，Neo+真核筛选抗性，可以利用G418筛选稳定细胞株。其质粒载体大小7.9Kb。有多克隆位点区，含限制酶BamH I和Kpn I酶切位点，即决定其可以通过双酶切法将目的基因整合到质粒载体上构建重组质粒。
在分子生物学实验中，一般都会使用两种不同的限制酶同时处理目的基因和载体，以防止目的基因和载体出现自连或反向连接的现象。通过双酶切来构建载体是其中常用的一种方法，这种方法利用限制性内切酶可以识别并切割特定的核苷酸的原理，用两种不同的限制性内切酶切割靶基因得到前后都带有粘性末端的靶基因片段，与同样经两种限制性内切酶切割得到的带有相同粘性末端的线性载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接，从而实现基因克隆。
环状RNA(circRNA)是新近发现的一类非编码RNA分子(部分circRNA可以翻译成小肽)。其特点是以5'封闭和3'尾终止，具有闭和的环状结构，这使得circRNA更加稳定。与其他ncRNAs相比，circRNA具有更强的RNase R的耐受性。根据环状RNA的来源，环状RNA可以分为三种类型，外显子circRNAs，内含子circRNAs和外显子-内含子circRNAs。一般而言，大多数外显子circRNA定位于细胞质中，并且可以作为微小RNA(miRNA)的海绵起作用以影响转录后调节，这意味着circRNA可以发挥竞争性内源RNA(ceRNA)的作用。例如，ciRS-7/CDR1as被认为是调节肝细胞癌的miR-7的抑制剂。CircRNAs广泛参与各种生命活动，如细胞增殖，分化，肌肉的发育，癌症的发生，免疫应答，等等。CircRNA在横纹肌中高度富集。最近的研究表明，circRNA作为一种新的调节网络，有助于骨骼肌发育，肌肉生成和再生等。据报道，猴肌肉中的一部分circRNA被显著抑制为肌肉衰老。Circ-ZNF609可以翻译成肽并调节肌细胞生成。因此，circRNA通过miRNA海绵和其他方式调节骨骼肌功能。然而，骨骼肌中大多数circRNA的功能和机制仍不清楚。
六盘山黄牛的circR-UQCC1基因位于13号染色体上，由泛醇-细胞色素c还原酶复合物组装因子1(ubiquinol-cytochrome c reductase complex assembly factor 1，UQCC1)基因的第5外显子、第6外显子、第7外显子经环化形成。高通量测序结果显示circR-UQCC1在成年六盘山黄牛时期特异表达，胚胎期几乎不表达。在线软件RNAhybrid预测circR-UQCC1能够吸附miR-186，而miR-186能够通过抑制肌细胞生成素促进成肌细胞分化，另外，miR-186能够抑制***癌细胞的增殖，这暗示circR-UQCC1很可能参与肌肉细胞的增殖和分化，进而影响肌肉的功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种六盘山黄牛circR-UQCC1基因及其过表达载体、构建方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种六盘山黄牛circR-UQCC1基因，该六盘山黄牛circR-UQCC1基因为环状DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还公开了含有上述的六盘山黄牛circR-UQCC1基因的质粒型过表达载体pCD2.1-circR-UQCC1。该质粒型过表达载体pCD2.1-circR-UQCC1中的circR-UQCC1基因连接于穿梭质粒CMV启动子之下，且在circR-UQCC1基因起始密码子前含有原核氨苄抗性基因。
本发明还公开了上述质粒型过表达载体pCD2.1-circR-UQCC1的构建方法，包括以下步骤：
(1)、用高保真酶PCR扩增circR-UQCC1基因编码区序列，PCR产物加A后纯化连接到pMD-19T载体，转化、涂板、挑单克隆、测序；重组质粒pMD-19T-circR-UQCC1和过表达载体pCD2.1质粒分别经Kpn I和BamH I双酶切，将circR-UQCC1基因编码区序列和pCD2.1质粒载体片段利用T4 DNA Ligase进行酶连反应，酶连产物转化E.coli DH5α感受态细菌，得到pCD2.1-circR-UQCC1重组质粒；
(2)、将重组质粒pCD2.1-circR-UQCC1转染至六盘山黄牛肌原代细胞，24h后检测circR-UQCC1基因的mRNA水平和蛋白水平变化，确定重组质粒是否构建成功。
具体地，PCR扩增circR-UQCC1后和pDNA2.1穿梭质粒经Kpn I和BamH I双酶切，凝胶回收试剂盒回收circR-UQCC1基因片段和pDNA2.1载体片段，回收的载体片段和目的基因片段T4 DNA Ligase进行酶连反应。酶连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂板，挑单克隆、送测序，将测序正确的菌液纯化试剂盒抽提pCD2.1-circR-UQCC1重组穿梭质粒，Kpn I和BamH I双酶切鉴定证明获得正确的pCD2.1-circR-UQCC1重组质粒。
本发明还公开了上述质粒型过表达载体pCD2.1-circR-UQCC1在鉴定六盘山黄牛circR-UQCC1基因功能中的应用。
具体地，将重组过表达质粒pCD2.1-circR-UQCC1转染牛原代肌肉细胞，检测过表达circR-UQCC1基因对牛肌肉细胞增殖分化和肌肉发育相关基因的表达量的影响，是本发明质粒型过表达载体pCD2.1-circR-UQCC1作为六盘山黄牛circR-UQCC1基因功能鉴定的应用。
本发明还公开了上述的质粒型过表达载体pCD2.1-circR-UQCC1在细胞改造中的应用。
具体地，六盘山黄牛circR-UQCC1基因的重组过表达质粒pCD2.1-circR-UQCC1，可用于转染牛肌肉细胞、脂肪细胞、293细胞、C2C12细胞、3T3L细胞等细胞系，检测其对相应细胞结构和功能的影响，是本发明质粒型过表达载体pCD2.1-circR-UQCC1作为细胞改造的应用。
本发明还公开了上述的质粒型过表达载体pCD2.1-circR-UQCC1在检测动物肌肉生长发育标志基因差异化表达情况的应用。
具体地，将重组质粒pCD2.1-circR-UQCC1转染牛原代肌肉细胞，经过实时定量PCR检测过表达circR-UQCC1基因对肌肉细胞增殖分化和肌肉发育标志基因(MyoD、MyoG、PCNA、CDK2、MYHC)在牛肌肉细胞中的差异表达情况，是本发明质粒型过表达载体pCD2.1-circR-UQCC1作为肌肉生长发育调控的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次公开了环状的六盘山黄牛circR-UQCC1基因，并构建了能够表达六盘山黄牛circR-UQCC1基因的重组过表达载体，本发明所构建的载体，转染原代培养的牛肌肉细胞后，可获得circR-UQCC1 mRNA的高效表达，为circR-UQCC1基因功能鉴定和改造细胞，调控代谢和生长发育奠定了基础。
附图说明
图1为本发明构建的六盘山黄牛circR-UQCC1基因的重组过表达载体结构示意图；
图2为pCD2.1-circR-UQCC1重组质粒PCR扩增电泳检测；
图3为pCD2.1-circR-UQCC1重组质粒Kpn I和BamH I双酶切鉴定；
图4为pCD2.1-circR-UQCC1重组质粒mRNA水平过表达效率检测；
图5为转染后对六盘山黄牛肌原代细胞增殖和分化标志基因mRNA检测；其中，(a)为PCNA，(b)为CDK2，(c)为MyoD，(d)为MyoG，(e)为MYHC。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
本发明提供的六盘山黄牛circR-UQCC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
参见图1，图1为本发明构建的含有上述的六盘山黄牛circR-UQCC1基因的质粒型过表达载体pCD2.1-circR-UQCC1的结构图，其是由六盘山黄牛circR-UQCC1基因通过双酶切法构建所得，该质粒型过表达载体pCD2.1-circR-UQCC1中的circR-UQCC1基因连接于穿梭质粒CMV启动子之下，且在circR-UQCC1基因前含有原核氨苄抗性基因。
以下结合具体试验例对本发明质粒型过表达载体pCD2.1-circR-UQCC1及其构建方法作进一步的说明。
实施例1：pCD2.1-circR-UQCC1重组过表达质粒的构建：
一、材料和方法：
1.1、仪器：
超净工作台、生化培养箱、基因扩增仪、PTC-200单槽梯度基因扩增仪、Heraeus冷冻高速离心机(德国)、Bio-Rad凝胶成像分析仪(USA)、CO2培养箱、HZS-H水浴振荡器(哈尔滨)、Eppendorf移液器、DYY-Ⅲ型稳压稳流电泳仪(北京六一)、DYY-Ⅲ31A和DYY-Ⅲ28D电泳槽(北京六一)、制冰仪、MDF-382E超低温冰箱(日本三洋)、Eppendorf台式高速离心机、Sartorious电子天平(德国)、常规冰箱等。
1.2、主要生化试剂和试剂盒：
Long Taq聚合酶、PrimeSTAR DNA聚合酶、DNA限制性内切酶(Kpn I和BamH I等)、胶原蛋白、胰蛋白酶、DNA Marker、DNA连接酶、Trizol、反转录试剂盒、表达载体(pMD-19T、pCD2.1)、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、胎六盘山黄牛血清、细胞培养基等。
1.3、培养基和抗性：
LB培养基：胰蛋白胨，酵母粉，NaCl，琼脂粉；
抗性：氨苄青霉素。
1.4、普通试剂：
肝素钠，Tris，EDTA，NaCl，NaOH，无水乙醇，醋酸钠，十二烷基磺酸钠(SDS)，抗生素，溴化乙锭(EB)，溴酚蓝，二甲基苯菁FF，乙酸，蔗糖，去离子甲酰胺，硝酸，盐酸，硝酸银，无水碳酸钠，硫代硫酸钠，甲醛，硼酸，琼脂糖，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Tris饱和酚(pH＝8.0)，氯仿，异戊醇，甘油，石蜡油。
1.5、六盘山黄牛pCD2.1-circR-UQCC1基因PCR引物的设计(引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)：
本研究参照GenBank公布的UQCC1 mRNA序列(NM_001076508)，设计引物：
上游引物:5'>GGGGTACCAAAATTAAGATTGCAGCCCTGCGC<3'；
下游引物:5'>CGGGATCCCCCCATGATTCTGCCACGCTGCTC<3'，
其中Kpn I，BamH I分别为上下游的酶切位点。
1.6、PCR扩增六盘山黄牛的circR-UQCC1基因片段：
(1)、PCR总反应体系为50μL，见表1：
表1本发明的PCR反应体系
(2)、PCR反应程序，见表2：
表2本发明的PCR反应程序
1.7、携带CIRCR-UQCC1基因的pMD-19T-circR-UQCC1重组质粒的构建：
由于使用高保真酶PrimeSTAR扩增的PCR产物不带A尾巴，无法进行TA克隆，所以扩增产物需做加A处理，才可以连到pMD-19T载体上；因此，对PCR扩增的circR-UQCC1基因片段进行加A反应后，反应体系如表3所示；
表3本发明的加A反应体系
注：反应条件为72度(建议水浴)，10分钟。
将PCR扩增的circR-UQCC1基因片段经加A反应后，与pMD-19T载体经T4 Ligase 16℃过夜连接，得到pMD-19T-circR-UQCC1重组质粒，后者转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选菌落扩增，质粒回收后Kpn I和BamH I双酶切鉴定。
Kpn I和BamH I酶切反应体系20μL，见表4：
表4本发明的Kpn I和BamHI酶切反应体系
注：酶切消化条件为37℃，3～10h。
1.8、携带Xba基因的pCD2.1-circR-UQCC1重组质粒的构建：
Kpn I和BamH I双酶切携带circR-UQCC1基因的pMD-19T-circR-UQCC1重组质粒和pCD2.1质粒，胶回收后T4 Ligase 16℃过夜连接，得到pCD2.1-circR-UQCC1重组质粒，将pCD2.1-circR-UQCC1重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选菌落扩增，质粒回收后Kpn I和BamH I双酶切鉴定。
连接体系25μL，见表5：
表5本发明的连接反应体系
注：条件为16℃，过夜。
2、结果：
2.1、circR-UQCC1基因PCR扩增结果：
以六盘山黄牛基因组DNA为模板，参考NCBI上公布的六盘山黄牛UQCC1基因序列(登录号：NM_001076508)设计引物。利用PrimeSTAR DNA聚合酶，成功扩增出circR-UQCC1，结果如图2所示，图2为PCR扩增的六盘山黄牛circR-UQCC1基因，其中，M为Marker IMarker，条带分别为100，200，300,400,500,600bp；N1、N2、N3为circR-UQCC1基因片段，大小为240bp。
2.2、pCD2.1-circR-UQCC1重组质粒酶切鉴定结果：
经过连接和扩繁，以Kpn I和BamH I双酶切pCD2.1-circR-UQCC1重组质粒，琼脂糖检测有240bp片段，证明成功获pCD2.1-circR-UQCC1阳性重组质粒，结果如图3所示，图3为pCD2.1-circR-UQCC1重组质粒双酶切鉴定：其中M为Marker I Marker，条带分别为100，200，300,400,500,600bp；N1、N2、N3为circR-UQCC1基因片段，大小为240bp，以及载体部分，约为7800bp。
实施例2：携带六盘山黄牛circR-UQCC1基因的重组pCD2.1-circR-UQCC1质粒转染原代培养的牛肌肉细胞：
本实施例的目的在于：将重组pCD2.1-circR-UQCC1质粒转染牛原代肌肉细胞，经过实时定量PCR检测过表达circR-UQCC1基因对肌肉细胞增殖分化和肌肉发育标志基因(MyoD、MyoG、PCNA、MYHC)在牛肌肉细胞中的差异表达情况。
1、牛肌肉细胞的原代培养
将胎牛置于操作盘中，以含有1％双抗的无菌PBS冲洗3遍，
沿着胎牛背脊切开表皮组织，剪出背肌于含有1％双抗PBS的6cm培养皿中，用剪刀尽量剪碎肌肉块，随后收集到50mL离心管中，
加入胶原酶Ⅰ，37℃水浴消化1.5h后，用200目尼龙网过滤，收集滤液于离心管中，1000r/min离心10min，去除上清液收集沉淀，沉淀即为细胞，
加含15％FBS及1％双抗DMEM完全培养基重悬细胞，通过细胞计数，按比例接种细胞悬液于6cm培养皿中，37℃，5％CO2培养箱中培养2h后，
吸取上层培养液于新的6cm培养皿中继续培养，至细胞密度达到80％～90％左右，细胞传代或冻存以备后续试验用。
2、circR-UQCC1重组过表达载体转染原代细胞后的qRT-PCR检测
当培养的牛原代肌肉细胞密度达到60％，加入脂质体包裹的载体质粒转染细胞。细胞转染后24h时，qRT-PCR检测证明，与阴性对照相比(阴性对照为空质粒载体，没有携带circR-UQCC1基因)，pCD2.1-circR-UQCC1基因mRNA的表达量明显增加，过表达效率接近30倍(图4)，并检测增殖分化时期标志基因变化以及诱导分化4天后检测分化标志基因的变化，qRT-PCR结果如图5所示，其中，促增殖基因PCNA(a)、CDK2(b)表达量显著上调，说明circR-UQCC1能够促进肌肉细胞的增殖；促分化基因MyoD(c)、MyoG(d)和MYHC(e)表达量均显著下降，说明circR-UQCC1能够抑制肌肉细胞的分化。
本发明能够克隆六盘山黄牛pCD2.1-circR-UQCC1基因并构建真核过表达载体，具有可应用于六盘山黄牛pCD2.1-circR-UQCC1基因功能研究、鉴定和调控肌肉生长发育相关基因的代谢。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
序列表
<110> 宁夏农林科学院固原分院
<120> 一种六盘山黄牛circR-UQCC1基因及其过表达载体、构建方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaattaaga ttgcagccct gcgcatgtat accagctgtg tggagaaaac tgacttcgag 60
gaattctttc taaggtgtca gatgcctgat acattcaatt catggtttct tataactctg 120
cttcatgtct ggatgtgtct agtccgaatg aagcaggaag gccggagtgg gaaatacatg 180
tgtcgtatca tagttcattt tatgtgggag gatgttgagc agcgtggcag aatcatgggg 240