草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD在提高微生物耐胁迫能力中的应用
阅读说明：本技术 草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD在提高微生物耐胁迫能力中的应用 (Application of straw mushroom manganese superoxide dismutase VMn-SOD in improving stress tolerance of microorganisms ) 是由 赵妍 杨焕玲 陈明杰 游华芳 余昌霞 李正鹏 奚莉萍 冯爱萍 于 2019-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD在提高微生物耐胁迫能力中的应用,所述的草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过将草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD基因转入适合的微生物宿主体内,使宿主表达锰超氧化物歧化酶,从而提高宿主的耐热胁迫能力、耐冷胁迫能力及耐盐胁迫能力。本发明的草菇过氧化氢酶VCAT来源于真菌,转入适合的微生物宿主中,能够提高宿主的耐温度胁迫及盐胁迫的能力。(The invention discloses an application of straw mushroom manganese superoxide dismutase VMn-SOD in improving the stress tolerance of microorganisms, wherein the amino acid sequence of the straw mushroom manganese superoxide dismutase VMn-SOD is shown as SEQ ID NO.1, and the nucleotide sequence of the coding gene thereof is shown as SEQ ID NO. 2. The volvariella volvacea manganese superoxide dismutase VMn-SOD gene is transferred into a proper microbial host to enable the host to express the manganese superoxide dismutase, so that the heat stress resistance, the cold stress resistance and the salt stress resistance of the host are improved. The straw mushroom catalase VCAT is derived from fungi, is transferred into a suitable microbial host, and can improve the temperature stress resistance and salt stress resistance of the host.)
技术领域
本发明属于抗氧化酶技术领域，涉及一种草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD在提高微生物耐胁迫能力中的应用。
背景技术
草菇[Volvariella volvacea(Bull.)Singer]是一种原产于中国热带、亚热带地区的美味食用菌，隶属于担子菌纲、伞菌目、光柄菇科、小包脚菇属，其菌丝体的最适生长温度为32-35℃。由于草菇属高温菇种，其菌丝体或子实体在常规0-4℃的冷藏条件下便会出现低温自溶现象，表现为组织***、液化、腐烂等。草菇这种不耐低温的特性，严重影响了其菌种的低温保藏、子实体的采后贮藏与运输，阻碍了草菇产业的快速发展。
生物在受到热胁迫时，破坏了活性氧的动态平衡，细胞内ROS过量积累并产生毒害，及时清除细胞内的多余ROS是非常必要的。生物体通常具有清除ROS的酶促清除机制和非酶促清除机制。超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，抗坏血酸过氧化物酶(APX)，谷胱甘肽还原酶(GR)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等属于酶促机制。抗氧化酶系统中最先清除ROS的酶是SOD。SOD可以根据不同的金属辅酶因子分为Cu/Zn-SOD，Mn-SOD和Fe-SOD三类。Fe-SOD主要存在于原核细胞及一些植物中；Cu/Zn-SOD主要存在于真核细胞细胞浆内、叶绿体和过氧化物酶体内；而Mn-SOD主要存在于真核细胞线粒体和原核细胞内。在逆境胁迫的作用下，SOD催化O2·-发生歧化作用变为H2O2和O2，从而移除O2·-，降低产生OH·的几率。生物受逆境胁迫时，位于线粒体内的Mn-SOD作为清除超氧阴离子的第一道防线，在生物体内的表达和调控对于机体的氧化还原稳态的维持起着十分重要的作用。
在农业上，研究发现Mn-SOD能够提高农作物的抗逆性，如抗寒、抗旱等特性。Bowler C等人通过转基因的方法，使烟草和玉米植株表达Mn-SOD水平提升，发现Mn-SOD在烟草和玉米叶绿体中的过量表达能够增强转基因烟草和玉米对质膜的保护作用和对除草剂引起的氧胁迫的耐受性(Bowler C,Slooten L,Vandenbranden S,et al.Manganesesuperoxide dismutase can reduce cellular damage mediated by oxygen radicalsin transgenic plants[J].Embo Journal,1991,10(7):1723-1732.)；饶丽莎等研究发现，杉木在低温、干旱、铝、盐胁迫等逆境条件下均能快速诱导Mn-SOD的表达(饶丽莎,王培,张家君,等.不同逆境胁迫下杉木Mn-SOD基因表达[J].东北林业大学学报,2018,46(6):19-22.)。邓婷婷等用盐生杜氏藻Mn-SOD基因的表达载体转染SOD缺陷型大肠杆菌并诱导其表达后，发现该大肠杆菌在耐盐、耐辐射和抗寒方面的耐受性均有明显提高(邓婷婷.盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的基因克隆、表达与功能研究[D].成都:四川大学,2007.)。上述研究中采用的SOD均来源于动植物或微藻，目前未见对食用菌中锰超氧化物歧化酶的相关研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD在提高微生物耐胁迫能力中的应用。将该草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD的核苷酸序列转入宿主体内，通过使宿主表达锰超氧化物歧化酶，从而提高宿主的耐热胁迫能力、耐冷胁迫能力及耐盐胁迫能力。
本发明提供草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD在提高微生物耐胁迫能力中的应用。本发明中所述的微生物可以为真菌或者细菌。在本发明
具体实施方式
中，采用的微生物为大肠杆菌。本发明所述的耐胁迫能力包括耐热胁迫能力、耐冷胁迫能力及耐盐胁迫能力。
本发明的草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
具体地，通过将含草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD基因的表达载体转入到微生物宿主细胞中，提高微生物的耐胁迫能力。
本发明的草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在本发明的具体实施方式中，所述的含草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD基因的表达载体为pBAR GPE1/VMn-SOD，通过将含草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD基因的核苷酸片段与经BamH I和EcoRI双酶切后的pBAR GPE1质粒连接构建得到。
在本发明的具体实施方式中，通过将含草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD基因的表达载体pBAR GPE1/VCAT转入到大肠杆菌中，提高大肠杆菌的耐热胁迫能力、耐冷胁迫能力及耐盐胁迫能力。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明通过将草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD基因转入适合的微生物宿主体内，使宿主表达锰超氧化物歧化酶，提高宿主的耐热胁迫能力、耐冷胁迫能力及耐盐胁迫能力。实验证明转入草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD基因的大肠杆菌，过量表达锰超氧化物歧化酶后获得了耐热胁迫能力、耐冷胁迫能力及耐盐胁迫能力的提高。本发明的草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD来源于真菌，由于真菌和细菌共使用同一套密码子，将其转入适合的微生物宿主中，提高宿主的耐胁迫能力。
附图说明
图1为过表达载体pBAR GPE1图谱；
图2为草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD的信号肽预测结果图；
图3为草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD的磷酸化位点预测结果图；
图4为草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD的跨膜结构预测结果图；
图5为pBAR GPE1/VMn-SOD重组质粒PCR鉴定电泳图谱；
图6为pBAR GPE1/VMn-SOD重组表达蛋白产物的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1是未用IPTG诱导，含有pBAR GPE1空载体对照组大肠杆菌表达蛋白产物的电泳图谱；泳道2是经IPTG诱导后，含有pBAR GPE1空载体对照组大肠杆菌表达蛋白产物的电泳图谱；泳道3是蛋白Marker；泳道4是未用IPTG诱导，含有pBAR GPE1/VMn-SOD重组质粒的大肠杆菌蛋白表达电泳图谱；泳道5是经IPTG诱导后，含有pBAR GPE1/VMn-SOD重组质粒的大肠杆菌蛋白的电泳图谱；
图7为热胁迫(50℃)下，转入草菇VMn-SOD基因前后的大肠杆菌生长速率比较；
图8为冷胁迫(4℃)下，转入草菇VMn-SOD基因前后的大肠杆菌生长速率比较；
图9为盐胁迫(1％)下，转入草菇VMn-SOD基因前后的大肠杆菌生长速率比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明以草菇菌株V23为材料，通过草菇基因组构建本地数据库，经本地Blast找到草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD基因保守序列，使用CE Design V1.04设计草菇VMn-SOD基因的引物，从草菇基因组DNA中扩增出VMn-SOD全基因片段，经PCR鉴定后，将目的片段与pBAR GPE1载体连接转化到大肠杆菌中，送交生工生物工程(上海)有限公司测序，片段长度为537bp，如SEQ ID NO.2所示，编码178个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示。
由生物信息学分析得知，草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD氨基酸数量为178，蛋白的分子量约为19.53kDa，等电点(pI,isoelectric point)为6.75；不稳定系数为33.84，属于稳定蛋白；疏水性系数为-0.204，表明该蛋白具有亲水性。经NetPhos 3.1软件预测得知(图3)，草菇VMn-SOD蛋白的Ser磷酸化位点为6个，Thr磷酸化位点为4个，Tyr磷酸化位点为3个。利用SignalP 5.0对草菇VMn-SOD进行了信号肽的预测(图2)，结果表明该蛋白信号肽的概率为0.0003，其他的概率为0.9997，因此可判断草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD不存在信号肽，不属于分泌蛋白。经EMBnet Tmpred跨膜结构预测可知(图4)，从N端开始首先是由内向外跨膜然后再由外向内跨膜，依次经过3次跨膜，从预测结果可知草菇VMn-SOD是一个双向跨膜蛋白，可能与膜定位和跨膜转运有关。
本发明将获得的草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD基因序列，如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与表达载体pBAR GPE1连接构建得到原核表达载体pBAR GPE1/Mn-SOD，转入大肠杆菌中，经IPTG诱导进行异源表达，提取表达蛋白经SDS-PAGE电泳分析，结果显示在15kDa-25kDa之间出现一条明显的蛋白条带，与预期结果吻合。
本发明对过表达草菇VMn-SOD的大肠杆菌经高温(50℃)、低温(4℃)盐胁迫(1％)处理后，通过对大肠杆菌生长速率的测定，结果均表明，草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD蛋白的异源表达可显著提高大肠杆菌的耐热、耐冷及耐盐的能力，分别如图7、图8和图9所示。
l.试验材料
1.1大肠杆菌菌株：Stbl3菌株。
1.2载体
表达载体为pBAR GPE1(购买于吉满生物科技有限公司)，全长5518bp，携带有氨苄青霉素(Amp)抗性基因。
2.试剂
表1 试剂及来源
3.仪器
表2 仪器及来源
4.常用溶液的配制
4.1氨苄青霉素储存液：
将l g氨苄青霉素溶解于10mL去离子水中，使终浓度达到100mg/mL，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃储存备用。
4.2IPTG：
将IPTG配制成24mg/mL(100mM)的水溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃储存备用。
4.3PBS缓冲液：
NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 1.76mmol/L，加蒸馏水定容至1000mL，调PH值至7.2-7.4。
4.4电极缓冲液(Running Buffer):
Tris 3.1g，甘氨酸18.8g，SDS l g，加蒸馏水水定容至1L。
实施例1草菇V23中锰超氧化物歧化酶VMn-SOD过表达载体pBAR GPE1/VMn-SOD的构建
首先通过目的片段草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD基因两端所含酶切位点将目的片段切出，将其连入同样经过酶切后的过表达载体pBAR GPE1上；然后将连接产物转入制备好的大肠杆菌Stbl3的感受态细胞，对长出的单克隆菌落送测序公司测序，比对正确的克隆即为构建成功的目的基因过表达载体pBAR GPE1/VMn-SOD。
1.载体pBAR GPE1的双酶切
(1)将含有pBAR GPE1载体的Stbl3菌液过夜培养，并取新鲜菌液3-5mL提取质粒。具体方法参考QIAGEN质粒小抽说明书。
(2)取1μg新鲜质粒，用限制性内切酶BamH I和EcoRI进行双酶切。酶切体系如下：
载体
1μg
green Buffer
3μL
BamH I
1.5μL
EcoRI
1.5μL
ddH2O
补足30μL
于37℃酶切约3h。
(3)将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，进行胶回收，步骤如下：在紫外灯下，切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100mg＝100μL来计算凝胶的体积，并加入1倍凝胶体积的Binging Solution置于65℃水浴锅内将凝胶彻底融化。期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。
(4)将上述液体全部转移到滤柱内，13000rpm离心30S(重复一次)。然后弃掉管内液体，向柱内加入500μL的WA Solution，13000rpm离心30S。弃掉管内液体，再向柱内加入500μL的Wash Solution，13000rpm离心30S(重复一次)。然后空离3min。将滤柱放置在一个新的1.5mL EP管中，室温晾干。最后在柱子内加入35μL的ddH2O，静置5min，13000rpm离心1.5min。为了提高回收率，可将溶解的DNA再次加入柱子内离心1min。弃掉柱子，即为回收的载体片段，并测定浓度。
2.含草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD基因的质粒的酶切
(1)将含VMn-SOD基因的质粒用限制性内切酶BamH I和EcoRI进行双酶切，酶切体系如下：
VMn-SOD质粒
0.7μg
green Buffer
5μL
BamH I
2.5μL
EcoRI
2.5μL
ddH<sub>2</sub>O
补足50μL
于37℃酶切约1h。
(2)将酶切产物进行琼脂糖电泳并回收目的片段，方法同上。
3.过表达载体与目的片段的连接
(1)测定回收载体pBAR GPE1和目的片段草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD的浓度，并按载体：目的片段＝1:7的摩尔比例计算载体和目的片段所需的体积比。
(2)过表达载体pBAR GPE1与目的片段草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD的连接。
连接体系如下：
于22℃连接60min。
4.转化
(1)将感受态细胞Stbl3置于冰上(4℃)待其自然解冻后，取10μL连接产物加入感受态细胞中于冰上(4℃)放置30min。
(2)之后于42℃水浴中热激90S，然后迅速置于冰上(4℃)放置2-3min。
(3)加入500μL不含抗生素的LB培养基，于37℃、225rpm下振荡培养45min。
(4)3000rpm离心2min，弃掉900μL的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有载体上对应抗性(氨苄)的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀(涂布器的温度不能太高，以免烫死菌体)，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。
5.测序
(1)挑取若干个单菌落，进行小量摇菌培养。
(2)进行PCR验证，挑选3个阳性克隆送公司测序。
引物序列如下：
VMn-SOD-F(SEQ ID NO.3):5'-ATGGCCCACACTCTCCCTG-3'；
VMn-SOD-R(SEQ ID NO.4):5'-TCAACTTACATCGGCCTTGACA-3'。
(3)经测序正确的菌液，按1:1的比例，向无菌的EP管加入浓度为15％的甘油和菌液，然后在-80℃的条件下保存。
实施例2草菇VMn-SOD基因的原核表达
1.接种含有pBAR GPE1/VMn-SOD的大肠杆菌Stbl3单菌落于100mL含有50μg/mLAmp的LB液体培养基中，在220rpm 37℃下培养至OD600达到0.6-0.8，然后使用浓度为1mM的IPTG加入到100mL液体LB中，在220rpm 37℃下继续培养4h，以达到优化诱导培养条件的目的。同时将空载体pBAR GPE1转化Stbl3作为对照。
2.提取原核表达蛋白质进行SDS-PAGE电泳
①蛋白样品制备
(1)取1mL步骤1的菌液加到100mL含有Amp的LB液体培养基中，37℃，220r/min培养2.5-3h，用紫外分光光度计检测待OD600达到0.4-0.6时，加入浓度为1mM的IPTG进行诱导；
(2)加入IPTG后，继续培养6h，将菌液转移到50mL无菌的离心管中，在4℃，5000r/min的条件下，离心10min；
(3)向无菌离心管中加入3mL的PBS，然后用枪头将菌体吸打混匀，加入2.4μLProtease Inhibitor Cocktail，保护蛋白免受损伤；加入200μL裂解液，-4℃静置30min；将破碎后的菌体，在4℃、8000r/min下离心10min；
(4)取离心后的上清50μL于无菌离心管中，加入12.5μL的5×蛋白LoadingBuffer，金属水浴100℃中煮10min，放于-80℃中保存。
②SDS-PAGE凝胶电泳
(1)准备好玻璃板，电泳架，电泳槽等用清水冲洗干净，用滤纸将玻璃板擦拭干净，然后安装好电泳装置；
(2)确定凝胶的浓度，按照试剂盒配置胶，配制浓度为15％的分离胶和3％的浓缩胶；待凝固后***梳子，置于37℃的恒温培养箱中30min，***时应小心以免产生气泡；
(3)待浓缩胶固定后，将梳子拔出，然后用双蒸水清洗胶板，将胶板固定在电泳槽中，向上下电泳槽中注入现配制的电泳缓冲液，检验电泳槽是否有泄漏；
(4)按照次序，依次在上样孔中注入20μL的蛋白样品；
(5)在浓缩胶时，电压为80V；分离胶电压为120V；
(6)电泳结束后，将胶置于干净的盒子中，加入考马斯亮蓝染液，染色60min；
(7)染色完毕后，将考马斯亮蓝染液置于回收瓶中；
(8)加入脱色液，覆盖凝胶表面，1h换次脱色液，直至凝胶透明，能够观察到清晰的蛋白质条带；
(9)对蛋白质凝胶拍照，然后进行结果分析。
电泳结果如图6所示，在接近20kDa处出现一条明显的蛋白条带，其表达量显著高于空载体对照组，表明草菇VMn-SOD在大肠杆菌中异源表达成功。
实施例3草菇VMn-SOD蛋白耐热功能的研究
1.吸取50μL验证正确的菌液，接种到含有Amp的50mL LB液体培养基中，37℃、150r/min培养2.5-3h，用紫外分光光度计检测待OD600达到0.4-0.6时，加入1mM的IPTG进行诱导；
2.置于到50℃的培养箱中，分别热激0min、30min、60min、90min和120min；
3.每隔30min取热激处理后的菌液3mL，用紫外分光光度计检测600nm下的吸光度，并记录数据。每个实验梯度设置3个重复。
4.分别以处理0min菌液OD600的吸光度作为对照组，计算其大肠杆菌生长速率，制作热胁迫后生长速率(注：生长速率＝处理大肠杆菌OD600/对照组OD600)折线图，如图7所示。
由图7可以看出，在热胁迫30min、60min、90min、120min时含有pBAR GPE1/VMn-SOD的大肠杆菌生长速率，分别比含pBAR GPE1空载体对照组大肠杆菌的生长速率提高了11.52％、12.43％、16.47％和18.06％，表明草菇锰过氧化物歧化酶VMn-SOD基因的导入及表达确实提高了大肠杆菌Stbl3的耐热性。
实施例4草菇VMn-SOD蛋白耐冷功能的研究
1.吸取50μL验证正确的菌液，接种到含有Amp的50mL LB液体培养基中，37℃、150r/min培养2.5-3h，用紫外分光光度计检测待OD600达到0.4-0.6时，加入1mM的IPTG进行诱导；
2.置于到4℃的培养箱中，冷胁迫2d、4d、6d、8d；
3.每隔2d取冷胁迫处理后的菌液3mL，用紫外分光光度计检测600nm下的吸光度，并记录数据。每个实验梯度设置3个重复。
4.分别以处理2d菌液OD600的吸光度作为对照组，计算其大肠杆菌生长速率，制作冷胁迫后生长速率折线图(注：生长速率＝处理大肠杆菌OD600/对照组OD600)，如图8所示。
由图8可以看出，冷胁迫6d、8d时，含有pBAR GPE1/VMn-SOD的大肠杆菌生长速率，分别比含pBAR GPE1空载体对照组大肠杆菌的生长速率提高了8.13％和8.74％，表明草菇锰过氧化物歧化酶VMn-SOD基因的导入及表达确实提高了大肠杆菌Stbl3的耐冷性。
实施例5草菇VMn-SOD蛋白耐盐功能的研究
1.吸取50μL验证正确的菌液，接种到盐浓度为1％含有Amp的50mL LB液体培养基中，37℃、150r/min培养2.5-3h，用紫外分光光度计检测待OD600达到0.4-0.6时，加入1mM的IPTG进行诱导；
2.置于到37℃的培养箱中，培养4h、8h、10h、12h、14h；
3.取盐胁迫处理后的菌液3mL，用紫外分光光度计检测600nm下的吸光度，并记录数据。每个实验梯度设置3个重复。
4.以处理4h菌液OD600的吸光度作为对照组，计算其大肠杆菌生长速率，制作盐胁迫后生长速率折线图，如图9所示(注：生长速率＝处理大肠杆菌OD600/对照组OD600)。
由图9可以看出，在1％盐胁迫过程中，含有pBAR GPE1/VMn-SOD的大肠杆菌生长速率，分别比含pBAR GPE1空载体对照组大肠杆菌的生长速率提高了23.90％、18.18％倍、20.29％和13.05％，表明草菇锰过氧化物歧化酶VMn-SOD基因的导入及表达确实提高了大肠杆菌Stbl3的耐盐性。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 草菇锰超氧化物歧化酶VMn-SOD在提高微生物耐胁迫能力中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 178
<212> PRT
<213> Volvariella volvacea
<400> 1
Met Ala His Thr Leu Pro Asp Leu Pro Tyr Asp Tyr Asn Ala Leu Glu
1 5 10 15
Pro Phe Ile Ser Glu Gln Ile Met Thr Leu His His Lys Lys His His
20 25 30
Gln Thr Tyr Val Asn Ala Leu Asn Ala Ala Glu Glu Ala Tyr Ala Arg
35 40 45
Ala Ser Thr Pro Lys Glu Arg Ile Ala Leu Gln Ala Ala Leu Lys Phe
50 55 60
Asn Gly Gly Gly His Ile Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Asn Leu Ala
65 70 75 80
Pro Ser Ser Ser Lys Gly Gly Asn Gly Gly Val Leu Lys Asp Gly Pro
85 90 95
Leu Lys Asp Ala Ile Ile Arg Ala Phe Gly Ser Val Glu Ala Phe Lys
100 105 110
Lys Glu Phe Asn Thr Thr Thr Ala Ala Ile Gln Gly Ser Gly Trp Gly
115 120 125
Trp Leu Gly Leu Asn Pro Ser Thr Lys Val Leu Glu Ile Val Thr Thr
130 135 140
Ala Asn Gln Asp Pro Leu Leu Thr His Ile Pro Ile Ile Gly Val Asp
145 150 155 160
Ile Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu Gln Tyr Leu Asn Val Lys Ala Asp
165 170 175
Val Ser
<210> 2
<211> 537
<212> DNA
<213> Volvariella volvacea
<400> 2
atggcccaca ctctccctga tctcccatac gactacaatg ctctcgagcc cttcatctcg 60
gagcagatca tgaccctgca ccacaagaaa caccatcaga cttacgtcaa tgccctcaat 120
gcagccgagg aggcatacgc aagggcttcc acccctaagg agcgcatcgc cctccaggct 180
gctctcaagt tcaacggtgg tggacacatc aaccactccc tcttctggaa gaaccttgcc 240
ccctcctcca gcaagggcgg caacggtggt gttctcaagg atggcccctt gaaggacgct 300
atcattcgcg cattcggaag tgttgaggcc ttcaagaagg agttcaacac caccaccgct 360
gcgatccagg gttctggatg gggctggctc ggtcttaacc catccaccaa ggtcctcgag 420
atcgttacca ccgccaacca agaccctctc ctcacccaca tccccattat cggtgtcgac 480
atctgggagc acgccttcta cctccaatac ttgaatgtca aggccgatgt aagttga 537
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggcccaca ctctccctg 19
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcaacttaca tcggccttga ca 22