阅读说明：本技术 一种农杆菌介导的沟叶结缕草遗传转化方法 (Agrobacterium-mediated genetic transformation method for zoysia matrella ) 是由 王凯 曲爱爱 刘建秀 李建建 郭海林 李晓慧 宗俊勤 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种根癌农杆菌介导沟叶结缕草的遗传转化方法,包括菌液浓度、侵染时间、共培养时间、抗生素浓度、炼苗移栽和转基因植株的PCR检测等步骤。内容如下：最佳遗传转化体系为菌液OD<Sub>600</Sub>值为0.4,侵染30 min,共培养3 d后进行选择培养。特美汀在选择培养阶段最适抑菌浓度为250 mg/L,潮霉素愈伤组织筛选的最适选择压为40 mg/L,生根筛选的最适浓度为15 mg/L。通过GUS活性的组织化学分析和PCR鉴定,显示目的基因已成功转入沟叶结缕草基因组中。上述研究将为沟叶结缕草基因功能研究和分子育种提供重要技术支撑。该方法优点在于：获得了一种稳定、高效的沟叶结缕草遗传转化体系,为其遗传改良提供便利,同时为其功能基因的验证打下关键的前期基础。(The invention discloses a genetic transformation method of agrobacterium tumefaciens mediated zoysia japonica ditch, which comprises the steps of bacterial liquid concentration, infection time, co-culture time, antibiotic concentration, hardening seedling transplantation, PCR detection of transgenic plants and the like. The contents are as follows: the optimal genetic transformation system is bacterial liquid OD 600 The value is 0.4, infection is carried out for 30 min, and selective culture is carried out after co-culture for 3 d. The optimum bacteriostatic concentration of the timentin in the selective culture stage is 250 mg/L, the optimum selection pressure of the hygromycin callus screening is 40 mg/L, and the optimum concentration of the rooting screening is 15 mg/L. Histochemical analysis and PCR identification of GUS activity show that the target gene has been successfully transferred into the zoysia japonica genome. The above study will be zoysia matrella baseProvides important technical support for functional research and molecular breeding. The method has the advantages that: a stable and efficient zoysia japonica ditch genetic transformation system is obtained, convenience is provided for genetic improvement, and a key early-stage basis is laid for verification of functional genes of zoysia japonica ditch genetic transformation system.)

一种农杆菌介导的沟叶结缕草遗传转化方法

技术领域

本发明涉及生物领域的遗传转化方法，特别涉及农杆菌介导的沟叶结缕草遗传转化方法。

背景技术

沟叶结缕草（Zoysia matrela）是禾本科（Gramineae）画眉草亚科（Choridoideae）结缕草属的多年生暖季型草坪草。具有叶片细长、草层密集、根系发达和绿期长等特点，同时也是最耐盐的盐生植物之一，多运用于城市绿化和运动场草坪及水土保持，在世界热带亚热带地区广泛应用。

随着生物技术的快速发展，转基因技术逐渐成熟，可将特定的目的基因进行遗传转化从而缩短育种周期。在众多植物转基因方法中，农杆菌介导法因转化效率高、易操作、低成本等优势成为首选方法。到目前为止，此方法在结缕草属植物上也取得成功。据报道，柴明良等首次通过农杆菌介导法将gus基因导入由日本结缕草种子诱导的胚性愈伤组织中并得到了转基因植株；王贺飞等和马彩云等分别利用农杆菌介导法将DREB基因转入松南结缕草与青岛结缕草；贺杰等与李瑞芬等各自通过农杆菌介导法将CBF1转入日本结缕草和中华结缕草。

然而，目前，有关沟叶结缕草遗传转化的研究报道极少，仅见于沟叶结缕草抗草甘膦遗传转化初步研究中，以沟叶结缕草7年龄的愈伤组织为材料，经农杆菌侵染后，在含有2mmol/L、3mmol/L和5mmol/L草甘膦的筛选培养基上各4周，再生16周，共得到54粒愈伤组织出现绿色小苗，但再生苗尚未鉴定,所以遗传转化体系并不完整。这大大限制了其分子育种的发展。因此在探究菌液浓度、侵染时间和共培养时间等因素对沟叶结缕草转基因效率的影响的基础上，建立高效、稳定的沟叶结缕草遗传转化体系，对研究其基因功能和育种改良方面具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种根癌农杆菌介导沟叶结缕草的遗传转化方法。该方法高效稳定，以沟叶结缕草匍匐茎诱导的胚性愈伤组织为转基因受体，建立其遗传转化体系。

本发明所提供的沟叶结缕草遗传转化建立的方法，包括如下步骤：

（1）愈伤组织的预培养（继代7年的从沟叶结缕草匍匐茎节中诱导的胚性愈伤组织）：选取淡黄色、结构紧凑、颗粒状的胚性愈伤组织，在继代培养基上培养7d，作为后续的材料；培养条件：25±2℃、24 h黑暗（湿度为44%）；

（2）农杆菌侵染液的制备：将-80℃用15%甘油保存的农杆菌菌液常温化冻后于含卡那霉素和利福平的YEP固体培养基划板培养，培养条件为28℃，48 h，挑取单克隆接种于5 mL农杆菌液体培养基震荡培养，培养温度为28℃，20-24 h震荡速度200~220 r/min，取上述培养的菌液800-1000 μl，加入到25 ml农杆菌液体培养基中，28℃ 220 rpm培养5-6 h，至农杆菌长到OD₆₀₀为0.4左右，于室温下4000 rpm，离心10 min。弃上清，加入等体积的侵染液重悬，配制成农杆菌侵染液（含100 μmol/ml AS），待用。

（3）转化：将步骤（1）预培养得到的胚性愈伤组织接入OD₆₀₀=0.4的目的农杆菌悬浮液中，侵染30 min，使农杆菌充分吸附到外植体上，将感染后的愈伤组织移至灭菌滤纸上，沥干残留的菌液，吸去表面液体后转入置于共培养培养基上，进行共培养2-3 d，

（4）诱导分化：将共培养后的愈伤组织用含Timentin的无菌水清洗1遍，再用无菌水清洗3~4次，转入愈伤组织筛选培养基于25℃黑暗培养20 d。将存活愈伤组织转入含250 mg/LTimentin分化培养基上生长，光照培养（放置于培养室中进行24 h 光照培养，光照强度为100 μmol/(m∙s)，25℃）直到愈伤组织分化。

（5）生根筛选培养和炼苗移栽：待不定芽长至2-4 cm时，转入生根筛选培养基，继续培养20 d，得到抗性再生苗后转入含250 mg/L Timentin生根培养基，待小苗长至10 cm左右时，炼苗3 d（打开瓶盖补充蒸馏水，25℃），自来水洗净根上的琼脂，移栽到穴盘中。

（6）GUS染色分析：将转化材料浸在GUS染色工作液中，锡箔纸包好37℃孵育1~24h，用70 %乙醇脱色1~3 h，在实体显微镜观察外植体染色情况。

（7）转基因植株的PCR检测：提取步骤（5）得到的阳性苗的基因组DNA，针对目的基因设计引物，采用PCR技术鉴定是否扩增出目的基因片段，若鉴定成功，即得到沟叶结缕草转基因植株。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明首次建立了一种沟叶结缕草的遗传转化体系方法，其优点在于（1）经过采用压力筛选培养基对抗性愈伤进行筛选和GUS鉴定对抗性植株进行筛选，简化了实验过程，大大减少了转化后的工作量。（2）利用传统的单子叶遗传转化方法，获得了稳定、高效的一种沟叶结缕草遗传转化体系方法。

附图说明

图1 特美汀抑菌浓度的确定

图2 潮霉素筛选浓度的确定

图3 不同农杆菌侵染条件对转化效率的影响

图4 转化材料GUS染色分析

图5 农杆菌介导的沟叶结缕草遗传转化及植株再生

图6 转基因抗性植株PCR检测

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。

1.1 方法

1.1.1 沟叶结缕草愈伤组织的诱导和继代培养

沟叶结缕草匍匐茎诱导产生胚性愈伤组织，愈伤组织诱导和继代培养参照柴明良等方法进行。

表1 植株再生和农杆菌培养的基本培养基

1.1.2 抗生素敏感性试验

特美汀（Timentin）抑菌浓度的确定：将经农杆菌菌液浸泡30 min的愈伤组织，分别接种于含0、100、150、200、250和300 mg/L Timentin的愈伤组织继代培养基上，每个梯度设置3个重复，观察抑菌情况。30 d后统计愈伤组织绿苗分化率，确定最适抑菌浓度。

潮霉素（Hyg）筛选浓度的确定：将沟叶结缕草胚性愈伤组织分别接种于含0、20、30、40和50 mg/L Hyg的继代培养基上，20 d后转至愈伤组织分化培养基，30 d后统计愈伤组织的绿苗分化率和成苗率，初步确定潮霉素愈伤组织筛选浓度。将愈伤组织分化的苗分别接种于含0、5、10、15和20 mg/L Hyg的生根培养基上，20 d后观察绿苗的存活率，初步确定潮霉素幼苗筛选浓度。在此基础上，将沟叶结缕草胚性愈伤组织经农杆菌侵染后，接种于含0、20、30、40和50 mg/L Hyg的继代培养基（含Timentin）上，20 d后转至分化培养基（含Timentin），30 d统计愈伤组织的绿苗分化率和成苗率。将经农杆菌侵染后的愈伤组织分化的苗分别接种于含0、5、10、15和20 mg/L Hyg的生根培养基上，20 d后观察绿苗的存活率，确定潮霉素幼苗筛选浓度。以上每个梯度均设置3个重复。

以上各因素均以愈伤组织的成苗率和再生苗存活率为评定标准。

成苗率（%）=分化苗数/愈伤组织总数×100；绿苗存活率（%）=绿苗数/总苗数×100。

1.1.3 农杆菌菌液的保存及培养与活化

将-80℃用15%甘油保存的农杆菌菌液常温化冻后于YEP+卡那霉素（Kana）50 mg/L +利福平（Rif）50 mg/L固体培养基划板培养，培养条件为28 ℃，48 h，挑取单克隆接种于5 mLYEP+50 mg/L Kana+ 50 mg/L Rif液体培养基震荡培养，培养温度为28℃，20-24 h震荡速度200~220 r/min，取上述培养的菌液800-1000 μl，加入到25 mL含YEP+ 50 mg/L Kana+50mg/L Rif液体培养基中，28℃ 220 rpm培养5-6 h，至农杆菌长到OD₆₀₀为0.5左右，将上述菌液25 mL加入到2个20 mL的离心管里，室温下4000 rpm，离心10 min。弃上清，向离心管加少量侵染培养基重悬沉淀，然后用侵染培养基稀释菌液至OD₆₀₀＝0.4左右（约109个/ml），加入100 μmol/ml AS用于侵染。

1.1.4 农杆菌介导的遗传转化、抗性愈伤的筛选和植株再生

参考张芳等、张丽等的方法，并加以改进。

转化前，取黄色颗粒状胚性愈伤组织，在继代培养基上预培养7 d。将愈伤组织置于农杆菌（菌液OD₆₀₀为0.4）悬浮液浸染30 min，于25℃黑暗培养3 d。将共培养后的愈伤组织用含250 mg/L Timentin的无菌水清洗1遍，再用无菌水清洗3~4次，转入含250 mg/LTimentin和40 mg/L Hyg愈伤组织筛选培养基于25℃黑暗培养20 d。将存活愈伤组织转入含200 mg/L Timentin分化培养基上生长，光照培养直到愈伤组织分化。切取长至2 cm左右的幼苗，转入含250 mg/L Timentin和15 mg/L Hyg苗筛选培养基，继续培养20 d，得到抗性再生苗后转入含250 mg/L Timentin生根培养基，待小苗长至10 cm左右时，打开瓶盖炼苗3d，自来水洗净根上的琼脂，移栽到穴盘中。

1.1.5 转化条件的改良

农杆菌菌液浓度的选择分别用OD₆₀₀为0.2、0.4、0.6和0.8的农杆菌悬浮液浸泡愈伤组织30 min，无菌滤纸沥干残留的菌液。共培养、筛选、分化和生根培养同上。通过GUS染色结果统计筛选后的阳性转化愈伤组织数量，每个梯度设置3个生物学重复。

农杆菌侵染时间的选择：用OD₆₀₀为0.4的农杆菌悬浮液浸泡愈伤，侵染时间分别设为10、20、30和40 min。共培养、筛选、分化和生根培养同上。通过GUS染色结果统计筛选后的阳性转化愈伤组织数量，每个梯度设置3个生物学重复。

共培养时间的筛选：用OD₆₀₀为0.4的农杆菌悬浮液侵染30 min，无菌滤纸沥干残留的菌液，置于愈伤继代培养基上25℃黑暗培养，时间分别设为1、2、3和4 d，筛选、分化和生根培养同上。通过GUS染色结果统计筛选后的阳性转化愈伤组织数量，每个梯度设置3个生物学重复。

转化效率（%）= GUS染色阳性数/筛选后的愈伤总数×100

1.1.6 GUS 染色分析

将转化材料浸在GUS染色工作液中，锡箔纸包好37℃孵育1~24 h，用70 %乙醇脱色1~3h，在实体显微镜观察外植体染色情况。

1.1.7 抗性植株的PCR检测

取潮霉素抗性植株及未转化植株的嫩叶，采用新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取基因组DNA。通过PCR扩增HPT基因，序列为：HPT-F：5'-GAAAAAGCCTGAACTCACCGC-3'；HPT-R：5'-TGCTCCATACAAGCCAACCAC-3'；预期片段大小为729 bp。以上述提取的沟叶结缕草基因组DNA为模板，表达载体pCAMBIA1305.2质粒DNA为阳性对照，未转基因的沟叶结缕草植株DNA为阴性对照进行PCR扩增。扩增体系为：12.5 μl Premix Taq，1 μl DNA模板，HPT-F和HPT-R（20 μmol/L）各1 μl，去离子水补足25 μl。扩增条件为：98℃预变性3 min；98℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。

1.2 数据统计分析

所有数据均用Microsoft office excel 2016进行处理，采用SPSS软件（v22.0）进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 特美汀抑菌浓度的确定

从图1可知，随着浓度升高，抑菌效果逐渐明显。当浓度为300 mg/L时虽能完全抑制农杆菌、生长，但愈伤组织的分化率仅为浓度250 mg/L的43.7%；而浓度200 mg/L时虽有59.7%的绿苗分化率，但抑菌效果不显著。为了有效抑制农杆菌的生长又不影响植株的再生，本试验在愈伤组织分化阶段选用250 mg/L Timentin抑制农杆菌过度生长。

2.2 潮霉素筛选浓度的确定

由图2可知，沟叶结缕草的愈伤组织和幼苗均对潮霉素敏感，潮霉素浓度分为50 mg/L和20 mg/L时愈伤组织成苗率和分化苗的存活率分别仅有3.7%和5.3%，愈伤组织分化及幼苗的生长受到严重抑制，理论上这是比较理想的筛选浓度。但从图可知，经农杆菌侵染后，在50 mg/L的潮霉素筛选压下，愈伤组织不能正常分化；在20 mg/L的潮霉素筛选压下，分化苗不能存活，这是因为农杆菌的侵染和特美汀的添加也对愈伤组织的生长和分化造成了一定的伤害。而潮霉素浓度分为40 mg/L和15 mg/L时，愈伤组织的成苗率为6.3% ，幼苗存活率为6.3%。因此，本试验中确定在愈伤组织生长阶段潮霉素筛选浓度为40 mg/L，幼苗的生长阶段潮霉素筛选浓度为15 mg/L。

2.3 转化条件对转化效率的影响

在农杆菌介导的遗传转化中，农杆菌菌液浓度、侵染时间和共培养时间均对转化率有显著的影响。从图3A可以看出，随着农杆菌菌液浓度升高，愈伤组织的转化效率有增加的趋势，当OD₆₀₀为0.4时，转化效率最高，达到56%；但是，随着菌液浓度增加，转化效率有降低的趋势，当OD₆₀₀为0.6~0.8时，转化效率均低于50%，由于农杆菌生长旺盛导致愈伤组织褐化致死，导致愈伤组织分化率降低。所以，OD₆₀₀为0.4是最适合的农杆菌菌液浸染浓度。

从图3B可以看出，随着农杆菌浸染时间延长，愈伤组织的转化效率有明显增加的趋势，当浸染时间为30 min时，转化效率最高，转化效率是浸染10 min时的3.3倍和浸染20min时的1.4倍；这是由于侵染时间过短，外植体上农杆菌附着不足，导致愈伤组织转化率低。但随着浸染时间的继续增加，转化效率显著降低，且对愈伤组织造成伤害，浸染时间40min时的转化效率仅为30 min时的21%，差异显著。这是由于侵染时间过长，外植体上农杆菌附着过多，对愈伤组织造成过度的伤害，不利于抗性愈伤组织的获得。所以，最佳的农杆菌浸染时间为30 min。

图3C结果表明，随着共培养时间的延长，愈伤组织的转化效率有显著增加的趋势，当共培养时间为3 d时，愈伤组织转化效率最高，为70%，转化效率分别为共培养1 d和2 d时的2.6和1.4倍；原因是共培养时间短，农杆菌侵染不足，T-DNA不能有效地向植物细胞转移和表达。但随着共培养时间继续延长，愈伤组织转化效率降低，共培养4 d时的转化效率仅为3 d时的57%，原因是共培养时间的延长，愈伤组织吸附的农杆菌量增多，对愈伤组织的损伤增加，影响后期愈伤组织生长。所以，最佳的共培养时间为3 d。

2.4 转化材料GUS检测

根据上述优化后的农杆菌转化条件，对沟叶结缕草愈伤组织进行处理，并经共培养、抗性愈伤组织筛选、再生苗生长和生根、再生苗筛选、炼苗和移栽后，获得可能的转基因植株（图5）。对不同阶段的组织行进GUS染色分析，结果表明，处于筛选阶段的愈伤组织经GUS染色后呈现出蓝色，说明GUS基因已成功在愈伤组织中表达()（图4A），抗性芽经生长和炼苗后，转化植株和叶的GUS染色呈蓝色，说明GUS基因以稳定的在沟叶结缕草植株中表达（图4B，C）。

2.5 转基因抗性植株的获得

对遗传转化后的再生植株在基因组水平上进行PCR检测。从18株移栽的抗性植株随机挑选5株并提取其叶片基因组 DNA，通过PCR反应扩增HPT基因。结果表明，5株转化植株都能成功的扩增出729 bp的目的片段（图6），而野生型沟叶结缕草（—）则未能扩增出目的条带。结果进一步证明了目的基因已成功的整合到沟叶结缕草基因组中。