阅读说明：本技术 一种从新鲜虾和/或蟹废弃物中提取天然虾青素的方法 (Method for extracting natural astaxanthin from fresh shrimps and/or crab waste ) 是由 林大昌 叶伟 江艾佳 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及从虾、蟹废弃物生物处理技术领域,尤其涉及一种从新鲜虾和/或蟹废弃物中制备高含天然虾青素干壳粉的方法。该方法包括以下的步骤：1)将新新鲜虾和/或蟹废弃物粉碎制浆,制得新鲜浆料；2)将新鲜浆料抽入装备超声波装置的酶解反应釜中进行采用混合酶制剂进行酶解,所述的混合酶制剂中加入食品级抗氧化剂,食品级抗氧化剂的加入量为100-5000ppm；3)酶解结速后,高速离心,离心渣用去离子水清洗后,加入酸水脱钙；4)脱钙结速后,高速离心,离心渣30-60℃真空烘干,得含天然虾青素的干壳粉。该方法简便,采用新鲜虾和/或蟹废弃物,可以就地处理,通过混合蛋白酶酶解,超声波辅助能较彻底去除残留物,并在酶解过程中加入食品级抗氧化剂,保护了天然虾青素的氧化,提高了产品中天然虾青素含量。(The invention relates to the technical field of biological treatment of shrimp and crab wastes, in particular to a method for preparing high-natural-astaxanthin-content dry shell powder from fresh shrimp and/or crab wastes. The method comprises the following steps: 1) crushing and pulping the waste of the fresh shrimps and/or the crabs to prepare fresh pulp; 2) pumping fresh slurry into an enzymolysis reaction kettle equipped with an ultrasonic device for enzymolysis by adopting a mixed enzyme preparation, wherein a food-grade antioxidant is added into the mixed enzyme preparation, and the adding amount of the food-grade antioxidant is 100-5000 ppm; 3) after enzymolysis, high-speed centrifugation is carried out, centrifugal slag is washed by deionized water, and acid water is added for decalcification; 4) and after decalcification and hardening, high-speed centrifugation is carried out, and centrifugal slag is dried in vacuum at 30-60 ℃ to obtain dry shell powder containing natural astaxanthin. The method is simple, adopts fresh shrimp and/or crab waste, can be treated on site, can remove residue thoroughly by enzymolysis of mixed protease and ultrasonic wave assistance, and adds food-grade antioxidant during enzymolysis process to protect oxidation of natural astaxanthin and improve natural astaxanthin content in product.)

一种从新鲜虾和/或蟹废弃物中提取天然虾青素的方法

技术领域

本发明涉及从虾、蟹废弃物生物处理技术领域，尤其涉及一种从新鲜虾和/或蟹废弃物中提取天然虾青素的方法。

背景技术

随着水产养殖、加工企业的猛增，加工过程中伴随着产生的下脚料也越来越多，也是严重的污染原；以浙江为例；以海水虾或淡水虾、小龙虾为主要原料的生产企业在处理这些下脚料时，一部分作为废料外售，每吨几百元不等，或者运送到养殖场烘干粉碎作为饲料，还有很多未来得及处理的下脚料由于堆砌一处发霉腐烂，严重污染环境，最终直接运往垃圾场。而这些副产物含有丰富的蛋白质、虾青素、不饱和脂肪酸等营养物质，含有钙、镁、磷等矿物质盐类以及脑磷脂、卵磷脂、类胡萝卜素、碳水化合物、纤维素、维生素等营养成分,虾副产物主要是指对原料虾筛选后加工成虾仁、虾尾后等产品的下脚料（虾头、淘汰虾），这些下脚料含有许多残肉。目前，将少量虾头、虾壳等粉碎后掺入鱼粉作为饲料、诱饵，以及用虾头、虾壳提取功能性营养物质已有许多报道。小龙虾头、足残留着大量虾肉，虾脑、虾黄，将这些残留物加以利用具有更高的利用价值，同时采肉后的虾壳虾头可做进一步处理成生物蛋白钙粉、虾青素、甲壳素、壳聚糖等。

目前国内外每年会产生大量虾蟹加工业的甲壳类废弃物，从甲壳类废弃料中提取回收虾青素成为生产天然虾青素的主要途径之一。

甲壳动物（如虾及蟹）的壳内中的虾青素主要有3种存在形式：（1）蛋白质结合形式；(2)酯化形式；(3)游离态形式。

其中游离态最不稳定，酯化形式存在最多，实际提取过程中主要是将酯化形式的虾青素进行有效分离纯化。近年来，挪威等国家在处理过程中加入无机酸或有机酸，破坏虾青素与蛋白质或骨骼的部分结合，增加虾青素的释放量，回收率可以达到180μg/g，且纯度大大提高，但仍无法满足市场需求。

以小龙虾虾头中提取天然虾青素，鲜小龙虾虾头含量为25-30μg/g，传统工艺采用整体烘干后粉碎，虾青素由于烘干、粉碎温度原因，氧化损耗达15-20%，无论碱提法、有机溶剂法、超临界CO₂萃取法提取,辅料(碱、油、有机溶剂、CO₂)及能源的消耗均是本方法的3倍；由于小龙虾是季节性产品（4-9月），常规的储藏、运输，天然虾青素氧化损耗达30-40%。

申请人申请的发明专利（公开号：CN1715255A，公开日：2006.01.04）公开了一种用虾壳生产甲壳素、虾青素、蛋白质、钙粉和生物肥料的方法，工艺步骤为：将虾壳粉碎后加入复合酶进行酶解，然后加入有机溶剂萃取，充分反应后，分离成虾液体和虾固体，虾液体进行分液，分成水解液和有机液，将含虾青素的有机液真空浓缩提取粗品虾青素。

中国发明专利申请（公开号CN108559765A，公开日：2017年12月28日）公开了生物酶法从小龙虾壳中提取N-乙酰氨基葡萄糖与虾青素的方法。该方法包括以下步骤：小龙虾虾壳预处理得到小龙虾虾壳粉；取产几丁质酶微生物为供试菌，将供试菌接种至种子培养基上培养得种子液，再将种子液转移至发酵培养基中发酵后，提纯得粗纯酶液；取小龙虾虾壳粉置于反应釜中，依次加入粗纯酶液和有机试剂，避光下边搅拌边恒温加热至20-37℃得酶解液；将酶解液静止分层后，倒出上层液，避光下回收有机试剂和富含虾青素的虾油。

上述的方法都是采用虾壳粉酶解后采用有机试剂萃取获得虾青素，但是工艺步骤比较复杂，在这个过程中虾青素氧化损耗较大。另外，复杂的工艺条件也不利于原料的就地处理，这样就需要进行集中运输，集中集中处理；这在运输和集中处理的过程中往往又会导致虾青素氧化损耗，并且也带来了库存和物流的成本以及生产过程中废弃物对环境的污染。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种从新鲜虾和/或蟹废弃物中提取天然虾青素的方法，该方法简便，采用新鲜虾和/或蟹废弃物，可以就地处理，通过混合蛋白酶酶解,超声波辅助能较彻底去除残留物，并在酶解过程中加入食品级抗氧化剂，保护了天然虾青素的氧化，提高了产品中天然虾青素含量。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种从新鲜虾和/或蟹废弃物中提取天然虾青素的方法，该方法包括以下的步骤：

1）将新新鲜虾和/或蟹废弃物粉碎制浆，制得新鲜浆料；

2）将新鲜浆料抽入装备超声波装置的酶解反应釜中采用混合酶制剂进行酶解，所述的混合酶制剂中加入食品级抗氧化剂，食品级抗氧化剂的加入量为100-5000ppm；

3）酶解结速后，高速离心，离心渣用去离子水清洗后，加入酸水脱钙；

4）脱钙结速后，高速离心，离心渣30-60℃真空烘干，得含天然虾青素的干壳粉。

作为优选，新鲜虾和/或蟹废弃物的动物来源包括海水虾、淡水虾、小龙虾和蟹中的一种或多种；废弃物的形式包括虾头、淘汰虾、虾脚、虾壳、蟹脚、蟹壳和淘汰蟹中的一种或多种。本申请的最优选，为小龙虾的虾头、虾脚。

作为优选，超声波装置的功率：50W-250W，频率：15kHz-50kHz；新鲜浆料呈片状5-10目，含水率为50-55%。

作为优选，酶解的固液比为1：1.5~1:5，调节pH=7.0-8.0，酶用量5000-10000U/g，在50-60℃下酶解4.0-6.0h。

作为优选，所述的混合酶制剂包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和脂肪酶，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶，比例按U/g：1-2：0.2-0.5：0.1-0.3。

作为优选，酸水脱钙加酸水同时加入食品级抗氧化剂100-2000ppm，酸水采用低浓度HCl或有机酸。

作为优选，食品级抗氧化剂采用维生素E、维生素C、L-抗坏血酸钠、BHA、PG和BHT中的一种或多种混合。

作为进一步改进，步骤3）高速离心后，离心液转入提蛋白工艺，提蛋白工艺包括以下的步骤：

1.1）将酶解离心液100℃高温搅拌0.5h，温控在60℃，加入5%(w:v)壳聚糖-纤维素-活性碳复合吸咐树脂，搅拌1h进行脱色、除腥味、除重金属离子、农殘及有害物质；

1.2）趁热微过滤去除颗粒杂质；

1.3）真空浓缩含固率≥10%，喷雾干燥制得浓缩蛋白粉。

作为进一步改进，步骤4）高速离心后，将含盐酸的离心液加入K2CO3调Ph6-6.5，再通入CO2产生白色沉淀，高速过滤离心，离心渣真空烘干温控在≤80℃，水份≤10%即得成品生物活性钙，离心液转入液肥用水；

或者，步骤4）高速离心后，将含有机酸的离心液微过滤，去除颗粒杂质，真空浓缩含固率≥10%，喷雾干燥制得有机生物活性钙粉。

作为进一步改进，该方法还包括壳寡糖液体有机肥料制备步骤：

A.将清洗虾头和渣的清洗水、反应釜清洗水混和；加入壳聚糖凝絮剂沉淀，取上清液，过阴、阳离子树脂，回用作清洗水；

B.将凝絮液，生物活性钙离心液混和，检测N、P、K和必需微量元素含量，并对照液体肥料国标，调Ph6.5-7.0，补充加入易溶于水的N、P、K和其他必需微量元素有机化合物，充分搅拌，加入2.5-8%（w/v）壳寡糖，充分搅拌；

C、加入大粒壳聚糖-纤维素-活性碳复合吸咐树脂，搅拌，除重金属及有害金属离子、农殘及有害物质，加入0.5-1%（w/v）三梨酸钾，高速离心，过200-250目滤网，装桶充入氮气或抽真空。

本申请还公开了所述的方法制备得到含天然虾青素的干壳粉。

本申请由于采用了上述的技术方案，方法简便，采用新鲜虾和/或蟹废弃物，可以就地处理，通过混合蛋白酶酶解,超声波辅助能较彻底去除残留物，并在酶解过程中加入食品级抗氧化剂，保护了天然虾青素的氧化，提高了产品中天然虾青素含量，干壳粉天然虾青素含量200-250μg/g，本申请的干壳粉可以直接作为饲料添加使用（在申请人申请的公开号为：CN108208313A得到应用），或者作为虾青素提取的原材料使用。

另外，本申请利用混合蛋白酶水解下脚料所纳的殘留肉制成浓缩蛋白粉，虾壳采用有机酸化制备生物钙粉，工艺废水、冲洗水混和制备壳聚糖液体肥料（植物营养液），进一步优化其工艺条件，制备成丰含天然虾青素的干壳粉，为企业实现废料资源化利用，大幅度增加经济效益,同时有效减少废弃物对环境的污染；实现了污水零排放。

附图说明

图1虾青素标准对照品溶液HPLC检测图。

图2虾粉虾青素测试品溶液HPLC检测图。

具体实施方式

实施例1

本申请的以小龙虾为实例具体的实施步骤如下：

1、新鲜小龙虾去除虾尾，去离子水清洗；(虾尾占30%可商品出售)；

2、将新鲜小龙虾虾头、虾足粉碎制浆(虾壳呈片状5-10目)含水50-55%；

3、将新鲜虾浆抽入装备超声波装置(H66025型超声发生器：功率：50W-250W、频率：15kHz-50kHz)的酶解反应釜中；

4、加入去离子水，固液比为1∶2.5，调：pH=7.5，酶用量8,000U/g，在55℃下酶解5.0h，采用混合酶制剂:木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶，比例按U/g：1.5：0.3：0.2；同时加入抗氧化剂维生素E500ppm；

酶解结速后，高速离心，（V=3000r/min）离心液转入提蛋白工艺(7)；

6、离心渣用去离子水清洗后，按1：1.5（W:W）加入酸水脱钙，(加入抗氧化剂L-抗坏血酸钠600ppm)酸为1molHCl，搅拌4-6h脱钙,结速后，高速离心，（V=3000r/min）离心液转入提生物活性钙工艺；按产品的需求也可采用有机酸脱钙，温控在60℃下真空烘干（水份≤10%）；

成品需充入氮气或抽真空包装，外用铝箔避光袋，冷藏温度≤5℃。

经HPLC检测:干虾壳中天然虾青素含量为200-250μg/g；

7、蛋白提取：

将酶解离心液→100℃高温搅拌0.5h(杀酶、杀菌)→温控在60℃，加入5%(w:v)壳聚糖-纤维素-活性碳复合吸咐树脂(自制)，搅拌1h；(脱色、除腥味、除重金属离子、农殘及有害物质），→趁热微过滤，（去除颗粒杂质）→真空浓缩（含固率≥10%）→喷雾干燥制得浓缩蛋白粉（料液在空气压力0．3MPa，进口温度150℃，出口温度70℃工艺条件下进行喷雾干燥）。

经检测：其所含水分6.21%、灰分3.05%、脂肪3.26%、蛋白质87.48%，且制品虾味浓郁、色泽较好，粉末状颗粒，非常适合作为蛋白强化剂或风味料的填充剂等。

8、提取生物活性钙、有机生物钙：

提取生物活性钙:将离心液(含盐酸,Ph4)→加入K₂CO₃调Ph6-6.5,通入CO₂产生白色沉淀→高速过滤离心（V=3000r/min）→离心渣真空烘干温控在≤80℃,（水份≤10%）→即得成品生物活性钙；离心液(富含蛋白质、钙、钾离子)→转入液肥用水。

提取有机生物活性钙:将离心液(含柠檬酸,Ph6-6.5)→微过滤，（去除颗粒杂质）→真空浓缩（含固率≥10%）→喷雾干燥制得有机生物活性钙粉。（料液在空气压力0．2MPa，进口温度160℃，出口温度80℃工艺条件下进行喷雾干燥）

10、壳寡糖液体有机肥料制备：

A.将清洗虾头和渣的清洗水、反应釜清洗水，混和→加入壳聚糖凝絮剂（自制）沉淀，取上清液（约70%）→过阴、阳离子树脂→回用作清洗水；

B.将凝絮液（约30%），生物活性钙离心液(富含蛋白质、钙、钾离子)混和→检测N、P、K和必需微量元素含量，并对照液体肥料国标→调Ph6.5-7（用KOH和H₂PO₃调,侭量减少Na⁺、Cl^-、SO₄ ^-离子）补充加入→易溶于水的N、P、K和必需微量元素有机化合物，

充分搅拌1h→加入2.5-3%（w/v）壳寡糖（M≤5KD）充分搅拌1h→加入量为5%（w/v）

大粒壳聚糖-纤维素-活性碳复合吸咐树脂(自制)，搅拌1h(除重金属及有害金属离子、农殘及有害物质），→加入0.5-1%（w/v）三梨酸钾(防霉、防腐剂)，→高速离心，过200-250目滤网→装桶充入氮气或抽真空(≤0.1MPa)。

本专利实施方法在储运环节中虾青素氧化损耗在5-10%；同时庫存、物流成本下降70%，本发明专利具有极高的社会和经济效益。

实施例2 HPLC检测小龙虾虾头壳成品中天然虾青素含量

1.色谱条件色谱柱:

色谱柱为DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm，5μm)；

流动相：甲醇-水(95∶5)：流速：1mL/min；检测波长：475nm；

检测器：紫外检测器：进样量；10μL：柱温:室温。

2．测定方法

A.对照品溶液的制备:精密称取虾青素对照品4.0mg,置50mL量瓶中，用少量二氯甲烷(1mL)振摇使溶解，用甲醇稀释至刻度，作为对照品储备液。精密移取此储备液2mL置10mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

B.测试品溶液的制备:称取12g样品,精密称定，分三次,每次加入二氯甲烷60-80mL,分别进行振荡淬取,(温控30℃、每次时间5-6h),待虾壳呈黄白色结朿,将三次淬取液过200目抽滤膜,浓缩至5mL,加甲醇15mL,该混合溶剂(二氯甲烷:甲醇=1：3)，再加入5mL体积的1.5%KOH甲醇溶液，超声15min，用溶剂定容至25mL。置黑暗环境下，4℃冰箱中皂化7h左右，皂化后的虾青素提取液过0.45μm膜,作为测试品溶液采用5个测试品溶液，取平均值计。

C.分别取上述测试品溶液和对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。按外标法以峰面积计算虾青素的含量，色谱图见图1、图2。

D.线性关系确定：精密吸取2.A项下,虾青素对照品标准溶液，进样5，10，15，20，25，30μL，以峰面积(Y)对对照品量(X)进行线性回归处理，线性方程为:Y=53774X－7242.3，r=0.9993，结果表明在0.0802～0.4812/μg内进样体积与峰面积呈良好的线性关系。

E.重复性测试取虾青素测试品溶液，照2．B项下的方法制备测试品5份，照1.项下色谱条件测定峰面积，计算含量，结果平均含量为107.6μg/mL，RSD为1.09%。

计:成品虾壳粉12g,浸出浓缩液25ml,平均含量为107.6μg/mL；

25ml×107.6μg/12g=224.6μg/g。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。