阅读说明：本技术 基于透皮吸收制备雨生红球藻中虾青素的方法 (The method for preparing Determination of Astaxanthin in Haematococcus Pluvialis based on Transdermal absorption ) 是由 王平 刘玲 于 2019-07-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种基于透皮吸收制备以及评价雨生红球藻中虾青素的方法,该方法包括以下步骤：(1)雨生红球藻的提取工艺采用正己烷-乙醇有机混合溶剂对雨生红球藻进行超声提取；(2)产物的树脂吸附将上述提取液加入大孔树脂吸附,吸附结束后,水洗中性,再用乙醇溶液洗脱,减压回收洗脱液放置结晶,滤出得粗结晶；(3)样品的透皮吸收用人造生物膜模拟人体表皮皮肤,然后于生理盐水中浸泡处理后,作为透皮屏障,以粗结晶为透皮释放液,以乙醇-生理盐水为透皮吸收液,于恒温恒速的条件下进行透皮吸收试验,间隔一段时间后移取适量透过液,再补充相同体积的乙醇-生理盐水,分离出易被皮肤吸收的成分。(The present invention provides a kind of method for preparing based on Transdermal absorption and evaluating Determination of Astaxanthin in Haematococcus Pluvialis, method includes the following steps: the extraction process of (1) haematococcus pluvialis carries out ultrasonic extraction to haematococcus pluvialis using the organic mixed solvent of n-hexane-ethyl alcohol；(2) macroporous resin adsorption is added in said extracted liquid by the resin adsorption of product, and after absorption, washing is neutral, then is eluted with ethanol solution, and eluent is recovered under reduced pressure and places crystallization, filters out to obtain coarse crystallization；(3) the artificial biological film human epidermal skin of the Transdermal absorption of sample, then in physiological saline after immersion treatment, as transdermal barrier, using coarse crystallization as transdermal release liquid, using ethyl alcohol-physiological saline as Transdermal absorption liquid, skin permeation test in vitro is carried out under conditions of Yu Hengwen constant speed, appropriate permeate is pipetted after certain interval of time, it is supplemented ethyl alcohol-physiological saline of same volume, isolates the ingredient being easily absorbed by the skin.)

基于透皮吸收制备雨生红球藻中虾青素的方法

技术领域

本发明属于生物医药、保健食品、化妆品等领域。具体涉及涉及基于透皮吸收制备以及评价雨生红球藻中虾青素的方法

背景技术

虾青素(3，3’-二羟基-β，β’-胡萝卜素-4,4’-二酮)是一种橙红色的酮式类胡萝卜素，广泛存在于虾、蟹、观赏鱼、火烈鸟以及某些藻类、菌类等。分子结构中共轭二烯及不饱和羰基的存在，使得虾青素具有超强的抗氧化性，除此之外，虾青素还表现出重要的生物功能如抗肿瘤、抗炎、美白防晒、抗动脉粥样硬化、增强免疫力、降低紫外线损伤、防癌、减少慢性疾病等。因此虾青素广泛的应用于医药、食品、化妆品等行业。目前，虾青素的生产工艺包括生物制备及化学合成，由于化学合成的虾青素在结构、功能、安全性应用等方面均逊色于生物制备虾青素，同时天然虾青素是唯一的一种可以穿过血脑屏障的类胡萝卜素。

因此，天然虾青素的生产研究一直是一个重要的领域。天然虾青素的生物来源有三种:水产品加工的废物、法夫酵母及雨生红球藻。其中，水产品加工的废物中虾青素含量低，提取成本高，不适合大规模生产。法夫酵母作为，天然虾青素的来源之一，绿色安全、生长周期短，但是生产工艺较复杂并且虾青素的平均积累含量低于雨生红球藻，因此雨生红球藻作为目前已知的虾青素，积累量最高的物种成为天然虾青素的优良来源。

当前雨生红球藻虾青素的提取方法主要为超临界CO₂提取和机溶剂提取两类。超临界CO₂提取能较好地保持虾青素的活性，但设备昂贵，且运行成本较高。相比之下，有机溶剂提取法简单、易于操作放大、后续分离技术成熟，成本低。二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮等均可用于提取雨生红球藻中的虾青素，然而这些溶剂或多或少均存在一定的毒性。选择一种低毒、高效的溶剂，是溶剂法提取虾青素的一个关键瓶颈问题。

有机溶剂浸提法具有处理量大，能耗低，速度快，对设备要求简单等特点，并易于实现连续操作和自动化控制。采用有机溶剂法提取虾青素较其它方法更利于实现工业化生产。

但是，化妆品或食品经透皮到达人体环境是否得起到预期的作用和功效，这些都不得而知。

发明内容

针对目前对雨生红球藻的提取工艺，直接采用有机溶剂浸提法进行提取，再进行树脂吸附。本发明建立一种基于皮肤表层的测定样品透皮吸收率的新评价方法，结合传统提取工艺，模拟人体血脑屏障，分离出易被吸收的成分，从而建立了一种生物相关性更强，更接近动物试验水平，更科学有效的提取方法。

本发明通过在体外模拟人体表皮皮肤进行透皮吸收实验，以分离出易被皮肤吸收的成分，从而对样品的虾青素含量进行相关的检测。具体而言，本发明在提取上采用最简单通用的有机溶剂浸提法，该方法实用性强，对设备要求简单等特点，并易于实现连续操作和自动化控制；

本发明首次提出在传统提取工艺之后，再近一步通过体外模拟人体表皮皮肤透皮吸收实验，分离出易被皮肤吸收的成分，再对其进行结构鉴定和含量测定。在提取工艺上选择了简单通用的有机溶剂浸提法和树脂吸附法，该方法实用性强，对设备要求简单等特点，并易于实现连续操作和自动化控制。

本发明目的通过如下技术方案实现：

基于透皮吸收制备以及评价雨生红球藻中虾青素的方法，该方法包括以下步骤：

(1)雨生红球藻的提取工艺

采用正己烷-乙醇有机混合溶剂对雨生红球藻进行超声提取；

(2)产物的树脂吸附

将上述提取液加入大孔树脂吸附，吸附结束后，水洗中性，再用乙醇溶液洗脱，减压回收洗脱液放置结晶，滤出得粗结晶；

(3)样品的透皮吸收

用人造生物膜模拟人体表皮皮肤，然后于生理盐水中浸泡处理后，作为透皮屏障，以粗结晶为透皮释放液，以乙醇-生理盐水为透皮吸收液，于恒温恒速的条件下进行透皮吸收试验，间隔一段时间后移取适量透过液，再补充相同体积的乙醇-生理盐水，分离出易被皮肤吸收的成分。

本发明一些实施方式中，步骤(1)所述正己烷-乙醇的体积比为1：1

在本发明一些实施方式中，步骤(1)料液比为1:600(g/m L)。

在本发明一些实施方式中，步骤(1)提取温度为50℃。

在本发明一些实施方式中，步骤(1)提取时间为40分钟。

在本发明一些实施方式中，步骤(3)所述人造生物膜预处理是指用剪刀将生物膜剪成5cm*5cm大小，然后于生理盐水中浸泡处理30min。

在本发明一些实施方式中，步骤(3)所述透皮吸收仪恒温恒速是指恒温于37℃，恒速3800r/min的条件下进行透皮吸收试验。

在本发明一些实施方式中，步骤(3)所述分别取样，并在取样后补充相同量的透皮吸收液是指在1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h各取样点用洁净针筒分别移取2mL透过液，再用洁净针筒补充2mL30％乙醇-生理盐水。

在本发明一些实施方式中，采用高效液相色谱法对步骤(3)分离出的透过液进行结构鉴定和含量检测。

更优选地，本发明采用如下具体方法，雨生红球藻的提取工艺：(1)采用安全无毒的1:1正己烷-乙醇有机混合溶剂，在一定的料液比1:600(g/mL)、提取温度50℃、提取时间40分钟对雨生红球藻进行超声提取；(2)产物的树脂吸附将上述提取液，梯度调节PH，加入大孔树脂吸附，吸附结束后，水洗中性，再用6-8BV乙醇溶液洗脱，减压回收洗脱液放置结晶，滤出得粗结晶；(3)样品的透皮吸收实验用人造生物膜模拟人体表皮皮肤，用剪刀将人造生物膜剪成5cm*5cm大小，然后于生理盐水中浸泡处理30min后，作为透皮屏障，以粗结晶为透皮释放液，以30％乙醇-生理盐水为透皮吸收液，于恒温37℃，恒速3800r/min的条件下进行透皮吸收试验。

在本发明一些具体实施例中，采用如下实施步骤：

(1)雨生红球藻的提取工艺：

采用安全无毒的1:1正己烷-乙醇有机混合溶剂，在料液比1:600(g/mL)、提取温度50℃、提取时间40分钟对雨生红球藻超声提取；

(2)产物的树脂吸附：

将所得溶液上大孔树脂吸附，型号为DA201，树脂柱的高径比为8:1～15:1；在常温常压下，以1BV/h流速，先用蒸馏水洗脱，洗脱体积为3-5BV；再用75％-95％的乙醇溶液在1-3BV/h流速、洗脱体积为6-8BV下进行洗脱，减压回收洗脱液放置结晶，滤出得粗结晶；

(3)透皮吸收试验

试验材料：

人造膜购买自广州市宝隆国际贸易有限公司，型号为聚季铵盐-51Lipidure PMB人造细胞膜；

30％乙醇-生理盐水；生理盐水。

试验方法：

用人造生物膜模拟人体表皮皮肤，用剪刀将人造生物膜剪成5cm*5cm大小，然后于生理盐水中浸泡处理30min后，作为透皮屏障，将实施例1～9以及对照例1、对照例2获得粗结晶溶于生理盐水后作为透皮释放液，以30％乙醇-生理盐水为透皮吸收液，于恒温37℃，恒速3800r/min的条件下进行透皮吸收试验。在1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h各取样点用洁净针筒分别移取2mL透过液，再用洁净针筒补充2mL30％乙醇-生理盐水。

各取样点溶液于紫外分光光度计475nm处检测吸光度，根据标准曲线及标准公式计算各取样点样品的透皮浓度及相应的单位面积平均累积透皮量Q值，将累积渗透量Q对时间t进行回归，所得线性方程的斜率即为该条件下药物的稳态透皮速率J(mg·cm²·h-1)；

(4)样品的结构鉴定及含量检测

采用高效液相色谱柱方法对透过液进行结构鉴定，C18色谱柱分离,流动相为甲醇∶水(98∶2，v/v)；结构为C₄₀H₅₂O₄。紫外检测波长475nm，外标法定量，虾青素的得率达95％，纯度达90.7％。

相对于现有技术，本发明具有如下优点和效果：

(1)本发明在提取工艺后采用用人造生物膜模拟血脑屏障来进行透皮吸收实验，建立一种基于人工生物膜的测定样品透皮吸收率的新评价方法，分离出易被血脑屏障吸收的成分，从而建立了一种生物相关性更强，更接近动物试验水平，更科学有效的制备分离方法。

(2)本发明在结构鉴定和含量测定上，先采用透皮吸收分离，再通过高效液相色谱分离检测，从而制备出易被血脑屏障吸收的高含量的雨生红球藻的虾青素。

(3)本发明操作简便，无需昂贵设备，且整个制备过程中无有毒有机溶剂，属于绿色环保工艺；在制备过程中虾青素的产率高，副产物少，可应用于工业化的大规模生产。

具体实施方式

：

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

从雨生红球藻中提取虾青素方法：

(1)雨生红球藻的提取工艺：

采用安全无毒的1:1正己烷-乙醇有机混合溶剂，在料液比1:600(g/mL)、提取温度50℃、提取时间40分钟对雨生红球藻超声提取；

(2)产物的树脂吸附：

将所得溶液上大孔树脂吸附，型号为DA201，树脂柱的高径比为10:1；在常温常压下，以1BV/h流速，先用蒸馏水洗脱，洗脱体积为3BV；再用75％的乙醇溶液在3BV/h流速、洗脱体积为6BV下进行洗脱，减压回收洗脱液放置结晶，滤出得粗结晶；

(3)透皮吸收试验

试验材料：

人造膜购买自广州市宝隆国际贸易有限公司，型号为聚季铵盐-51Lipidure PMB人造细胞膜；

30％乙醇-生理盐水；生理盐水。

试验方法：

用人造生物膜模拟人体表皮皮肤，用剪刀将人造生物膜剪成5cm*5cm大小，然后于生理盐水中浸泡处理30min后，作为透皮屏障，将获得粗结晶溶于生理盐水后作为透皮释放液，以30％乙醇-生理盐水为透皮吸收液，于恒温37℃，恒速3800r/min的条件下进行透皮吸收试验。在1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h各取样点用洁净针筒分别移取2mL透过液，再用洁净针筒补充2mL30％乙醇-生理盐水；

各取样点溶液于紫外分光光度计475nm处检测吸光度，根据标准曲线及标准公式计算各取样点样品的透皮浓度及相应的单位面积平均累积透皮量Q值，将累积渗透量Q对时间t进行回归，所得线性方程的斜率即为该条件下药物的稳态透皮速率J(mg·cm²·h-1)；

(4)样品的结构鉴定及含量检测

采用高效液相色谱柱方法对透过液进行结构鉴定，C18色谱柱分离,流动相为甲醇∶水(98∶2，v/v)；结构为C₄₀H₅₂O₄。紫外检测波长475nm，外标法定量，虾青素的得率达95％，纯度达90.7％。

实施例2

本实施例的提取方法与实施例1基本相同，区别在于步骤(1)的提取温度为60℃。

实施例3

本实施例的提取方法与实施例1基本相同，区别在于步骤(1)的提取温度为70℃。

实施例4

本实施例的提取方法与实施例1基本相同，区别在于步骤(1)的提取温度为40℃。

实施例5

本实施例的提取方法与实施例1基本相同，区别在于步骤(1)的提取温度为30℃。

实施例6

本实施例的提取方法与实施例2基本相同，区别在于将步骤(2)的大孔树脂DA201替换为D101。

实施例7

本实施例的提取方法与实施例3基本相同，区别在于将步骤(2)的大孔树脂DA201替换为D101。

实施例8

本实施例的提取方法与实施例4基本相同，区别在于将步骤(2)的大孔树脂DA201替换为D101。

实施例9

本实施例的提取方法与实施例5基本相同，区别在于将步骤(2)的大孔树脂DA201替换为D101。

对照例1

本实施例的提取方法与实施例1基本相同，区别在于将步骤(1)的提取溶剂替换为二氯甲烷。

对照例2

本实施例的提取方法与实施例1基本相同，区别在于将步骤(1)的超声提取替换为搅拌提取。

试验例

测试实施例1～9以及对照例1、对照例2获得的透皮吸收成分的稳态透皮速率，详见表1所示。

表1

样品	提取溶剂	提取温度	吸附树脂	提取	J值
						实施例1	正己烷-乙醇	50℃	DA201	超声提取	0.1005
实施例2	正己烷-乙醇	60℃	DA201	超声提取	0.0998
						实施例3	正己烷-乙醇	70℃	DA201	超声提取	0.0829
实施例4	正己烷-乙醇	40℃	DA201	超声提取	0.0893
						实施例5	正己烷-乙醇	30℃	DA201	超声提取	0.0765
实施例6	正己烷-乙醇	60℃	D101	超声提取	0.0888
						实施例7	正己烷-乙醇	70℃	D101	超声提取	0.0842
实施例8	正己烷-乙醇	40℃	D101	超声提取	0.0739
						实施例9	正己烷-乙醇	30℃	D101	超声提取	0.0819
对照例1	二氯甲烷	50℃	DA201	超声提取	0.0789
						对照例2	正己烷-乙醇	50℃	DA201	搅拌代替	0.0715

从以上可以看出，通过体外模拟人体表皮皮肤透皮吸收实验，采用安全无毒的溶剂正己烷与乙醇作为提取溶剂相较于二氯甲烷提取溶剂，稳态透皮速率更有优势；

其次，通过以上试验，我们可以发现提取温度为50℃，吸附树脂为DA201时，其获得的虾青素的稳态透皮速率更有优势。

基于以上透皮吸收试验获得的吸收成分，测定虾青素的的得率以及纯度，如表2所示，

表2

样品	得率	纯度
			实施例1	95％	90.7％
实施例2	88％	88.6％
			实施例3	80％	83.9％
实施例4	88％	87.3％
			实施例5	85％	82.6％
实施例6	83％	86.2％
			实施例7	78％	81.9％
实施例8	85％	89.7％
			实施例9	81％	85.2％
对照例1	78％	80.9％
			对照例2	73％	85.1％

经过透皮吸收后的结构含量以及纯度检测，可以发现，实施例1获得虾青素的得率最高，且其纯度达到了90.7％；且由于该成分来源已经由透皮吸收，因此在此获得了易被血脑屏障吸收的高含量的雨生红球藻的虾青素。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。