一种微藻内虾青素的快速提取方法
阅读说明：本技术 一种微藻内虾青素的快速提取方法 (Method for rapidly extracting astaxanthin in microalgae ) 是由 黄成潭 潘军 叶蕾 黄敏 于 2021-08-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及天然色素提取技术领域,特别涉及一种微藻内虾青素的快速提取方法。该方法包括：将含有微藻的养殖水与蛋白保护剂混合,经第一离心,得到浓缩藻液；将浓缩藻液与混合萃取液混合,对所得混合藻液进行冷藏；混合萃取液由乙醇、丙酮、正乙烷和水组成；将冷藏后的混合藻液与抗氧化剂、表面活化剂混合,进行细胞破碎,得到破碎后的藻液；将破碎后的藻液进行超声提取；经超声提取后的混合藻液进行第二离心,得到上清液；将上清液与硫酸铵、聚丙二醇混合,搅拌；将搅拌好的料液进行第三离心,将所得沉淀物进行冷冻干燥。本发明混合萃取液的萃取率高。本发明通过较为简便的方式,可将虾青素快速提取和纯化,提取成功率可达99％,且溶剂残留极低。(The invention relates to the technical field of natural pigment extraction, and particularly relates to a method for quickly extracting astaxanthin in microalgae. The method comprises the following steps: mixing culture water containing microalgae with a protein protective agent, and performing first centrifugation to obtain concentrated algae solution; mixing the concentrated algae solution with the mixed extract, and refrigerating the obtained mixed algae solution; the mixed extract consists of ethanol, acetone, n-ethane and water; mixing the refrigerated mixed algae solution with an antioxidant and a surfactant, and carrying out cell disruption to obtain a disrupted algae solution; carrying out ultrasonic extraction on the crushed algae liquid; performing second centrifugation on the mixed algae liquid subjected to ultrasonic extraction to obtain supernatant; mixing the supernatant with ammonium sulfate and polypropylene glycol, and stirring; and (4) performing third centrifugation on the stirred feed liquid, and freeze-drying the obtained precipitate. The extraction rate of the mixed extraction liquid is high. The method can rapidly extract and purify the astaxanthin in a simple and convenient mode, the extraction success rate can reach 99 percent, and the solvent residue is extremely low.)
技术领域
本发明涉及天然色素提取技术领域，特别涉及一种微藻内虾青素的快速提取方法。
背景技术
微藻是水产养殖动物终生或特定发育阶段的饵料(或饵料的饵料)，作为重要基础之一，很大程度上支撑着水产养殖产业。微拟球藻生长迅速、细胞颗粒小、富含EPA等不饱和脂肪酸、营养比较全面，同时具有较厚细胞壁的特点。微藻是水体生态系统的初级生产力，因其含有丰富的蛋白质、多不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、维生素等营养物质，是水生动物的优质天然饵料；微藻在给水生动物提供食物的同时，还能够通过光合作用，吸收水体中多余的氨氮、磷等物质，起到稳定和改善水质的作用，因此在水产养殖业中有着广泛的应用。
虾青素是一种红色的脂溶性类胡萝卜素，不溶于水，易溶于二甲基亚砜、丙酮、氯仿等溶剂。研究表明，虾青素与胡萝卜素及维生素E等相比，虾青素具有更强的生物活性，是属于人体安全的物质。虾青素的抗氧化活性比β-胡萝卜素高约10倍，比维生素E高约500倍，虾青素已被认为是“超级维生素E”。虾青素目前已被应用于水产养殖、营养保健和化妆品工业以及食品补充剂，虾青素在许多疾病中也具有药理作用并且对人类安全，具有广阔的市场前景。
虾青素按来源分为天然虾青素和人工合成虾青素，合成虾青素是三种异构体的外消旋混合物，比例约为1：2：1。天然虾青素主要来源于藻类和甲壳类动物，而雨生红球藻是所有己知的虾青素合成生物体中积累量最高的物种，可以积累占其干重3％以上，是目前生产天然虾青素应用最多的藻类。雨生红球藻是一种有复杂生命周期的单细胞绿色淡水藻。利用雨生红球藻产虾青素逐渐受到人们的重视。近几年实验室培养雨生红球藻成为研究热点，然而由于其大规模培养存在诸多问题，且其厚壁细胞增加了提取难度，所以虾青素工业化生产难以实现。为此，研究雨生红球藻中虾青素的提取方法对于大规模生产具有一定意义。
目前，利用有机溶剂萃取雨生红球藻中的虾青素是比较普遍的方法，萃取成本低，操作简单。在虾青素萃取中，二甲基亚砜、乙醇、有机酸、丙酮、氯仿、甲醇、己烷，异丙醇、二氯甲烷等是主要萃取剂。Sachindra等，比较了单一有机溶剂和混合溶剂的萃取效果，他们发现混合溶剂的萃取率更高，这些萃取剂通常复配并按照一定比例使用。其中，二甲基亚砜与丙酮复合使用是比较经典的用法。这些有机溶剂固有的毒性也给这种方法带来了不利的影响，溶剂在萃取物中过多的残留会产生食用安全问题。单一的有机溶剂萃取法效率低，萃取时间长，通常会结合其它萃取方法。如何降低萃取物中的溶剂残留并保持良好的萃取效果是目前这种方法面临的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种微藻内虾青素的快速提取方法。该方法快速、萃取率高、纯化高，且溶剂残留极低。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种微藻内虾青素的快速提取方法，包括如下步骤：
步骤(1)将含有微藻的养殖水与蛋白保护剂混合，经第一离心，得到浓缩藻液；
步骤(2)将浓缩藻液与混合萃取液混合，对所得混合藻液进行冷藏；混合萃取液由乙醇、丙酮、正乙烷和水组成；
步骤(3)将冷藏后的混合藻液与抗氧化剂、表面活化剂混合，进行细胞破碎，得到破碎后的藻液；
步骤(4)将破碎后的藻液进行超声提取；
步骤(5)经超声提取后的混合藻液进行第二离心，得到上清液；
步骤(6)将上清液与硫酸铵、聚丙二醇混合，搅拌；
步骤(7)将搅拌好的料液进行第三离心，将所得沉淀物进行冷冻干燥。
作为优选，蛋白保护剂为叠氮钠；
作为优选，在含有微藻的养殖水中，蛋白保护剂的加入量为0.1～0.5mg/L。
在本发明提供的具体实施例中，在含有微藻的养殖水中，蛋白保护剂的加入量为0.5mg/L。
作为优选，第一离心的转速5000～10000rpm，浓缩藻液的含水量为50％～70％。
在本发明提供的具体实施例中，第一离心的转速10000rpm，浓缩藻液的含水量为70％。
作为优选，混合萃取液中，乙醇、丙酮、正乙烷与水的体积比为(15～25)：(5～15)：(10～30)：(100～200)；
优选地，混合萃取液中，乙醇、丙酮、正乙烷与水的体积比为(18～20):(9～11):(13～17):(100～120)。
在本发明提供的具体实施例中，混合萃取液中，乙醇、丙酮、正乙烷与水的体积比为19:10:15:101。
作为优选，浓缩藻液与混合萃取液的质量比为1：(2～3)。
在本发明提供的具体实施例中，浓缩藻液与混合萃取液的质量比为1：3。
作为优选，冷藏为在0～6℃条件下冷藏，将混合藻液的温度降至4～10℃。
在本发明提供的具体实施例中，冷藏为在4℃条件下冷藏，将混合藻液的温度降至10℃。
作为优选，抗氧化剂为维生素C。
作为优选，表面活化剂为吐温80和陶氏DF104聚醚消泡剂。
作为优选，在冷藏后的混合藻液中，抗氧化剂的加入量为1～2mg/L，吐温80的加入量为1～5mL/L，陶氏DF104聚醚消泡剂的加入量为1～2mL/L。
在本发明提供的具体实施例中，在冷藏后的混合藻液中，抗氧化剂的加入量为2mg/L，吐温80的加入量为5mL/L，陶氏DF104聚醚消泡剂的加入量为2mL/L。
作为优选，超声提取的程序为：超声1～3s，间歇2～5s；超声提取60～120min，静置10～20min。
在本发明提供的具体实施例中，超声提取的程序为：超声2s，间歇5s；超声提取120min，静置20min。
作为优选，第二离心的转速为2000～3000rpm，时间为40～60min。
在本发明提供的具体实施例中，第二离心的转速为3000rpm，时间为40min。
作为优选，在上清液中，硫酸铵的加入量为10～15g/L，聚丙二醇的加入量为5～30mL/L；
在本发明提供的具体实施例中，在上清液中，硫酸铵的加入量为15g/L，聚丙二醇的加入量为5mL/L。
作为优选，搅拌的转速为500～1000rpm，时间为1～2h。
在本发明提供的具体实施例中，搅拌的转速为1000rpm，时间为1h。
作为优选，第三离心的转速为5000～10000rpm，时间为20～40min。
在本发明提供的具体实施例中，第三离心的转速为5000rpm，时间为30min。
在本发明中，微藻选自蓝藻门、绿藻门、金藻门或红藻门藻类。如雨生红球藻、小球藻、微拟球藻等。
本发明提供了一种微藻内虾青素的快速提取方法，包括如下步骤：将含有微藻的养殖水与蛋白保护剂混合，经第一离心，得到浓缩藻液；将浓缩藻液与混合萃取液混合，对所得混合藻液进行冷藏；混合萃取液由乙醇、丙酮、正乙烷和水组成；将冷藏后的混合藻液与抗氧化剂、表面活化剂混合，进行细胞破碎，得到破碎后的藻液；将破碎后的藻液进行超声提取；经超声提取后的混合藻液进行第二离心，得到上清液；将上清液与硫酸铵、聚丙二醇混合，搅拌；将搅拌好的料液进行第三离心，将所得沉淀物进行冷冻干燥。本发明具有的技术效果为：
本发明通过对单一萃取液和复合萃取液提取效果比较，发现由乙醇、丙酮、正乙烷和水组成的混合溶剂的萃取率更高。
在本发明中，叠氮钠为蛋白保护剂，避免蛋白在离心过程变性、分解，形成杂质。维生素C具有抗氧化作用，防止虾青素氧化分解；吐温80与陶氏DF104聚醚消泡剂为表面活化剂，联合使用可将虾青素析出在上清液中。硫酸铵和聚丙二醇的联合使用可将溶解于上清液中的虾青素进行析出，形成颗粒沉淀。
本发明通过较为简便的方式，可将虾青素快速提取和纯化，产率达到90％-95％，纯度可达99％，且溶剂残留极低(<0.01％)。
具体实施方式
本发明公开了一种微藻内虾青素的快速提取方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明虾青素的快速提取方法具体步骤如下：
1、将养殖好的雨生红球藻，先加入叠氮钠，加入量为0.1-0.5mg/L。然后通过碟片式离心机将微藻藻液进行离心分离，提取藻体细胞，形成浓缩藻液。离心机转速5000-10000rpm，分离出来的藻液含水量50％-70％。
2、配制混合萃取液：95％乙醇、100％丙酮、100％正乙烷、纯化水、按照(20-25):(5-10):(15-30):(100-200)的体积比例进行混合，形成混合萃取液
将分离好的浓缩藻液加入混合萃取液，萃取液的加入量为浓缩藻的2-3倍(质量比)，搅拌均匀，放置在4℃冰箱中进行冷藏，将混合藻液温度降至4-10℃。
4、将冷藏后的混合藻液加入维生素C(加入量为1-2mg/L)、吐温80(加入量为1-5毫升/L)、陶氏DF104聚醚消泡剂(1-2ml/L)，混合均匀，置入匀浆破碎仪中进行细胞破碎。
5、将破碎后的混合藻液，用超声波仪进行超声，超声时间1-3s，超声间隙2-5s，超声提取60-120min，静置10-20min。
6、经超声后的混合藻液，经过碟片式离心机进行低转速离心，转速2000-3000rpm，40～60min，收取上清液，去除沉淀。
7、在收取的上清液中，加入硫酸铵固体(加入量10-15g/L)，聚丙二醇(加入量5-30ml/L)，500～1000rpm搅拌1-2h。
8、将搅拌好的料液经过碟片式离心机进行高转速离心，转速5000-10000rpm，20～40min，收取沉淀。
9、将沉淀物进行冷冻干燥，即得虾青素冻干粉。
本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、将养殖好的雨生红球藻，先加入叠氮钠，加入量为0.5mg/L。然后通过碟片式离心机将微藻藻液进行离心分离，提取藻体细胞，形成浓缩藻液。离心机转速10000rpm，分离出来的藻液含水70％。
2、配制混合萃取液：95％乙醇、100％丙酮、100％正乙烷、纯化水、按照20:10:15:100的体积比例进行混合(乙醇：丙酮：正乙烷：水＝19:10:15:101)，形成混合萃取液。
3、将分离好的浓缩藻液加入混合萃取液，萃取液的加入量为浓缩藻的3倍(质量比)，搅拌均匀，放置在4℃冰箱中进行冷藏，将混合藻液温度降至10℃。
4、将冷藏后的混合藻液加入维生素C(加入量为2mg/L)、吐温80(加入量为5mL/L)、陶氏DF104聚醚消泡剂(2mL/L)，混合均匀，置入匀浆破碎仪中进行细胞破碎。
5、将破碎后的混合藻液，用超声波仪进行超声，超声时间2s，超声间隙5s，超声提取120min，静置20min。
6、经超声后的混合藻液，经过碟片式离心机进行低转速离心，转速3000rpm，时间为40min，收取上清液，去除沉淀。
7、在收取的上清液中，加入硫酸铵固体(加入量15g/L)，聚丙二醇(加入量5mL/L)，1000rpm搅拌1h。
8、将搅拌好的料液经过碟片式离心机进行高转速离心，转速5000rpm，时间为30min，收取沉淀。
9、将沉淀物进行冷冻干燥，即得虾青素冻干粉。
经检测，冻干后的虾青素干粉，产率为93％，纯度99.2％。
对比例1
本对比例中所用萃取剂与实施例1步骤(2)中混合萃取液进行替换，其它操作步骤相同。
表1
萃取剂
产率(％)
纯度(％)
甲醇
65
73
乙醇
68
76
丙酮
60
70
乙酸乙酯
40
56
氯仿
48
65
正己烷
75
78
丁烷
75
80
二氯甲烷-甲醇(v:v＝1:3)
72
85
甲醇-丙酮(v:v＝1:1)
69
73
正丁醇-丙酮(v:v＝5:1)
72
70
乙酸乙酯-乙醇(v:v＝1:1)
58
61
乙醇-乙酸乙酯(v:v＝1:6)
62
65
甲醇-石油醚-二氯甲烷(v:v＝5:13:5)
67
79
二氯甲烷-正己烷(v:v＝3:1)
57
66
正己烷-乙醇(v:v＝1:1)
62
80
正己烷-乙酸乙酯(v:v＝1:1)
70
65
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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