一种应用双水相体系分离制备虾青素的方法
阅读说明：本技术 一种应用双水相体系分离制备虾青素的方法 (Method for preparing astaxanthin by applying aqueous two-phase system separation ) 是由 冯金华 王岳鸿 李利 王小瑞 于 2019-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种应用双水相体系分离制备虾青素的方法,具体涉及生物工程技术领域,包括含有虾青素的生物原料、亲水性低分子有机溶剂、无机盐溶液和浓度为5％的HCl。本发明通过利用双水相体系从含虾青素的物料中分离制备虾青素沉淀,不仅有利于对含虾青素的生物物料的开发利用,开创一种新的虾青素提取分离方法,而且降低虾青素的生产成本,解决虾青素产业化的一些分离制备的难题,具有在环境温度下进行制备、无需加热,分离快,不需要大型设备,而且蛋白质、多糖、重金属等水溶性杂质及一些脂溶性杂质减少,制备的虾青素含量高,杂质少,对虾青素的破坏少,有利于后续虾青素的收集及后续的纯化和利用。(The invention discloses a method for separating and preparing astaxanthin by using a double aqueous phase system, and particularly relates to the technical field of biological engineering, wherein the method comprises a biological raw material containing astaxanthin, a hydrophilic low-molecular organic solvent, an inorganic salt solution and HCl with the concentration of 5%. The method disclosed by the invention has the advantages that the astaxanthin sediment is separated and prepared from the astaxanthin-containing material by using the aqueous two-phase system, the development and utilization of the astaxanthin-containing biological material are facilitated, a novel astaxanthin extraction and separation method is created, the production cost of the astaxanthin is reduced, the problems of separation and preparation of astaxanthin in industrialization are solved, the method is capable of being prepared at an ambient temperature, heating is not needed, the separation is fast, large-scale equipment is not needed, water-soluble impurities such as protein, polysaccharide and heavy metal and fat-soluble impurities are reduced, the content of the prepared astaxanthin is high, the impurities are few, the damage to the astaxanthin is few, and the subsequent collection, purification and utilization of the astaxanthin are facilitated.)
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，更具体地说，本发明涉及一种应用双水相体系分离制备虾青素的方法。
背景技术
虾青素(Astaxanthin)，3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素，分子式C40H52O4，相对分子质量为596.86，是一种类胡萝卜素。虾青素广泛存在于自然界，如大多数甲壳类动物和鲑科鱼类体内，某些菌类和真菌中，植物的叶、花、果，以及火烈鸟的羽毛中等。虾青素是目前人类已知的最强天然抗氧化剂。虾青素在还具有免疫增强与抗癌作用，以及促进某些水产生长繁殖的作用。因为具有以上特性的虾青素在美容保健，以及农业饲料甚至医疗领域有着广阔的前景。研究虾青素的制备具有重大现实意义。
虾青素的制备目前主要有天然提取法和人工合成法两种方法。化学合成虾青素同天然虾青素在结构、功能、应用及安全性等方面差别显著，其稳定性、抗氧化活性着色性也明显低于天然虾青素，因此目前趋势还是采用天然提取法进行生产。目前国际主流是培养雨生红球菌或是红发夫酵母菌，从中提取虾青素，因为菌种培养等等问题，虾青素总产量一直很低，另外虾蟹废物也是自然界虾青素的主要分布点。目前提取虾青素的主要方法有：碱提法、油溶法、有机溶剂法、超临界CO2萃取法、酶解法等。但上述虾青素的提取方法除超临界CO2萃取法外，都会涉及到从提取溶液中将虾青素分离制备出来。但目前除了减压蒸发外，还没有有效的将从溶液中将虾青素分离制备出来的方法。但是由于虾青素对温度的敏感性，普通的蒸发法对虾青素的结构破坏比较大，超临界CO2萃取技术虽然可以高效制备虾青素固体，但是对设备的要求高，成本高，应用范围比较小。所以寻找一种快速、可以有效保护虾青素稳定性的从溶液中分离制备虾青素、且有利于产业化的方法，对虾青素的研究和开发都有非常高的价值。
双水相体系的应用现已涉及到酶、核酸、生长激素、病毒等各种活性有效成分的分离及提纯。由于它具有活性损失小、分离步骤少、操作条件温和，且不存在有机溶剂残留的问题等优点，无疑在天然产物中有效成分的提取方面颇有前途。但是目前双水相体系的应用，主要涉及的是双水相体系的萃取能力。亲水性低分子有机溶剂/无机盐体系使虾青素从有机溶剂中沉淀出来，同时又利用该体系去除虾青素低分子无机溶剂提取液中的水溶性成分和一些脂溶性成分的研究还未有报道。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种应用双水相体系分离制备虾青素的方法，通过利用双水相体系从含虾青素的物料中分离制备虾青素沉淀，不仅有利于对含虾青素的生物物料的开发利用，开创一种新的虾青素提取分离方法，而且降低虾青素的生产成本，解决虾青素产业化的一些分离制备的难题，具有在环境温度下进行制备、无需加热，分离快，不需要大型设备，而且蛋白质、多糖、重金属等水溶性杂质及一些脂溶性杂质减少，制备的虾青素含量高，杂质少，对虾青素的破坏少，有利于后续虾青素的收集及后续的纯化和利用，以解决背景技术中所提出问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种应用双水相体系分离制备虾青素的方法，包括含有虾青素的生物原料、亲水性低分子有机溶剂、无机盐溶液和浓度为5％的HCl，具体操作步骤如下：
步骤一：收集虾蟹壳干品、鲜品、雨生红球藻和红发夫酵母菌等含有虾青素的生物原料及虾蟹等含虾青素的水产品相关产业生产的虾蟹壳等废料，冲洗干净表面杂质；
步骤二：将步骤一收集的原料干燥，使用浓度为5％的HCl浸泡1h脱钙，浸泡完成后用蒸馏水反复冲洗至中性，之后再次将原料干燥，干燥完成后使用粉碎机将干品粉碎，备用；
步骤三：取20g无机盐溶于水，定容至100mL无机盐溶液；
步骤四：按比例在步骤二中制备的粉状原料中加入亲水性低分子有机溶剂，搅拌均匀，并放置在暗处静置0.5-2h，溶解虾青素，提取液离心去除不溶物，得到含虾青素的低分子有机溶液；
步骤五：按比例向滤液中加入步骤三中制备的无机盐溶液中并混合均匀，形成一定双水相，搅拌均匀后静置分相0.5-2h，虾青素形成沉淀在两相的界面上，将上相快速移出，将中相及下相在冷冻离心机中12000r/min离心20min，离心后，将上清液移出，保留沉淀；
步骤六：向离心管中注入蒸馏水震荡，再放入冷冻离心机中12000r/min离心20min，收集离心的虾青素，低温干燥后保存。
优选的，所述步骤二中粉状原料颗粒大小为50-100目。
优选的，所述步骤三中无机盐设置为硫酸铵、磷酸钾、氯化钠、硫酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或几种组合。
优选的，所述亲水性低分子有机物设置为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇、丙酮中的一种或几种组合。
优选的，所述步骤四中粉状原料与亲水性低分子有机溶剂的料液比设置为1：5-50，萃取温度设置为15℃-50℃。
优选的，所述步骤五中含虾青素的低分子有机溶液与无机盐溶液的比例设置为3:4-5。
优选的，所述整个双水相体系中，加入的无机盐的质量百分比为10％-20％，加入的亲水性低分子有机物在整个双水相体系中质量分数为30％-70％。
本发明的技术效果和优点：
1、通过利用双水相体系从含虾青素的物料中分离制备虾青素沉淀，不仅有利于对含虾青素的生物物料的开发利用，开创一种新的虾青素提取分离方法，而且降低虾青素的生产成本，解决虾青素产业化的一些分离制备的难题，具有在环境温度下进行制备、无需加热，分离快，不需要大型设备，而且蛋白质、多糖、重金属等水溶性杂质及一些脂溶性杂质减少，制备的虾青素含量高，杂质少，对虾青素的破坏少，有利于后续虾青素的收集及后续的纯化和利用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明提供了一种应用双水相体系分离制备虾青素的方法，包括含有虾青素的生物原料、亲水性低分子有机溶剂、无机盐溶液和浓度为5％的HCl，具体操作步骤如下：
步骤一：收集虾蟹壳干品和鲜品等含有虾青素的生物原料及虾蟹等含虾青素的水产品相关产业生产的虾蟹壳等废料，冲洗干净表面杂质；
步骤二：将步骤一收集的原料干燥，使用浓度为5％的HCl浸泡1h脱钙，浸泡完成后用蒸馏水反复冲洗至中性，之后再次将原料干燥，干燥完成后使用粉碎机将干品粉碎，粉状原料颗粒大小为50目，备用；
步骤三：取20g无水硫酸铵溶于水，定容至100mL硫酸铵溶液；
步骤四：按比例在步骤二中制备的粉状原料中加入无水乙醇有机溶剂，粉状原料与无水乙醇有机溶剂的料液比设置为1：5，萃取温度设置为15℃，搅拌均匀，并放置在暗处静置0.5h，溶解虾青素，提取液离心去除不溶物，得到含虾青素的低分子有机溶液；
步骤五：按比例向滤液中加入步骤三中制备的硫酸铵溶液中并混合均匀，含虾青素的低分子有机溶液与硫酸铵溶液的比例设置为3:4，形成一定双水相，整个双水相体系中，加入的硫酸铵的质量百分比为10％，加入的亲水性低分子有机物在整个双水相体系中质量分数为30％％，搅拌均匀后静置分相0.5h，虾青素形成沉淀在两相的界面上，将上相快速移出，将中相及下相在冷冻离心机中12000r/min离心20min，离心后，将上清液移出，保留沉淀；
步骤六：向离心管中注入蒸馏水震荡，再放入冷冻离心机中12000r/min离心20min，收集离心的虾青素，低温干燥后保存。
本实施例中制备的虾青素纯度高，内部杂质残留量少，生产效率高，生产成本低，另外本实施例中对制备工艺进行了虾青素含量追踪测试，结果显示：生物原料虾青素有效萃取率为95％，虾青素收集率为86％，虾青素提取纯度高，能够适用于高效提取虾青素的生产。
实施例2：
本发明提供了一种应用双水相体系分离制备虾青素的方法，包括含有虾青素的生物原料、亲水性低分子有机溶剂、无机盐溶液和浓度为5％的HCl，具体操作步骤如下：
步骤一：收集虾蟹壳干品和鲜品等含有虾青素的生物原料及虾蟹等含虾青素的水产品相关产业生产的虾蟹壳等废料，冲洗干净表面杂质；
步骤二：将步骤一收集的原料干燥，使用浓度为5％的HCl浸泡1h脱钙，浸泡完成后用蒸馏水反复冲洗至中性，之后再次将原料干燥，干燥完成后使用粉碎机将干品粉碎，粉状原料颗粒大小为80目，备用；
步骤三：取20g无水硫酸铵溶于水，定容至100mL硫酸铵溶液；
步骤四：按比例在步骤二中制备的粉状原料中加入无水乙醇有机溶剂，粉状原料与无水乙醇有机溶剂的料液比设置为1：25，萃取温度设置为30，搅拌均匀，并放置在暗处静置1h，溶解虾青素，提取液离心去除不溶物，得到含虾青素的低分子有机溶液；
步骤五：按比例向滤液中加入步骤三中制备的硫酸铵溶液中并混合均匀，含虾青素的低分子有机溶液与硫酸铵溶液的比例设置为3:4.5，形成一定双水相，整个双水相体系中，加入的硫酸铵的质量百分比为15％，加入的亲水性低分子有机物在整个双水相体系中质量分数为50％，搅拌均匀后静置分相1h，虾青素形成沉淀在两相的界面上，将上相快速移出，将中相及下相在冷冻离心机中12000r/min离心20min，离心后，将上清液移出，保留沉淀；
步骤六：向离心管中注入蒸馏水震荡，再放入冷冻离心机中12000r/min离心20min，收集离心的虾青素，低温干燥后保存。
对比实施例1，本实施例中制备的虾青素纯度高，内部杂质残留量少，生产效率高，生产成本低，另外本实施例中对制备工艺进行了虾青素含量追踪测试，结果显示：生物原料虾青素有效萃取率为98％，虾青素收集率为90％，虾青素提取纯度高，能够适用于高效提取虾青素的生产。
实施例3：
本发明提供了一种应用双水相体系分离制备虾青素的方法，包括含有虾青素的生物原料、亲水性低分子有机溶剂、无机盐溶液和浓度为5％的HCl，具体操作步骤如下：
步骤一：收集虾蟹壳干品和鲜品等含有虾青素的生物原料及虾蟹等含虾青素的水产品相关产业生产的虾蟹壳等废料，冲洗干净表面杂质；
步骤二：将步骤一收集的原料干燥，使用浓度为5％的HCl浸泡1h脱钙，浸泡完成后用蒸馏水反复冲洗至中性，之后再次将原料干燥，干燥完成后使用粉碎机将干品粉碎，粉状原料颗粒大小为100目，备用；
步骤三：取20g无水硫酸铵溶于水，定容至100mL硫酸铵溶液；
步骤四：按比例在步骤二中制备的粉状原料中加入无水乙醇有机溶剂，粉状原料与无水乙醇有机溶剂的料液比设置为1：50，萃取温度设置为50℃，搅拌均匀，并放置在暗处静置2h，溶解虾青素，提取液离心去除不溶物，得到含虾青素的低分子有机溶液；
步骤五：按比例向滤液中加入步骤三中制备的硫酸铵溶液中并混合均匀，含虾青素的低分子有机溶液与硫酸铵溶液的比例设置为3:5，形成一定双水相，整个双水相体系中，加入的硫酸铵的质量百分比为20％，加入的亲水性低分子有机物在整个双水相体系中质量分数为70％，搅拌均匀后静置分相2h，虾青素形成沉淀在两相的界面上，将上相快速移出，将中相及下相在冷冻离心机中12000r/min离心20min，离心后，将上清液移出，保留沉淀；
步骤六：向离心管中注入蒸馏水震荡，再放入冷冻离心机中12000r/min离心20min，收集离心的虾青素，低温干燥后保存。
对比实施例1和2，本实施例中制备的虾青素纯度高，内部杂质残留量少，生产效率高，生产成本低，另外本实施例中对制备工艺进行了虾青素含量追踪测试，结果显示：生物原料虾青素有效萃取率为97％，虾青素收集率为88％，虾青素提取纯度高，能够适用于高效提取虾青素的生产。
实施例4：
步骤一：收集雨生红球藻和红发夫酵母菌，干燥后破碎成粉末状；
步骤二：按料液比1：24加入雨生红球藻粉末和红发夫酵母菌与无水乙醇萃取反应，机械破壁处理30min，暗处静置2h形成含虾青素的溶液，然后离心，去除残渣；
步骤三：取20g硫酸铵用水定容至100mL；
步骤四：将上述硫酸铵溶液和含虾青素的无水乙醇溶液按4.5：3的比例混合，暗处静置1h，虾青素形成沉淀，去除上相，12000r/min离心20min，收集虾青素。
对比实施例1-3，本实施例中制备的虾青素纯度高，内部杂质残留量少，生产效率高，生产成本低，另外本实施例中对制备工艺进行了虾青素含量追踪测试，结果显示：生物原料虾青素有效萃取率为96％，虾青素收集率为85％，虾青素提取纯度高，能够适用于高效提取虾青素的生产。
根据实施例1-3得出下表：
由上表可知，实施例2中原材料比例适中，加工温度适中，加工时间适宜，能够最大程度的提取高纯度的虾青素，使用含有虾青素的生物原料及虾蟹等含虾青素的水产品相关产业生产的虾蟹壳等废料，能够废物利用，降低生产成本，总体而言，虾蟹壳干品和鲜品等含有虾青素的生物原料及虾蟹等含虾青素的水产品相关产业生产的虾蟹壳等废料内的虾青素含量高于雨生红球藻和红发夫酵母菌内虾青素含量，通过本工艺可以快速使虾青素从溶液中分离出来，制备的虾青素样品具有纯度高，结构破坏小等优点，对虾青素原料中虾青素产品的研究和开发都有一定的应用价值。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。